Az epigallocatechin-3-gallát csökkenti a zsír felhalmozódását a Caenorhabditis elegans-ban

Absztrakt

Az epigallocatechin-gallát (EGCG) egy polifenol, amely bővelkedik a zöld teában. Beszámoltak arról, hogy az EGCG fogyasztása hozzájárulhat a fogyáshoz, azonban a mögöttes mechanizmus nem teljesen ismert. Annak megállapításához, hogy az EGCG hogyan csökkenti a testzsírt, egy Caenorhabditis elegans organizmusmodellt alkalmaztunk, amely hasznos állati modellrendszer az emberek számára könnyen alkalmazható döntő biológiai mechanizmusok feltárásában. Ebben a vizsgálatban két napon keresztül különböző törzseket növesztettünk Escherichia coli OP 50 diétával 100 μM és 200 μM EGCG kezeléssel vagy anélkül. A jelenlegi eredmények azt mutatták, hogy 100 μM és 200 μM EGCG 10% -kal és 20% -kal jelentősen csökkentette a vad típusú férgek triglicerid-tartalmát (P-érték Kulcsszavak: Caenorhabditis elegans, EGCG, zsírfelhalmozódás, lipid anyagcsere

zsír

BEVEZETÉS

A zöld tea népszerű ital, magas flavonoidtartalommal (természetes polifenol), és ismert, hogy számos kívánatos egészségügyi előnye van, például karcinogén, gyulladáscsökkentő és antioxidáns hatású (1). Az epigallokatechin-3-gallát (EGCG) a zöld tea leggyakoribb katechinje, amelyről feltételezik, hogy felelős a zöld tea ezen bioaktivitásáért (2). Beszámoltak arról, hogy az EGCG zsírcsökkentő hatással bír az energia bevitelének gátlásával az étrend által kiváltott elhízott egerekben (3,4), gátolja a lipogenezist in vitro (5,6), gátolja az α-amiláz aktivitást in vitro (7), gátolja a lipid emésztést felszívódás nagy zsírtartalmú egerekben (8), serkenti az energiafelhasználást in vivo (9), elősegíti a zsír oxidációját in vivo (10) és in vitro (11), és elősegíti a lipolízist (12,13).

A Caenorhabditis elegans-t rövid élettartamuk miatt széles körben alkalmazták a biológiai és orvosi vizsgálatokban

20 nap, 3 napos szaporodási ciklus, és nagy megtermékenyítés, körülbelül 300 petesejt önmegtermékenyítéssel (14). Ezenkívül konzerválja az emberi betegségekhez kapcsolódó gének 65% -át (15), beleértve a lipid-anyagcserével kapcsolatosakat is, ami nagyszerű in vivo modellt jelent a sejtes és genetikai vizsgálatokhoz. A C. elegans-ban korábban kimutatták, hogy az EGCG antioxidáns aktivitást mutat (16), csökkenti a stresszel kapcsolatos válaszokat (17) és meghosszabbítja a hosszú élettartamot (18). Az EGCG-ről azonban nincs jelentés a C. elegans zsírcsökkentő hatásáról. Ezért ennek a tanulmánynak azt kellett megvizsgálnia, hogy az EGCG szerepet játszhat-e a C. elegans zsírtartalmának csökkentésében.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Anyagok

Az ebben a vizsgálatban használt C. elegans törzseket és Escherichia coli OP50-t a Caenorhabditis Genetikai Központtól (CGC, Minnesotai Egyetem, Minneapolis, MN, USA) szereztük be, beleértve az N2-t, sörtés (vad típusú); CE541, sbp-1 (ep79) III; RB754, aak-2 (ok524) X; RB1716, nhr-49 (ok2165) I; BX107, zsír-5 (tm420) V; BX106, zsír-6 (tm331) IV; BX153, zsír-7 (wa36) V; RB1600, kád-1 (ok1972) II; GR1307, daf-16 (mgdf50); OP50 és OP50-zöld fluoreszcens fehérje (GFP) E. coli. Az EGCG-t (tisztaság> 99%) és az Infinity ™ triglicerid-reagenseket a Fisher Scientific-től (Pittsburgh, PA, USA) szereztük be. A Coomassie Plus Protein Assay Reagent-et a Thermo Fisher Scientific-től (Middletown, VA, USA) szereztük be. Az 5-fluor-2’-dezoxiuridint (FUdR) a Sigma-Aldrich Co.-tól (St. Louis, MO, USA) vásároltuk. Háztartási fehérítőt (The Clorox Company, Oakland, Kalifornia, USA) használtak a férgek fehérítésére az L1 férgek szinkronizálásakor.

