Az étkezési búza csökkentése csökkenti a vizelet dezoxinivalenol szintjét az Egyesült Királyságban élő felnőtteknél

Absztrakt

Állatoknál a dezoxinivalenol (DON) hányást, takarmány elutasítását, növekedési retardációt okoz, és befolyásolja az immunrendszert. A DON a búza gyakori szennyezője, azonban hitelesített biomarker-adatokkal kell értékelni az expozíciót egyéni szinten, ezért hiányoznak a kapcsolódó egészségügyi hatások. A vizelet DON-jának rendkívül robusztus vizsgálatának kidolgozása, amely magában foglalja az immunoaffinitás (IAC) tisztítását és a folyadékkromatográfia (LC) tömegspektrometrikus (MS) detektálását, lehetővé tette (1) DON-expozíció értékelését az Egyesült Királyságban és (2) egy búza beviteli beavatkozás a vizelet DON szintjén. 25 egyesült királyságbeli (21–59 éves) önkéntes töltötte ki a félig lemért étkezési naplókat az 1. és a 2. napon (normál étrend), a 3. napon pedig reggeli vizeletmintát szolgáltattak., az egyének korlátozták a búzafogyasztás fő forrásait az étrendi útmutatás nyomán. A naplókat az 5. és a 6. napon töltöttük ki, és a 7. napon további reggeli vizeletet adtunk. A vizelet DON-ját az IAC tisztítását és az LC – MS elemzését követően mértük. A búza alapú táplálékbevitel (átlag 322 g/nap, tartomány: 131–542 g/nap) szignifikánsan (P

Bevezetés

Mód

Dizájnt tanulni

A vizsgálat egy 7 napos időszakban zajlott, és 25 önkéntes, 16 nő és 9 férfi vett részt 21–59 éves korban. Az 1. és a 2. napon („normál étrend”) félig lemért étkezési naplókat vezettek, a 3. napon pedig egy első reggeli üreges vizeletmintát nyertek. A 3–6. Napon („csökkentett búzaintervenció”) arra kérték az önkénteseket, hogy korlátozzák az esetlegesen búzát tartalmazó élelmiszerek (kenyér, sütemények, tészták, reggeliző gabonafélék stb.) Bevitelét, és helyettesítsék azokat egy listán szereplő cikkekkel a javasolt alternatívák közül (pl. rizs, burgonya). Az 5. és 6. napon ismét étkezési naplókat vezettek, és a 7. napon újabb első reggeli üreges vizeletmintát nyertek. A vizsgálat előtt minden önkéntestől tájékozott beleegyezést kaptak, és etikai jóváhagyást kaptak az NHS Kutatási Etikai Bizottságától, Bradford, Egyesült Királyság.

Élelmiszernaplók

Az étkezési naplókat teljesen kódolták egy házon belüli Microsoft Access alapú étrendi elemző csomag használatával, amely az Egyesült Királyságban található élelmiszerek összetételét használja (Holland et al., 1992). A beavatkozásnak való megfelelés értékelése érdekében összehasonlítottuk az egyes élelmiszercsoportok (kenyér, sütemények, reggeliző gabonafélék és tészta) fogyasztásának gyakoriságát a normál étrend alatt (1. és 2. nap) a beavatkozás során tapasztaltakkal (5. és 6. nap). Ezenkívül megbecsülték az egyes élelmiszerek súlyát, és meghatározták a búza alapú élelmiszerek bevitelét minden egyes egyed számára a fő búzaforrások (kenyér, reggeliző gabonafélék, tekercs, tészta, sütemények és kekszek) alapján. Egyéb búzaforrások előfordulnak az étrendben, például szószokban és sűrítőkben. A teljes búzabevitelhez való hozzájárulásuk azonban viszonylag csekély jelentőségű volt.

