Az elválasztás utáni étrend befolyásolja a széklet mikrobiális összetételét, de a kiválasztott zsírgén-expressziót a macskában (Felis catus)

Társadalmi élelmiszer-táplálkozás és egészségügy, AgResearch Grasslands, Palmerston North, Új-Zéland

Állattáplálkozás és egészségügy, AgResearch Grasslands, Palmerston North, Új-Zéland

Társadalmi élelmiszer-táplálkozás és egészségügy, AgResearch Grasslands, Palmerston North, Új-Zéland

Táplálkozástudományi tagozat, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, Illinois, Amerikai Egyesült Államok

Táplálkozástudományi tagozat, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, Illinois, Amerikai Egyesült Államok, Állattudományi Tanszék, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, Illinois, Amerikai Egyesült Államok

Élelmiszer-táplálkozás és egészségügy, AgResearch Grasslands, Észak-Palmerston, Új-Zéland, The Riddet Institute, Massey Egyetem, North Palmerston, Új-Zéland

Masszív Táplálkozási Központ, Élelmiszer-, Táplálkozási és Emberi Egészségügyi Intézet, Massey Egyetem, Észak-Palmerston, Új-Zéland

Emma N. Bermingham,
Sandra Kittelmann,
Wayne Young,
Katherine R. Kerr,
Kelly S. Swanson,
Nicole C. Roy,
David G. Thomas

Ábrák

Absztrakt

Macskában vizsgálták a pre- (azaz a terhesség és a laktáció ideje alatt) és az elválasztás utáni étrend hatását a széklet baktériumközösségeinek összetételére és a kulcsgének glükóz- és inzulinútvonalakban történő expressziójára. A királynőket mérsékelt fehérje: zsír: szénhidrát aprított („Diet A”; 35: 20: 28% DM; n = 4) vagy magas fehérjetartalmú: zsír: szénhidrát konzerv („Diet B”; 45: 37: 2%) fenntartásával DM; n = 3) diéta a terhesség és a szoptatás ideje alatt. Az utódokat beágyazott formában (n = 5 kezelésenként) választották el ezekre a diétákra. Székletmintákat gyűjtöttek 8. és 17. életkorban. A székletből DNS-t izoláltunk, és a bakteriális 16S rRNS gén amplikonokat piroszekvenálással elemeztük. Az RNS-t kivontuk a vérből (18. hét) és a zsírszövetből, valamint a petefészek/herék szövetéből (24. hét), és az RT-qPCR alkalmazásával meghatároztuk a génexpressziós szinteket. Különbségek (P 1. táblázat. A kereskedelemben kapható amerikai takarmány-ellenőrzési tisztviselők szövetségének (AAFCO) takarmánytesztjei a háztartási rövid szőrű cicáknak (Felis catus) táplált takarmánytesztek.

Állatok és szállás. Nyolc dámát (3 nem rokon tomból tenyésztettek; átlagéletkor 5,3 ± 0,4 év) véletlenszerűen osztottak be a két étrend egyikébe (étrendenként n = 4). A királynők vagy A diétát, vagy B diétát ad libitumban kaptak a vizsgálat során (1. táblázat). Mindegyik királynőt egyetlen, nem rokon hímvel pározták, amelyet A vagy B diétával tápláltak. Miután a terhesség beigazolódott (kb. 7–8 hét a terhesség alatt), a királynőket különálló, többrétegű emészthetőség-ketrecekbe helyezték, amelyek felső részén fészkelődobozok voltak polc [23]. Egy héttel a születés előtt a székletmintát a székletürítéstől számított 15 percen belül összegyűjtötték, folyékony nitrogénben lefagyasztották, majd –85 ° C-on tárolták az elemzésig.

Összesen húsz cica született és lemértük a születéstől számított 24 órán belül (h), és minden második nap 2 hétig (hét), majd heti időközönként a vizsgálat végéig.