EGCG oldat és féregtenyészet előkészítése

Az EGCG-t sterilizált vízben oldjuk, és felhasználás előtt 0,22 μm átmérőjű membránon szűrjük. Korábban arról számoltak be, hogy 200

400 μM EGCG volt az optimális koncentráció az élettartam növelésére C. elegans-ban (19), ezért 100 μM és 200 μM EGCG-t választottunk kezelési csoportként a C. elegans zsírcsökkentő hatásainak tanulmányozására.

M9 puffert, S-teljes és fonálféreg-tenyésztő táptalaj (NGM) agart használtunk a C. elegans kultúrákban (20). A szinkronizálás után az összes L1 férget 25 ° C-on emeltük S-teljes táptalajban, kiegészítve E. coli OP50-vel, és 2 napig EGCG-vel vagy anélkül kezeltük.

Triglicerid mennyiségi meghatározása

2 napos EGCG-kezelés után a C. elegans-t összegyűjtöttük és kétszer vízzel mostuk az E. coli és az EGCG eltávolításához. A C. elegans mintákat 0,05% Tween 20 oldatban oldottuk. Szonikálás után a mintákat használtuk a triglicerid (TG) és a fehérje mérésére. A TG-vizsgálatot az Infinity ™ triglicerid-reagenssel hajtottuk végre, a fehérjetartalmat pedig a Coomassie Plus Protein Assay-reagenssel (21) mértük. A TG-tartalmat ezután fehérjekoncentrációkkal normalizálták.

Növekedési sebesség, testméret, mozgás és táplálékfelvétel mérése

A kétnapos kezelés után a fonálférgeket új agarlemezekre helyeztük a növekedési sebesség mérésére. Minden kezelési csoport esetében,

50 férget véletlenszerűen választottunk ki és bénítottunk meg 10 mM NaN3 alkalmazásával (22,23). A férgek számát a különböző szakaszokban optikai mikroszkóp alatt számláltuk (Olympus Corporation, Tokió, Japán).

A kétnapos kezelés után a fonálférgeket új lemezekre vitték friss E. coli OP50-vel a testméret és a mozgás mérésére (22). A Wormlab nyomkövető rendszer (WormLab szoftver 3.1.0.0 verzió, MicroBrightField Inc., Williston, VT, USA) segítségével 30 másodperces videofelvételt készítettek és használták fel a férgek hosszára, szélességére és mozgási sebességére.

A fonálférgek táplálékfelvételének monitorozásához az életkorral szinkronizált N2 fonálférgeket tenyésztették E. coli OP50-GFP baktérium gyepeken NGM lemezeken EGCG-vel vagy anélkül (24). 2 napos kezelés után a fonálférgeket kétszer vízzel mossuk, helyezzük és rögzítjük a tárgylemezeken, amelyeket friss 5% -os agar betétekkel állítunk elő, majd fluoreszcens mikroszkóp alatt láthatóvá tesszük. Az integrált sűrűséget az Image J szoftver (U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) segítségével számszerűsítettük az átlagos pixelintenzitás meghatározásával. A szivattyúzási sebességet úgy is mértük, hogy megszámoltuk a C. elegans garatizmok összehúzódásának sebességét az optikai mikroszkóp alatt (25).

mRNS expressziós elemzés

A teljes RNS-t extraháltuk C. elegans-ból a TRIzol® reagenssel, RNáz-mentes körülmények között (22, 23). A teljes RNS-t reverz átírással cDNS-be írtuk át nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet alkalmazásával (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA). A valós idejű polimeráz láncreakciót (PCR) egy StepOne Plus valós idejű PCR rendszeren (Applied Biosystems) hajtottuk végre. Cebp-2-t (Ce02421574_g1), hosl-1-et (Ce02494529_m1), atgl-1 (Ce02406733_g1), mdt-15 (Ce02406575_g1), pod-2-t (Ce02427721_g1) és acs-2 gént (CeMag) használtunk. . A küszöbértékeket összehasonlító CT módszerrel elemeztük. Belső standardként az RNA polimeráz II nagy alma-ama-1 gént (Ce02462726_m1) használtuk.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± standard hibák (SE) formájában fejezzük ki. Az összes adat statisztikai elemzését a Statisztikai elemző rendszer (SAS 9.4 verzió, SAS Institute, Cary, NC, USA) végezte. A 2B., 3A., 3A., 4., 4. és 5. ábra ábráinak adatait egyirányú ANOVA-val elemeztük. Az 1. ábra adatai, 2A, 2A és 3B