A vizelet kivonása DON

A teljes vizelet DON értékét Meky és mtsai módszerének módosításával mértük. (2003) és a 13 C-DON (Biopure Referenzsubstanzen, Tulln, Ausztria) alkalmazása IS-ként. Az IS túlnyomórészt 13 C15-DON-ot (molekulatömeg (Mr) 311; 81,4%), hanem 13 C14-DON (Mr 310; 16,8%). Nemrégiben megállapították ennek a vegyületnek az IS-nek való alkalmasságát a DON-szennyezett gabonafélék LC – MS/MS elemzésében (Haubl et al., 2006).

A vizelet elemzésében a mintákat centrifugáltuk (2000 g; 15 perc; 4 ° C) és 4 ml vizelethez adtunk IS-t, hogy 5 ng/ml végkoncentrációt kapjunk. Az egyes minták pH-ját 6,8-ra állítottuk, és 23 000 U értéket állítottunk be β-glükuronidáz (IX-A típus Escherichia coli; Sigma) 1 ml-ben 75 mM KH2PO4-et adunk hozzá, és rázóvízfürdőben inkubáljuk 18 órán át 37 ° C-on. Az emésztést követően a mintákat centrifugáltuk (2000 g; 15 perc; 4 ° C) és a felülúszót 16 ml-re hígítottuk PBS-sel (pH 7,2). A hígított anyagot DONtest immunoaffinitás oszlopokon (IAC) (Vicam, Watertown, MA, USA) engedtük át a DON kivonására a gyártó utasításainak megfelelően. A DON oszlopokat 4 ml metanollal eluáltuk, és az extraktumokat szárítottuk vákuumban Savant Speed Vac használatával és 250-ben feloldva μ1 10% (v/v) etanol analízishez. Az ismert DON-szinttel rendelkező vizeletminta két alikvot részét is kiegészítettük az IS-szel, és mindegyik vizsgálati minta-tétellel elemeztük minőségellenőrzésként (QC).

A kivont DON LC – MS elemzése

A DON-t HPLC-vel (Waters 2795 separations module, Milford, MA, USA) MS detektálással (Micromass Quattro Micro triple quadrupole tömegspektrométer, Manchester, Egyesült Királyság) elemeztük. A DON elválasztását egy Luna C18 oszloppal (150 × 4,6 mm, 5 μm részecskeméret (Phenomonex, Macclesfield, Egyesült Királyság). A mobil fázist 20% metanolban indítottuk be, és izokratikusan futtattuk 10 percig. Ezután 6 percig tartó mosási fázist hajtunk végre 75% metanol alkalmazásával, majd 20% metanolt vezetünk vissza a rendszer ezen a koncentráción történő további 11 percig történő kiegyensúlyozásával. Az áramlási sebesség 1 ml/perc, az injekció térfogata 25 volt μl. A HPLC-oszlopból származó eluens egyötödét az MS deszolvációs kamrájába irányítottuk, a maradékot pedig hulladékba juttattuk.

m/z (A) jelöletlen DON (200 ng/ml) standard és (b) IS (200 ng/ml) standard spektruma.

13,1 ng DON/ml vizeletet tartalmazó vizeletminta teljes ionáram-kromatogramja 13 C-DON belső standarddal kiegészítve. A H + (a) nyomot a 297,2 (DON) és 319,2 (DON) Na + DON monitorozó tömeg SIR-jével állítottuk elő; A (b) nyomot 333,2 (13 C14-DON Na +) és 334,2 (13 C15-DON Na +) 13 C-DON monitorozó tömeg SIR-jével generáltuk. Mindkét vegyület retenciós ideje 7,4 perc volt.

Kreatinin elemzés

A kreatinin-koncentrációt minden vizeletmintában Bayer klinikai módszerrel mértük ADVIA Chemistry Systems 1650 eszközön (Klinikai Biokémiai Tanszék, Leeds General Infirmary, Leeds, Egyesült Királyság). A végső DON koncentrációt ng/ml vizeletben a kreatinin adatok alapján állítottuk be, és ezt ng DON/mg kreatininban fejeztük ki.

