Az étrendi oxalát hatása az emlős növényevő Neotoma albigula bélmikrobiotájára

ABSZTRAKT

BEVEZETÉS

Az emlősök összetett és nagyrészt szimbiotikus kapcsolatban élnek a bél mikrobiotájával. Ez a mikrobiota 150-szer több gént tartalmaz, mint a gazda, és összetett kölcsönhatásokat mutat a gazda étrendjével (1–3). Emlős növényevőkben a különféle bélbaktériumok megemésztik a magas kalcium-tartalmú étrendet, és az étrendből tápanyagokat szintetizálnak olyan formában, amely jobban befogadható a gazda számára (4). Továbbá az emlős növényevők nagyobb mikrobiális sokféleséget hordoznak a bélükben, mint akár mindenevők, akár húsevők (1). Az emlős bél mikrobiota és az étrend közötti kölcsönhatások kutatásának előrehaladása ellenére a táplálék és a mikroba kölcsönhatásainak izolálása egy ilyen összetett rendszerben nehéznek bizonyult (5, 6).

Amellett, hogy szerepet játszanak a fermentációban, a mikrobák fontos szerepet játszanak az étrendi toxinok biotranszformációjában emlős növényevőkben (4, 7–10). Egyes toxinok, például oxalát vagy 3,4-dihidroxi-piridin (DHP) esetében egyetlen baktériumfaj képes biotranszformálni a toxint, és ez a funkció mikrobiális transzplantációval átvihető más emlősökbe (7, 8, 11, 12) . Más toxinok, például kreozotgyanta esetében az egész mikrobiális közösség transzplantációja más emlősökbe növelheti a toleranciát (10).

A vadon élő emlős növényevő Neotoma albigula (fehértorkú erdei rózsa) ideális faj az étrendi oxalát hatásainak tanulmányozására. A N. albigula egyes populációi csaknem 100% Opuntia fajú kaktuszból álló étrendet fogyasztanak, amely magas oxaláttartalmat (1,5%, száraz tömeg) tartalmaz (26). A Neotoma albigula az étrendi oxalát több mint 90% -át lebonthatja, ha mesterséges étrendet fogyasztanak, legfeljebb 9% oxaláttal (száraz tömeg). Ez a magas szintű oxalát-lebontás feltételezése szerint a mikrobiális anyagcsere eredménye (27, 28). Ezenkívül a N. albigula számos ismert és potenciálisan oxalát-lebontó baktériumot tartalmaz, amelyek eloszlanak a gyomor-bél traktusban, többek között az Oxalobacter, a Lactobacillus, a Clostridium és az Enterococcus között (26). Így az N. albigula rendszeresen fogyaszt nagy mennyiségű oxalátot, és sokféle baktériumot tartalmaz, amelyek összetett kölcsönhatásokat mutatnak az oxaláttal, így ideális faj az oxalát-mikrobiota kölcsönhatások tisztázására.

A jelenlegi vizsgálat célja az étrendi oxalát és az N. albigula bél mikrobiota közötti ökológiai és funkcionális kölcsönhatások azonosítása volt. Ennek a tanulmánynak két elsődleges célja van. Az első az, hogy a növekvő oxalátfogyasztás milyen hatást gyakorol az oxalát degradációjára in vivo. A második annak meghatározása, hogy a N. albigula bélmikrobiota közösségi szintű választ mutat-e az oxalátfogyasztásra. Tekintettel az oxalátbontó baktériumok korábban azonosított differenciális válaszaira az oxalát jelenlétére, azt jósoltuk, hogy az oxalát serkenti egyes mikrobiális taxonok növekedését és gátolja mások növekedését, miközben semleges hatást gyakorol a fennmaradó közösségre. Adataink alátámasztják azt a hipotézist, miszerint a baktériumok speciális mikrobiális hálózata felelős az oxalát lebontásáért N. albigula-ban .