A D-t kétirányú ANOVA-val elemeztük (kezelés és kísérlet). A kezelés és a kísérlet között nem találtak kölcsönhatást az összes adat. Tukey többszörös összehasonlító tesztjét használták a kezelési hatások meghatározására. A különbségeket a P 1. ábrán határoztuk meg. A szivattyúzási sebesség egy mechanikus mozgás, amely a táplálékfelvételt jelenti a C. elegans-ban (25). Az EGCG 2 napos kezelése nem volt hatással a vad típusú fonálférgek szivattyúzási sebességére (2A. Ábra). Újabb kísérletet hajtottunk végre az élelmiszer-bevitel mérésére E. coli OP50-GFP alkalmazásával. A fluoreszcens intenzitás elemzése (2B. Ábra) azt mutatta, hogy nincs szignifikáns különbség a kezelési és a kontroll csoport között, ami összhangban van a szivattyúzási sebességgel. Az E. coli OP50-GFP-vel táplált C. elegans reprezentatív képeit a 2C. Ábra mutatja. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy az EGCG nem befolyásolta a C. elegans táplálékfelvételét.

Az EGCG nem volt hatással a növekedésre és a fejlődésre

Az EGCG kezelése 100 μM és 200 μM mellett sem mutatott szignifikáns hatást a növekedési sebességre (3A. Ábra), a testhosszra (3B. Ábra) és a mozdony aktivitására (3D. Ábra). Míg 200 μM-nál a férgek testszélessége csökkent a kontrollhoz képest (3C. Ábra), ennek oka lehet az 1. ábrán megfigyelt csökkent testzsír. Összességében ezek az adatok azt jelezték, hogy az EGCG nincs hatással a növekedésre, a testhosszra vagy a mozdony tevékenységeire, de jelentős hatással van a test szélességére nagyobb koncentráció esetén a C. elegans-ban.

Az EGCG potencírozott lipolízis

Ezután különböző mutáns törzseket ismert, amelyek kapcsolódnak a lipid anyagcseréhez, köztük az sbp-1-et (amely a szterin-válasz elemet megkötő fehérje ortológusát kódolja), az nhr-49-et (a nukleáris hormon receptorát kódolja és a peroxisome proliferátor-aktivált receptorainak funkcionális ortológusát). ), aak-2 (az AMP-aktivált protein kináz két homológjának egyikét kódolja), a tub-1 (a TUBBY homológját kódolja), a zsír-5, 6 és 7 (endodáló delta 9 deszaturáz homológok) és a daf- 16 (a Forkhead box O transzkripciós faktor homológját kódolja). Jelentős különbségeket figyeltünk meg a kontroll és az EGCG kezelési csoportok TG szintje között ezekben a törzsekben, ami arra utal, hogy az EGCG által végzett zsírcsökkentés hatása független volt az sbp-1, nhr-49, aak-2, tub-1, zsír-5, fat-6, fat-7 és daf-16 C. elegans-ban (4. ábra).

Meghatároztuk továbbá a vad típusú C. elegans lipidanyagcseréjében szerepet játszó gének expresszióját, beleértve a cebp-2-et (amely a CCAAT/enhancer-kötő fehérje homológját kódolja), az acs-2-t (az acil-CoA szintetáz homológját kódolja), mdt-15 (a mediátor komplex 15. alegység homológja), pod-2 (az a-acetil-CoA karboxiláz homológját kódolja), hosl-1 (a hormonérzékeny lipáz homológját kódolja) és az atgl-1 (egy homológot kódol) a zsír-triglicerid lipáz). Az EGCG szignifikánsan csökkentette az atgl-1 és az acs-2 expresszióját mind a 100, mind a 200 μM-en a kontrollhoz képest, míg más gének nem mutattak különbséget (5. ábra). Ezek az adatok azt jelezték, hogy az EGCG zsírcsökkentő hatása C. elegans-ban az acs-2-től és az atgl-1-től függhet.

VITA

Jelen tanulmányban az EGCG (100 μM és 200 μM) dózisfüggő módon jelentősen csökkentette a zsír felhalmozódását vad típusú férgekben anélkül, hogy megváltoztatta volna az élelmiszer-bevitelt, a növekedési sebességet, a féreg méretét vagy a mozdony aktivitását. Ez összhangban áll a korábbi jelentésekkel, miszerint az EGCG-kezelések csökkenthetik a zsír felhalmozódását a magas zsírtartalmú táplált patkányokban (26), és hogy a 100 μM EGCG csökkentette a 3T3-L1 preadipocyták lipidfelhalmozódását (6). A jelenlegi eredmények azt is jelzik, hogy az EGCG nem befolyásolja az energiafogyasztást vagy a fizikai aktivitást (az energiafogyasztás részeként), ami arra utal, hogy metabolikusan részt vesz a zsír csökkentésében.