Statisztikai analízis

Ahol a vizelet DON nem volt számszerűsíthető, vagyis a LOQ alatt minden elemzés során a LOQ és a nulla közötti középpont értéket alkalmazták. A vizelet DON koncentrációit az analízis előtt természetes log transzformációval láttuk el. A párosított adatok összehasonlítását Student's segítségével végeztük t-tesztet és regresszióanalízist alkalmaztak az életkor, a nem, az antropometria és az étkezés mennyiségének a DON vizeletszintjére gyakorolt hatásának vizsgálatára mind a normál fogyasztás, mind a búza redukciós beavatkozás során (STATA 7.0 változat használatával). Csak az intervenciós időszak alatt az egyéneket a fő búzaalapú táplálékfogyasztás és a vizelet DON szintjeinek fogyasztói és nem fogyasztói körébe sorolták a csoportok között, összehasonlítva a STATA regressziós elemzésével. A bemutatás megkönnyítése érdekében a vizelet DON adatait újra transzformálták, geometriai átlagokat és 95% konfidencia intervallumot (CI) használtak a táblázatokban.

Eredmények

A demográfiai vizsgálatok adatait az 1. táblázat tartalmazza. Több nő volt (n= 16), mint a férfiak (n= 9). A nők egyaránt alacsonyabbak voltak (P 1. táblázat Demográfiai adatok nemek szerint.

A vizsgálat 1. és 2. napja alatt a normál étrendet fogyasztották. A fő élelmiszercsoportokat, amelyekről előreláthatólag hozzájárulnak a DON-expozícióhoz (egyes reggeli gabonapelyhek, kenyér, keksz, sütemények és tészták), az Egyesült Királyság lakosságának korábban közölt mennyiségekkel megegyező mennyiségben fogyasztották (Henderson et al., 2002). Minden egyén e táplálékcsoportok közül legalább egyet fogyasztott naponta, és 25-ből 18 (72%) ebből a csoportból kettőt vagy többet fogyasztott naponta. Az általános kenyér volt a leggyakoribb búza alapú ételforrás, az 1. napon 25 személy közül 20-an fogyasztották, a 2. napon pedig 25-ből 22-t fogyasztottak (lásd a 2. táblázatot). Süteményeket és kekszeket 25-ből 16 és 25-ből 20 fogyasztott, reggelizőpelyhet és tésztát ritkábban fogyasztottak (2. táblázat).

A beavatkozást a 3. és a 6. nap között hajtották végre, és naplóinformációkat rögzítettünk a javasolt beavatkozásnak az 5. és a 6. napon való megfelelésének felmérése érdekében. Összességében jó volt a beszámolóknak való megfelelés a búzaalapú élelmiszerek fogyasztásának csökkentésére vonatkozó utasításokról. A búza alapú élelmiszerek fogyasztásának csökkenését mind a fogyasztás gyakorisága, mind az összes elfogyasztott mennyiség tekintetében a 2. táblázat részletezi. A beavatkozás során az 5. napon csak egy ember fogyasztott kenyeret, a 6. napon kettő. alapú reggeli müzlik vagy tésztafélék, míg három és hat személy süteményeket és kekszet fogyasztott az 5., illetve a 6. napon. Az egyes élelmiszercsoportokat fogyasztó egyedek számának csökkenése rendkívül jelentős volt, P 3. ábra

25 egyén számára párosított minták álltak rendelkezésre a vizelet dezoxinivalenoljának mérésére. A csíkos rudak azoknak szólnak, akik a szokásos étrendet fogyasztják, a szilárd fekete rudak pedig azoknak, akik a búzacsökkentő beavatkozás 4 napját követik. Tizenhat egyed esetében a beavatkozást követően vett minták a kimutatási határ alatt voltak.