0-tól 4-ig minden cica kizárólag tejéből kapott tejet. Minden alom felét véletlenszerűen (nemenként) az A étrendre, felét a B diétára osztották, négy étrendi kezelési csoportot alkotva (A-A, A-B, B-B, B-A; 2. táblázat). 4 hetes korukban a cicákat fokozatosan elválasztották a szilárd tápláléktól, a megfelelő szilárd táplálékot és tejet egyaránt kapták 8. hétig, amikor a cicák teljesen elválasztottak. Az elválasztási folyamat során (4 héten felül) a cicákat csoportos elhelyezésben részesítették az elválasztás utáni étrend szerint étkezéshez és szocializációhoz, és csak a tejhez való visszatérés céljából tértek vissza gátjukhoz. 8 hetes korukra a cicákat kizárólag az elválasztás utáni étrendjüknek megfelelően helyezték el. Az étrend és a víz ad libitum volt naponta elérhető a normális növekedés érdekében (1. ábra).

Az adatokat átlag ± SEM értékként jelentjük.

Az elválasztás előtti étrendet a vemhesség, a laktáció és a korai elválasztás együttes hatásaként határozták meg, majd az elválasztás utáni szakaszként azt a pontot határozták meg, amikor a cica már nem kap anyatejet az anyjától.

Székletmintavétel és bakteriális 16S rRNS gének vonalkódos amplifikációjának előkészítése és amplikon gyűjtés. 8 és 17 hetes korukban a cicákat külön-külön 24 órán keresztül helyezték el, és a széklet 15 percen belül friss ürülékmintát gyűjtöttek, folyékony nitrogénben lefagyasztották és –85 ° C-on tárolták.

A szövet gén expressziója. 18 hetes korban vérmintát (0,5 ml) vettünk, és az RNS-t a Total RNS Minikit (Blood/cultured cells) felhasználásával extraháltuk a Geneaid®-től (DNature, Gisborne, NZ) a gyártó utasításai szerint. 24 hetes korban az ivartalanítás során petefészekszövetből (csak nőstények), hereszövetből (csak hímek) és hasi zsírszövetből (csak nőstények) vettünk mintát. A szövetmintákat jéghideg sóoldattal mossuk, majd egy éjszakán át RNAlater®-be merítjük, majd az elemzésig –20 ° C-on tároljuk. Az RNS-t hasi zsírból és reproduktív szövetekből extraháltuk RNeasy Plus Universal Mini Kit (QIAGEN Pty Ltd, VIC 3148, Ausztrália) felhasználásával, a gyártó utasításainak megfelelően.

Zsírsavszintáz (FASN), 1. glükóz transzporter (GLUT1) és 4. (GLUT4), inzulinreceptor (INSR), leptin (LEPT), hormonérzékeny lipáz (LIPE), szétkapcsolódó fehérje 2 (UCP2), inzulinreceptor 1. szubsztrát expressziója Az (IRS-1) és a 2 (IRS-2), a plazminogén aktivátor inhibitor-1 (PAI-1), a peroxiszóma proliferatív aktivált receptor-y (PPARG) értékeit vér- és szövetmintákban határoztuk meg RT-qPCR alkalmazásával, a korábban leírtak szerint [6], [14], [28], [29]. Röviden, a teljes RNS-t reverz átírással írtuk át Applied Biosystems nagy kapacitású RNS-cDNS készletek (Applied Biosystems Inc., Foster City, Kalifornia) és rt-qPCR segítségével Rotor-Gene 6000 termocikluson (Qiagen). A FASN, GLUT1, GLUT4, INSR, IRS1, IRS2, LEPT, LIPE, PAL-1, UCP2 és PPARG expresszióját normalizáltuk a GAPDH expressziójával szemben.

A Chao1 változatossági indexen alapuló ritkasággörbék (a szekvencia azonosságának 97% -os határértékénél) azt jelzik, hogy az A diétával etetett macskák (---; n = 3 macska) széklet baktériumközösségei kevésbé változatosak voltak, mint a B diétával etetett macskáké ( -; n = 4 macska). Az adatokat átlag ± SEM értékként jelentjük.