Korábban beszámoltak arról, hogy a zöld tea katechinek csökkenthetik a lipogenezist azáltal, hogy gátolják a lipogén enzimek aktivitását és/vagy expresszióját rágcsálókban. állatok (27). Ezenkívül az EGCG az AMP-aktivált protein-kináz in vitro aktiválásával csökkentette a zsírraktározást (28). A jelenlegi eredmények azonban azt sugallják, hogy az EGCG nem képes a zsír-5, zsír-6, zsír-7, sbp-1, nhr-49, daf-16 vagy aak-2 révén csökkenteni a zsírokat C. elegans-ban. Mivel nem határoztuk meg az EGCG szerepét a FAS-ban, lehetséges, hogy az EGCG további lipogén enzimekkel, például zsírsav-elongázzal és 3-ketoacil-CoA-reduktázzal (LET-767) együtt FAS-on keresztül is működhet (29). Alternatív megoldásként a zöld tea más katechinjei, köztük az epikatechin, az epigallokatechin és az epikatechin-3-gallát (30), hozzájárulhatnak a zsírtartalom csökkenéséhez, nem az EGCG-hez.

Tho és Wolfram (4) arról számoltak be, hogy az étrendi EGCG elősegítette a zsír oxidációját egerekben. Továbbá, egy tanulmány túlsúlyos/elhízott férfiaknál kimutatta, hogy az EGCG önmagában képes elősegíteni a zsír oxidációját, és ezáltal elhízás elleni hatást eredményezhet (10). A C. elegans-ban az acs-2 acil-CoA szintetázt kódol, amely katalizálja a zsírsav átalakulását acil-CoA-vá az ezt követő oxidációhoz (31). A jelenlegi eredmény azonban azt sugallja, hogy az EGCG csökkentette az acs-2 expresszióját a vad típusú fonálférgekben, ami azt jelzi, hogy az EGCG gátolhatja a zsír oxidációját, bár a C. elegans-ban még mindig csökkent a teljes zsírfelhalmozódás. Hasonló eltérésekről korábban beszámoltak, hogy az alacsony zsírtartalmú fenotípusok az acs-2 transzkripció kompenzációs elnyomásához vezethetnek a további energiafelhasználás megakadályozása érdekében (32). Így arra a következtetésre jutottunk, hogy az acs-2 csökkent expressziója az EGCG által ebben a modellben nincs jelentőséggel a teljes testzsírra gyakorolt ​​hatásában. Alternatív megoldásként lehetséges, hogy a többi mechanizmus, például az acs-2 transzláció utáni szabályozása (33) felelős az EGCG zsírcsökkentő hatásáért. Lehet, hogy ezt és más mechanizmusokat tovább kell vizsgálni.

Egyre több bizonyíték van arra, hogy az EGCG fokozhatja a 3T3-L1 adipociták lipolitikus aktivitását (13). Söhle és mtsai. (12) arról számoltak be, hogy az EGCG nem járult hozzá a fehér tea kivonatnak az emberi szubkután adipociták lipolízisére gyakorolt ​​stimuláló hatásához. A vitatott állítások tehát arra utalnak, hogy az EGCG következetlen hatással van a lipolízisre. Az ATGL egy zsír-triglicerid lipáz, amely felelős a lipolízisért (34). A jelenlegi eredmények azt mutatták, hogy az EGCG csökkentette az atgl-1 expresszióját vad típusú fonálférgekben, ami arra utal, hogy az EGCG gátolja a C. elegans lipolízisét. Azonban a lipolízis markerjeként történő felhasználás mellett az ATGL-t az adipogenezis markerként is használják, mivel érett adipocitákban továbbra is erősen expresszálódik (35). Így az atgl-1 expressziójának csökkentése EGCG-vel inkább az adipogenezis gátlását sugallhatja, mint csökkent lipolízist. Ez összhangban áll a Hwang és munkatársai által végzett in vitro vizsgálatokkal. (6) és Moon és mtsai. (28) Összességében a jelenlegi eredmények nem lennének elegendők az EGCG zsírcsökkentő hatásainak lehetséges mechanizmusainak meghatározásához, ezért további kutatásokra van szükség az acs-2 és az atgl-1 hatásainak transzláció utáni szintű vizsgálatához.

Összefoglalva, a jelenlegi eredmények arra a következtetésre jutottak, hogy az EGCG hatása a C. elegans zsírcsökkentésére az atgl-1-től és az acs-2-től függ. Az EGCG gátolhatja az adipogenezist a C. elegans zsírtartalmának csökkentése érdekében, amint azt az EGCG-kezelés utáni csökkent atgl-1 génexpressziós szint is mutatja. Így az EGCG étrend-kiegészítőként történő fogyasztása potenciálisan szabályozhatja a test zsírtartalmát.