A korlátozott egyedszám és a DON fő potenciális forrásainak viszonylag egyenletes fogyasztása a vizsgálat normál étrend szakaszában korlátozta az egyes élelmiszerek vizelet DON szintjéhez való hozzájárulásának mélyreható elemzését. A normál étrend időszakához viszonyítva a 25-ből 24 egyénnél csökkent a vizelet DON intervenciós szintje. Csak egy olyan személy volt, aki nem felelt meg a javasolt beavatkozásnak. A normál étrend szakaszában ez az egyén teljes kiőrlésű kenyeret (átlagosan 131 g/nap) fogyasztott fő búzaforrásként. Ennek a személynek a teljes kiőrlésű kenyér maradt a fő búzaforrás a beavatkozás során, az 5. és a 6. napon a bevitel valóban nőtt (átlagosan 154 g/nap). Ez a személy volt az az egyén, akinél a vizelet DON-szintje nőtt, a 3. napon 5,2 ng/mg-ról a 7. napon 12,6 ng/mg-ra. Összességében a normál étrend során elfogyasztott búza alapú ételek átlagos súlya (326 g; tartomány: 40–665 g és 299 g; tartomány: 0–523 g az 1., illetve a 2. napon) szignifikánsan alacsonyabb volt (P 3. táblázat A vizelet átlagos (95% CI) DON- és teljes búza-alapú táplálékfogyasztása a vizsgálat normál étrendje és búza-csökkentési intervenciós fázisai alatt.

Vita

A DON a búza, az árpa és a kukorica gabonanövényeinek általános szennyezője az egész világon, így Európában is (Bondy és Pestka, 2000; SCOOP, 2003). A pontos mechanizmusok, amelyek révén a DON káros hatásokat gyakorolhat az emberi egészségre, nem ismertek, de a toxin a riboszómákhoz tud kötődni, megzavarva a fehérjeszintézist, és emellett képes aktiválni a jelátviteli útvonalakban részt vevő fontos mitogén által aktivált protein kinázokat (Pestka és Smolinski, 2005 ). A gasztroenteritist, a növekedés megingását és az immunotoxicitást, valamint a fertőző betegségek iránti fogékonyság lehetséges növekedését javasolták, mint a DON emberi bevitelének valószínűbb hatásait (Pestka és Smolinski, 2005). Mindazonáltal a validált expozíciós biomarker hiánya mind a mai napig hátráltatta a DON-expozíció egészségre gyakorolt következményeinek megértését.

A mostani tanulmány egyedülálló abban, hogy az Egyesült Királyságban vizelet-biomarkerrel demonstrálja az embernek a DON-nak való gyakori expozícióját, valamint azt, hogy az expozíció jelentősen csökkenthető az étrendben lévő búza mennyiségének korlátozásával. Különösen a vizsgálatban részt vevő minden egyes személynél kimutatható volt a vizelet DON a szokásos étrend fogyasztása során. A sör előállításához felhasznált árpa és búza DON-szennyezése további expozíciós forrást jelenthet (Papadopoulou-Bouraoui et al., 2004), bár tanulmányunkban a sör nem volt része a beavatkozásnak. Ezenkívül a naplógyűjtés 4 napja alatt csak hat alkalommal fogyasztottak sört (az adatokat nem közöljük). Az elemzés a teljes vizelet DON, azaz a DON-glükuronidból felszabaduló szabad DON és DON mérését tartalmazta az enzimkezelést követően. Az analitikai megközelítés egyszerre érzékeny és specifikus, tisztítás nagyon szelektív antitest-affinitási oszloppal történik, amelyet reverz fázisú kromatográfia követ, majd ezt később MS-sel detektálunk. A 13 C-DON nemrégiben elérhető IS-ként tovább javította a vizsgálat megbízhatóságát.

A DON és metabolitjainak humán vizelettel történő kiválasztásának farmakokinetikáját nem igazolták. Úgy tűnik azonban, hogy a glükuronid sertésekben gyorsan képződik, és hasonló szérum clearance kinetikával rendelkezik, mint az alapvegyületé (Goyarts és Danicke, 2006). A DON-clearance farmakokinetikája mind a sertésekben (Goyarts és Danicke, 2006), mind a patkányokban (Meky és mtsai, 2003) azt sugallja, hogy 4 nap elegendő lenne a korábban elfogyasztott DON többségének kiválasztásához, miután ezt a mikotoxint eltávolították az étrendből. A vizeletszint csökkenése a 4 napos beavatkozási kísérletünket követően összhangban áll a mycotoxinok más vizelet-biomarkereivel kapcsolatos előrejelzésekkel, ahol a marker általában az előző 24–48 óra expozícióját tükrözi a gyors kiválasztódás miatt (Groopman et al., 1992).