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Az állatok elhelyezkedése, gyűjtése és étrendje. Hat fehértorkú erdőrákot (N. albigula) gyűjtöttek Sherman élő csapdákkal az utahi Castle Valley-ből (38,63 ° É, 109,41 ° W) 2012 októberében. Az erdei patkányokat azonnal az Utah Egyetem Biológiai Tanszékére szállították Létesítmény és egyedi ketrecekben (48x27x20 cm) 12/12-órás világos/sötét ciklus alatt, 28°C és 20% páratartalom. Az állatokat fogságban tartottuk, és a kísérlet előtt 6 hónapig magas rosttartalmú nyúl-chow-t adtunk 0,2% oxaláttal (Teklad formula 2031; Harlan, Denver, CO, USA). Valamennyi módszert az Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság (IACUC) hagyta jóvá a 12-12010 protokoll alapján.

A diétás kísérlet megtervezése a

Oxalátvizsgálatok. A vizeletben található oxalát mennyiségét Ingale és munkatársai által leírt módosított protokoll követésével számszerűsítettük. (30) A vizeletmintákat minden egyes állatból naponta gyűjtöttük a vizsgálatokhoz, és egyesítettük az egyes kezelési időszakokra. A vizeletmintákat 3 M HNO3-tal savanyítottuk 2-es pH-értékig> 0,9 értékre.

Annak megbecsléséhez, hogy mennyi degradálódott az étrendi oxalát, számszerűsítettük az elfogyasztott oxalát és a kiválasztott összes oxalát közötti különbséget. Ez a becslés konzervatív, tekintve, hogy a vizelettel és az ürülékkel kiválasztott néhány endogén módon előállított oxalátot nem veszik figyelembe ezzel a módszerrel. Becsléseink szerint az oxalátmentes étrend teljes oxalátkiválasztása azt jelzi, hogy az endogén hozzájárulás jellemzően kicsi (mikrobiológiai készletek. Az egyes diétás kezelések utolsó napján friss székletet gyűjtöttünk a mikrobiális leltárakhoz, amelyeket -80 ° C-on fagyasztottunk le. C. A DNS kivonásáig. A QIAamp DNS széklet minikit (Qiagen, Germantown, MD, USA) segítségével DNS-t extraháltunk 180–220 g székletből. A DNS-extrakciókat oxaláton, ételen és az extrakciós készlet reagensein is elvégeztük. potenciális szennyező források. Összesen 36 székletmintából készítettek mikrobiológiai leltárokat úgy, hogy a 16S rRNS gén V4 régióját amplifikálták az 515F és a 806R primerekkel (31). Az alapozók 12 bázisú vonalkód-szekvenciát tartalmaztak, amely lehetővé tette a multiplexelést minták egy sávos szekvenáláson belül, Illumina MiSeq-en, egyenként 150 bp páros végű szekvenálással, a korábban leírtak szerint (32).

A szekvenciákat QIIME (33) alkalmazásával elemeztük. Szabványos minőségellenőrzést hajtottunk végre, és a szekvenciákat demultiplexeltük a QIIME alapértelmezett paramétereinek felhasználásával. De novo szedési stratégiát alkalmaztak az operatív taxonómiai egységek (OTU) UCLUST (34) osztályozásához, legalább 97% -os szekvenciaazonossággal. Ez a stratégia egy OTU táblázatot és filogenetikai fát eredményezett, amelyeket a downstream elemzések során használtak. Eltávolítottuk a kloroplasztiként vagy mitokondriumként azonosított szekvenciákat, vagy azokat, amelyek kevesebb mint 10 reprezentációval rendelkeztek az adathalmazon. Ezenkívül eltávolítottuk a további adatelemzésből azokat a mikrobiális közösségek mintáit, amelyeknél kevesebb, mint 3000 szekvenciaolvasás volt. Az összehasonlító elemzésekhez a mintákat azonos mintavételi mélységgel, 27 378 leolvasással ritkítottuk, ez volt a legnagyobb szám, amely a minőségellenőrzés után megmaradt összes mintát tartalmazta.