Az elválasztás előtti étrend hatása a cicák széklet baktérium közösségére

Az elválasztás előtti étrend nem befolyásolta a phyla arányát a cica székletében (4. táblázat), azonban egyes taxonok aránya megváltozott (5. táblázat). Az A diétával táplált anyák kiscicái a Solobacterium, a Peptococcaceae és a Clostridiales és a Clostridium bőséges növekedését mutatták (5. táblázat), valamint a Megamonas és Allisonella bőségének csökkenését (5. táblázat).

Az elválasztás utáni étrend formájának hatása a cicák széklet baktérium közösségének összetételére

A mintavétel korának nem volt hatása a mikrobiális populációkra (8 vagy 17 hét, az adatok nem láthatók), ezért a két periódus eredményeit összesítettük. A cicáknál a baktériumok populációjának sokféleségét az elválasztás utáni étrend befolyásolta (3. ábra). A súlyozott és súlyozatlan Unifrac filogenetikai távolságok főkoordinátanalízise (PCoA) azt mutatta, hogy az általános mikrobiota közösség szerkezete a legjobban hasonló volt az azonos elválasztás utáni étrenddel táplált utódok között, függetlenül az anya étrendjétől (4. és 5. ábra). A többváltozós elemzés azt mutatta, hogy az elválasztás utáni étrendnek jelentős hatása volt a közösség összetételére (P 3. ábra. Az A vagy B diéta elválasztás előtti és utáni táplálásának hatása a cicák székletmikrobiális sokféleségére (Felis catus).

A Chao1 változatossági indexen alapuló ritkasággörbék (a szekvencia azonosságának 97% -os cut-off értékénél) azt jelzik, hogy a B diétával táplált cicák (AB és BB; n = 10) bélsár baktériumközösségei változatosabbak voltak, mint az A diétával tápláltak (AA és BA), n = 10). Az elválasztás előtti étrend nem volt hatással a cica közösségi sokféleségére. Az adatokat átlag ± SEM értékként jelentjük.

Az egyes komponensek által rögzített variációk százalékos aránya a tengelyeken feltüntetve.

A sejt színe jelzi a korreláció erősségét és irányát, a kék jelöli a maximális negatív korrelációt és a piros a maximális pozitív korrelációt.

Vita

Feltételeztük, hogy az elválasztás előtti étrend jelentősen befolyásolja a cica székletének mikrobiotájának összetételét. Ez a tanulmány azt mutatja, hogy a vemhes királynők nagy székletmikrobiális változatossága ellenére az elválasztás előtti étrend nem volt hatással az utódok székletmikrobiota-összetételére, de az elválasztás előtti étrend megváltoztatta a vér és a zsírszövetek génexpressziós szintjét. Ez azt sugallja, hogy az anya hosszú távú hatással van a génexpresszióra, míg a mikrobiális populációkra gyakorolt hatása viszonylag rövid távú lehet, annak ellenére, hogy az egyén életében viszonylag stabilak [7], [10].

A rágcsálókon végzett korábbi vizsgálatok szerint az elválasztás előtti étrend hatással van az utódok mikrobiotájára, különösen a korai életkorban [21], [32]. A jelenlegi, a következő generációs szekvenálást használó tanulmány megállapította, hogy az elválasztás előtti étrend kicsi hatást gyakorolt a cicák bélrendszerében található mikrobiota összetételére, az elválasztás utáni étrendnek nagy szerepe van a széklet mikrobiota összetételének befolyásolásában. Ezt bizonyítja a phyla megoszlásának nagy különbségei a terhes királynők és utódaik között. A jelenlegi vizsgálatban az elválasztás előtti időszak magában foglalta a vemhességet és a laktációt, valamint az utódoknak a tejből a szilárd táplálékba való átmenetét. Az elválasztott utódokat ezért az anyjuk tejének és az elválasztás utáni étrendnek tették ki. A tej baktériumfaji összetételét mind kultúrától függő, mind független módszerek segítségével határozták meg (Cookson, publikálatlan adatok), és a fajok sokféleségének növekedését javasolta az A. diétával etetett macskák tejében. Ennek ellenére a bél mikrobiális összetételében nem sok változást tapasztaltunk az elválasztás előtti étrendhez. Ezzel szemben az elválasztás utáni étrendnek nagy hatása volt az elemzett cicák széklet mikrobiotájára.