A legutóbbi SCOOP (2003) felmérés az Európai Unióban kiemelte a gabonafélék és a gabonatermékek DON általi szennyeződését, és arra utalt, hogy egyes esetekben a TDI-t túllépik az Egyesült Királyságban. Számos bizonytalanság azonban felmerül a DON emberi expozíciójának élelmiszer-elemzéssel és gabonafelvétel-becslésekkel történő megállapításában. Első és legfontosabb az adott élelmiszer-árucikk mikotoxin-szennyezésének ismert heterogenitása, ami megnehezíti az elemzéshez szükséges reprezentatív élelmiszer-mintavételt. Másodszor, az expozíció nemcsak a szennyezettségtől, hanem a fogyasztás szintjétől is függ. Ezt étrendi felmérések alapján lehet meghatározni, de előfordulhat, hogy nem veszik kellőképpen figyelembe a fogyasztás szélsőségeit az egyéni szinten vagy a populáció meghatározott alcsoportjaiban, például vegetáriánusok és csecsemők. A vizeletből származó DON biomarker kifejlesztése objektívebb mértékű expozíciót ígér az egyéni szinten. Ezt a megközelítést sikeresen elérték az aflatoxinok, és jelentős előrelépésekhez vezetett az expozíció és a kapcsolódó egészségügyi hatások megértésében (Wild és Turner, 2002).

A vizelet DON-koncentrációjának ng/ml vizeletben való felhasználásával és egyének testtömegével (bw) sikerült nyers becslést adni a bevitelről. Ez a becslés patkánymodellből származó vizsgálatokon alapult (Meky és mtsai, 2003), és feltételezi, hogy (a) a reggeli vizeletmintában a DON koncentrációja reprezentatív az egész napra; (b) 1,5 l vizelet kiválasztása naponta (Curhan és mtsai, 2001; Van Haarst és mtsai, 2004); (c) a bevitt DON ∼ 35% -a ürül a vizelettel; és (d) hogy a vizeleti DON csak az előző 24 órás bevitelből származik. Ennek megfelelően a normál étrendjüket fogyasztók esetében a megfigyelt vizeletszint (átlagosan 10,7 ng DON/ml: tartomány: 2,4–67,8 ng/ml) itt átlagosan 729 ng/kg (testtömeg)/nap bevitelt jelent, ami ugyanolyan nagyságrenddel, bár a magas oldalon van, amint azt az Egyesült Királyság felnőttjeire vonatkozó SCOOP-jelentés 2003-ban becsülte. A 25 főből álló kis felmérésünkben ennélfogva 4 várhatóan meghaladja az ajánlott 1000 ng/kg (testtömeg)/nap TDI-t (SCF, 2002). Ennek a becslésnek a figyelmeztetései, nevezetesen az emberek vizeletében kiválasztott DON feltételezett százaléka azt jelenti, hogy az adatokat óvatosan kell értelmezni. Ha például a bevitt DON 50% -a ürült, mint sertéseknél megfigyelték (Goyarts és Danicke, 2006), akkor a becsült bevitel valamivel alacsonyabb lenne.

Tekintettel a látszólagos közös expozícióra és a DON által állatokban kifejtett erős toxicitásra (Pestka és Smolinski, 2005), fontos, hogy megvizsgálják az emberek jelenlegi expozíciójának lehetséges egészségügyi hatásait. Az előrejelzések szerint a csecsemőknek és a gyermekeknek magasabb a bevitelük, mint a felnőtteknél, és mint a legtöbb mérgező expozíció esetében, a nagyon fiatalok is különösen érzékenyek lehetnek. Más magas kockázatú csoportok közé tartozhatnak a vegetáriánusok, akik különösen magas gabonaféléket fogyasztanak. Az expozíció biomarkerének elérhetősége először teszi reálisá az ilyen vizsgálatokat.