Kiszámítottuk az α-diverzitás metrikák fajgazdagságát (Margalef's richness index), egyenletességét (equitability) és Shannon indexét. A közösségi tagságot és a struktúrát súlyozatlan és súlyozott UniFrac elemzésekkel határoztuk meg, hogy összehasonlítsuk az egyének és a diétás kezelések mikrobiális közösségének hasonlóságát. A súlyozatlan UniFrac elemzés összehasonlítja a közösség tagjait, míg a súlyozott elemzés a relatív bőségeket is figyelembe veszi (35). Összehasonlításokat végeztünk a hasonlóság elemzésével (ANOSIM) 999 permutáció után. Ezenkívül az OTU relatív bősége és az oxalátfogyasztás között megismételt Pearson-korrelációs elemzést végeztek minden mintára és az OTU-ra. A sokszínűség, az ANOSIM és a korrelációs metrikákhoz a nyílt forráskódú QIIME szoftvert használták, a Pearson-korrelációhoz hamis felfedezési arány (FDR) korrekciót használtak. A szignifikanciát az oxalát lebomlás P értékénél állítottuk be. A testtömeg, a táplálékfelvétel, a DMD, a vízbevitel és a vizeletmennyiség nem különbözött szignifikánsan a kezelések között (2. táblázat). Az oxalátbevitel jelentősen megnőtt az étrendi oxalátkoncentrációk növekedésével (P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Az olyan metszetekhez kapcsolódó mutatók, amelyeket az oxalát nem befolyásolt jelentősen a

A bélben jelen lévő fő phyla relatív bősége különböző étrendi oxalátkoncentrációk mellett az idő múlásával. Az „Egyéb” kategória több phylát tartalmaz, kisebb mértékben hozzájárulva a mikrobiotához. Az oszlopok a kísérlet idősoraihoz viszonyítva vannak rendezve. Sem a közösségi tagság, sem a szerkezet nem változott az oxalát kezeléssel (P = 0,496 vagy 0,691).

α-Diverzitás mérőszámok a különböző étrendi oxalátkezelések között. A fajgazdagságot Margalef gazdagsági indexével, a fajok egyenletességét az egyenlőségük határozta meg, a Shannon-index pedig a fajok és az egyenletesség kombinációja. A statisztikai elemzéseket megismételtük - ANOVA-méréseket végeztünk, majd egy Holm-korrigált páros t tesztet követtünk. Ugyanazok a betűk statisztikailag hasonló kezelési csoportokat jelölnek. Az oszlopok sorrendje a kísérlet idősorát tükrözi. (A) fajgazdagság, amint azt ismételt ANOVA-mérések mutatják [F (5, 30) = 2,67, P = 0,044]; (B) a fajok egyenletessége, amelyet az ismételt ANOVA-mérések mutatnak [F (5, 30) = 1,1126, P = 0,38]; (C) Shannon-index, ismételt mérésekkel meghatározva ANOVA [F (5, 30) = 2,9928, P = 0,031].

A fajgazdagság korrelált az oxalátfogyasztással (ismételt Pearson-korreláció 0,001 P-vel és 0,529 r-rel). A szimbólumok az átlagos kezelés oxalátfogyasztását és fajgazdagságát jelentik.

A 6232 azonosított OTU közül összesen 116 OTU mutatott szignifikáns pozitív korrelációt (többek között P Oxalobacter, egy másik Oxalobacteraceae sp., Clostridiales és Lachnospiraceae). A legnagyobb OTU-t tartalmazó taxonómiai klád, amely pozitív korrelációt mutatott, az S24 volt. -7 család.

Mikrobiális OTU-k, amelyek relatív mennyisége pozitívan korrelált az oxalát bevitelével a

Az azonosított OTU egy részhalmazát megosztották az összes állat és kezelés között. Összesen 103 OTU volt jelen mind a hat oxalátmentes étrendet folytató állatban, és 282 OTU-t osztottak meg a 3% -os oxalát-étrendet folytató állatok, beleértve az összes olyan anyagot, amely az oxalátmentes étrendben volt (lásd az S2. Táblázatot). a kiegészítő anyagban).