Diétával etetett cicák Az elválasztás után megnövekedett a Firmicutes és Actinobacteriumok száma, és csökkent a Fusobacteriumok száma a B Dieta elválasztás után táplált cicákhoz képest, összhangban a hasonló táplálékkal etetett felnőtt macskákban megfigyelt eredményekkel [9] és a tanulmányban szereplő királynőkkel. Az egészséges emlősökben élő mikrobákat vizsgáló vizsgálatok többsége a Firmicutes-t és a Bacteroidetes-t azonosította a béltraktusokban jelen lévő domináns baktérium-populációként. Vizsgálatunk megerősíti ezeket az eredményeket. Azonban a tanulmányban kimutatott túlsúlyos phyla, a Firmicutes és a Bacteroidetes különbözött a korábban megfigyeltektől [32], akik a Firmicutes és Actinobacteriumokat jelentették a két leggyakoribb phylaként.

Az Actinobacteriumok csökkent bőséget mutattak az elválasztás utáni B-diétával etetett cicákban. Az Actinobacteriumok közé tartoznak a Bifidobacterium nemzetség és a Coriobacteriaceae család tagjai. Mindkét taxon javuló egészséggel jár együtt a rágcsáló modellekben. Például a bifidobaktériumokról úgy gondolják, hogy javítják a bél egészségét [33], míg a Coriobacteriaceae a rágcsálók vércukorszintjének és koleszterinszintjének csökkenésével jár együtt [34], [35]. A mostani tanulmányban a Collinsella szignifikánsan csökkent a B diétával etetett cicákban. A csökkent C. aerofaciens alacsony szénhidráttartalmú étrenddel társult emberi alanyokban [36]. Az Actinobacteriumok teljes aránya a jelenlegi vizsgálatban (átlagosan 0,6%) jóval alacsonyabb volt, mint korábban a hasonló táplálékkal etetett cicák (28,5%) [32] és felnőtt macskák (16%) [9]) esetében. Bifidobaktériumokat nem fedeztünk fel tanulmányunkban, ellentétben egy korábbi vizsgálattal, amely magas fehérjetartalmú (52% DM) étrenddel ellátott cicák székletmikrobiómáját vizsgálta [32]. Jelen vizsgálatunk eredményei összhangban vannak laboratóriumunk korábbi kutatásával, felnőtt macskák felhasználásával [9], de eltérnek a korábbi tanulmányoktól [32], valószínűleg az analitikai módszerek különbségei miatt (alapozó kialakítása stb.).

A bakteroidéták mind a fehérje, mind a CHO emésztésével társulnak [37]. A jelenlegi tanulmányban nem volt különbség az étrenddel összefüggő Bacteroidetes tagok számában; ez egyezik a hasonló táplálékkal etetett felnőtt macskák eredményeivel [9]. A Bacteroidetes-en belül a Bacteroides-tartalom nagyobb volt az elválasztás utáni B-diétás étrenddel etetett cicáknál. A mostani tanulmányban a Bacteroides-tartalom nagyobb volt a B-diéta elválasztását követő etetett cicákban is. Ez ellentétben áll a felnőtt macskák eredményeivel, amelyek a hasonló étrendhez kapcsolódó Bacteroides csökkenést mutattak [9]. A jelenlegi vizsgálatban a bakteroidé arányok magasabbak voltak (kb. 20%), mint a közepesen vagy magas fehérjetartalmú kiscicáknál korábban megfigyelt arány: szénhidráttartalmú száraz étrend (0,2% [32]).