VITA

A mostani tanulmány a bél mikrobiota kutatásának két fontos hiányosságára törekedett. Először is meg kell érteni azokat a tényezőket, amelyek hozzájárulnak az emlős bél mikrobiota alakjának és működésének változásához, mind a személyre szabott terápiák fejlesztésének elősegítése, mind az ökológiai elméletek előmozdítása érdekében (5, 6). Ezeknek a tényezőknek a tanulmányozását azonban megzavarja a bél mikrobiotájában rejlő komplexitás, hatalmas és változó sokféleségével, valamint jelentős mikroba-mikroba és mikroba-gazda kölcsönhatásokkal (2, 6, 36). Másodszor meg kell érteni, hogy az oxalát hogyan befolyásolja az emlős bél mikrobiotáját egészében. Korábbi kutatások az egyes taxonok szerepét vizsgálták az oxalát lebontásában (7, 20, 29, 37, 38). Az emlős bélből azonban számos oxalátot lebontó taxont azonosítottak, és más taxonokat homályos módon érinthet az oxalát (20, 26, 39, 40). A hiányosságok orvoslására kontrollált laboratóriumi étrendi kísérleteket, fiziológiai vizsgálatokat és mikrobiális ökológiát kombináltunk annak érdekében, hogy megvizsgáljuk a teljes bélmikrobiota taxonómiai és funkcionális válaszát egy emlős növényevő N. albigula-ban, amely természetesen nagy mennyiségű oxalátot fogyaszt étrendjében, egyszerű vegyület, amelyet kizárólag a bél mikrobiota metabolizál (18, 26).

A N. albigula mikrobiota kivételes, mivel képes lebontani az oxalátot. Az állatok nem mutattak semmilyen káros hatást az oxalátbevitel kapcsán (1. táblázat), és a mikrobiota az elfogyasztott oxalátmennyiségtől függetlenül képes volt lebontani az étrendi oxalát 90% -át, ami erős mikrobiális reakciót mutatott az oxalátfogyasztásra. Más emlősökön végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy az étrendi oxalát lebontásának szintje N. albigulában egyedülálló (27, 28). A norvég patkány (Rattus norvegicus) hiperoxalurissá válik 1,5% oxalát-étrend mellett (41; nem publikált adatok), míg egy másik tanulmány kimutatta, hogy a N. albigula 9% oxalátot képes tolerálni káros hatás nélkül (27). Az egyik lehetséges morfológiai jellemző, amely megkönnyítheti az oxalát lebomlását N. albigula-ban, egy olyan előbél jelenléte, amely egy nagy oxalát-lebontási potenciállal rendelkező mikrobiotát tartalmaz (10, 26). Metabolikus ketrecekben az N. albigula állatok hozzáférhetnek a közvetlen kopofágiahoz (a végbélből származó ürülék fogyasztása), ami segíthet az előmellék beoltására oxalátot lebontó baktériumokkal. A jelenlegi és korábbi vizsgálatok eredményeit figyelembe véve úgy tűnik, hogy a N. albigula bélmikrobiota jelentős oxalát lebontási képességgel rendelkezik, ami az oxalátfogyasztásra adott gyors mikrobiális reakcióra utal.

Munkánk azt mutatja, hogy az étrendi oxalát mind az N. albigula mikrobaközösségének sokféleségét, mind a specifikus OTU relatív bőségét befolyásolja. Az oxalátfogyasztás és a fajgazdagság közötti összefüggés (3A. Ábra) azt sugallja, hogy az OTU, amely az oxalátmentes étrendben lévő állatoknál kimutatható határérték alatt volt, relatív bőségben nőtt, magasabb oxalátfogyasztással kimutatható szintre. Ilyen összefüggést észleltek a (természetes) étrendi toxinok fogyasztása és a bél mikrobiota sokfélesége között más woodrat-vizsgálatokban, és ez valószínűleg az étrendi változásokhoz való dinamikus, közösségi szintű alkalmazkodást jelzi (42). Annak ellenére, hogy a jelenlegi vizsgálatban a bél mikrobiotája erősen aláírta a magatartást, egyes OTU-k általában egyaránt széles körben oszlottak meg az állatok között, és szignifikáns összefüggést mutattak az oxalátfogyasztással (3. táblázat; lásd még az S2 táblázatot a kiegészítő anyagban). Az oxalátfogyasztással megnövekedett mikrobák azon alcsoportja képviselheti az oxalát lebomlásának működéséhez elengedhetetlen mikrobák közös közösségét vagy egy „oxalát mikrobiómot”.