A B táplálékkal etetett cicáknál alacsonyabb volt a Firmicutes mennyisége, mint az A diétával táplált cicákban. A Firmicutes mennyisége az A diétával etetett cicákban hasonló volt az elválasztás utáni kiscicákéhoz, mint az azonos korú, száraz, mérsékelt fehérjét tápláló cicáknál: CHO diéta [32] ]. A Firmicutes törzsön belül a diéták között nagy eltolódásokat figyeltek meg a Lactobacillaceae (Lactobacillus), a Veillonellaceae (Megasphaera), a Peptostreptococcaceae (Unclassified Peptostreptococcaceae) és a Streptococcaceae (Streptococcus) között. A Lactobacillus populációk magasabbak voltak az A diétával táplált cicáknál, mint a B diétával etetett cicák. A A diéta esetén a Lactobacillusok növekedése összhangban áll az eredményekkel, amelyek szerint a cica száraz, mérsékelt fehérjével táplálkozik: CHO diétákkal [32] és felnőtt macskákkal, akiket száraz táplálékkal etettek [32] -hez hasonlóan, akik mérsékelt fehérjével társult megapera-fokozódást figyeltek meg: CHO diéta, Megasphaera spp. a jelenlegi vizsgálatban az A diétával etetett cicákban is nagyobb számban voltak. Lehetséges, hogy a Megasphaera megnövekedett aránya a Lactobacillus spp. megfigyelhető a jelenlegi tanulmányban. Ezzel szemben a Peptostreptococcaceae aránya magasabb volt a B diéta cicáinál, ami megegyezett a felnőtt macskák eredményével [9].

A fuzobaktériumok proteolitikus baktériumok [38], és egészséges macskák alacsony szintjén (a szekvenciák 0,3-5% -a) figyelhetők meg [32], [39], [40]. Magas fehérjetartalmú étrenddel társultak cicáknál [32], felnőtt macskáknál [9] és kutyáknál. A jelenlegi vizsgálatban a Fusobacterium rendbe tartozó filotípusok száma nagyobb volt a B diétával etetett cicáknál az elválasztást követő A diétával szemben (15, illetve 0,9%).

Összességében a proteinobaktériumok aránya nem különbözött az A vagy B diétával táplált cicák között, csak Sutterella spp. nőtt a B diétával etetett cicák elválasztása után. Korábbi kutatások kimutatták a száraz, magas fehérjetartalmú fehérjebetegségek megnövekedését: szénhidráttartalmú étrend cicáknál [32] és nedves táplálkozás felnőtt macskáknál [9]. A jelenlegi vizsgálat fehérje szintje hasonló volt (35% vs. 45% az A és B étrendben), mint a felnőtt macskáknak táplált szint (32–42%) [9].

Összefoglalva, a tanulmány megállapította, hogy míg az elválasztás előtti étrend szerepet játszik a génexpressziós szintek megváltoztatásában, az utódok széklet baktériumprofiljaira csekély hatással van. Ezzel szemben, míg az elválasztás utáni étrend formátumának nincs hatása az utódok génexpressziós szintjére, kritikus szerepet játszik a bélsár baktériumok összetételében. Hogy ez miért fordulhat elő, érdekes lehet a jövőbeli kutatások szempontjából. Kapcsolatok vannak a bél mikrobiota profiljai és a glükóz- és inzulinutakban részt vevő gének között, és ezek szerepet játszhatnak a hosszú távú egészségben.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők elismerik Karin Weidgraaf és Margreet Hekman (mindkét Massey Egyetem) és Bruce Sinclair (AgResearch) segítségét a tanulmány során.

Szerző közreműködései

A kísérletek megtervezése és megtervezése: ENB NCR DGT. Végezte a kísérleteket: ENB DGT. Elemezte az adatokat: WY SK KRK. Hozzájáruló reagensek/anyagok/elemző eszközök: WY SK KSS. Írta az írást: ENB WY SK KRK NCR KSS DGT. Megszerezte a finanszírozást, és megtervezte és elvégezte az állatkísérleteket: ENB NCR DGT. Tervezte és végezte a vizsgálat laboratóriumi komponensét: ENB WY SK KRK.