A bél magjának mikrobiotáját korábban különböző emlős gazda fenotípusokkal társították (43–45). A jelenlegi tanulmányban azonosítottuk a baktériumok azon alapkészletét, amelyek általában eloszlanak az egyének között és reagálnak az oxalátra, ami arra utal, hogy ez a mikrobiális hálózat fontos lehet az oxalát felszívódásának csökkentésében az N. albigula-ban. Az e csoportba tartozó baktériumok közül néhány, mint például az Oxalobacter, közvetlenül részt vehet az oxalát lebontásában. Mások, például az Oscillospira és a Clostridiales, közvetett módon profitálhatnak az oxalát lebomlásából, esetleg acetogenezissel, és elősegítik az oxalátot lebontó baktériumok folyamatos jelenlétét.

Az ismert oxalát-lebontó baktériumok probiotikus terápiákként történő felhasználásának stratégiái az oxalát vizeletürítésének csökkentésére emberben és patkánymodellek általában csak a vizelet oxalátjának efemer redukcióját és a probiotikus baktériumok által okozott átmeneti kolonizációt eredményezik (11, 37, 41, 46, 47) . Ez ellentétben áll az emlősökkel, amelyek az oxalát-lebontó baktériumok természetes gazdaszervezetei, például a jelenlegi vizsgálatban szereplő állatok, amelyek generációkon keresztül fenntartják ezeket a populációkat és a hozzájuk kapcsolódó funkciókat, és hosszú idő után is reagálnak a növekvő diétás oxalátra oxalát nélkül. az étrend (38, 48, 49). Az oxalátot lebontó baktériumok probiotikus kezelést követő átmeneti kolonizációja azt sugallja, hogy ezek az átültetett baktériumok nem képesek sikeresen beilleszkedni egy idegen közösségbe, ami azt jelenti, hogy léteznek ezeknek a baktériumoknak a támogatási mechanizmusai természetes gazdanövényeikben.

Úgy tűnik, hogy az S24-7 család kritikus szerepet játszik mind az oxalát mikrobiómában, mind az N. albigula bél mikrobiotájában általában. Ez a család az OTU 43% -át tette ki, amely szignifikáns összefüggést mutatott az oxalátfogyasztással, és következetesen az N. albigula teljes bélmikrobiotájának> 50% -át teszi ki (10; ez a tanulmány). Ez a család általában patkányokban, egerekben, kecskékben és emberekben található meg, és összefüggésben van a magas zsírtartalmú étrenddel, az immunglobin A-val, a galandférgekkel stb. Így az S24-7 család általában érzékeny lehet az étrendi váltásokra (50– 54.) Tekintettel e család széles körű elterjedésére és a korrelációra számos étrendi komponenssel, az S24-7 jelentős hiányosságot jelent a bél mikrobiota formájának és működésének megértésében.

Az oxalát egyszerű molekuláris vegyület, amelynek jellemzői lehetővé teszik az étrend és a mikrobiota közötti kölcsönhatások tisztázását az emlős bélben. A jelenlegi tanulmányban meg tudtuk jósolni a mikrobák alközösségének azonosságát, amely erőteljes, gyors reakciót mutat az oxalát lenyelésére. Eredményeink arra utalnak, hogy létezik egy külön oxalát-metabolizáló mikrobióm, amely bőségesen növekszik, ha oxalátot fogyasztanak. Megmutattuk továbbá, hogy az itt alkalmazott módszerek hatékonyak az emlős bél mikrobiotáján belüli olyan alközösségek azonosításában, amelyek egy adott érdekes funkciót töltenek be, és amelyek terápiás kontextusban hasznosak lehetnek.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetet mondunk Kevin Kohlnak az állatok gyűjtésében nyújtott segítségért, Jesse Nelsonnak az étrendi vizsgálatokhoz nyújtott segítségért és Ky-Phuong Luongnak a kézirathoz fűzött megjegyzésekért. Köszönjük Bob Weissnek a kísérlettel kapcsolatos visszajelzéseket.