Az étrendi keményítőforrás és koncentráció hatása a ló székletének mikrobiotájára

Állattenyésztési és Élelmiszertudományi Tanszék, University of Kentucky, Lexington, KY, 40546, Amerikai Egyesült Államok

Állattenyésztési és Élelmiszertudományi Osztály, University of Kentucky, Lexington, KY, 40546, Amerikai Egyesült Államok, Takarmány-állattenyésztési kutatási egység, Agrárkutatási Szolgálat, Amerikai Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériuma, Lexington, KY, 40546, Amerikai Egyesült Államok

Brittany E. Harlow,
Laurie M. Lawrence,
Susan H. Hayes,
Andrea Crum,
Michael D. Flythe

Ábrák

Absztrakt

A kukoricából származó keményítő kevésbé érzékeny a ló vékonybél emésztésére, mint a zab keményítője, a hátsó bélbe jutó keményítőt pedig a mikrobiota hasznosíthatja. A jelenlegi vizsgálat célja a keményítőforrásnak a ló székletének mikrobiotájára gyakorolt hatásainak vizsgálata volt. Harminc lovat osztottak be kezelésekre: kontroll (csak széna), HC (magas kukorica), HO (magas zab), LC (alacsony kukorica), LO (alacsony zab) és LW (alacsony pelletált búza közepesek). A lovak a takarmány-étrend előtt (2 hét; d -14-től d-1-ig) teljes takarmány-étrendet kaptak (2 hét; d 1-14). A keményítőt fokozatosan vezették be úgy, hogy a lovak d 4 és 100% -kal d 11-re kapták a kiosztott keményítőmennyiség 50% -át (magas = 2 g keményítő/testtömeg-kg; alacsony = 1 g keményítő/testtömeg-testtömeg-kilogramm). a takarmányozási időszak vége (S0; d -2), valamint a kezelési periódus d 6-án (S1) és d 13 (S2). Cellulolitikumokat, laktobacillusokat, D csoport Gram-pozitív kokkokat (GPC), laktát-hasznosítókat és amilolitikumokat soroltunk fel. A számlálási adatokat log transzformáltuk és ismételt ANOVA mérésekkel elemeztük. Voltak minta-napi × kezelési interakciók (P 0,05). Az LO kivételével minden kezelés fokozta az amilolitikumot és csökkent a cellulolitikát, de a változások nagyobbak voltak a kukoricával és búzafélékkel etetett lovaknál (P 1. táblázat. Kéna összetétele széna, kukorica, zab és búza közepesek 1 .

Bár kívánatos lett volna a magas búza közepes kezelés bevonása, a búza közepes keményítőtartalma a lovak kapacitását meghaladó beviteli szintet tett volna szükségessé. Ezért a magas búza közepes kezelését nem vették figyelembe. Az ajánlott táplálkozási gyakorlattal [26] összhangban a keményítőforrásokat az étrendbe fokozatosan a kezelési időszak d 1-én, a délutáni étkezéssel (15:00) kezdve vezették be. A lovak a kijelölt keményítőszint 25% -át kapták (magas = 2 g keményítő/testtömeg-kg; alacsony = 1 g keményítő/testtömeg-tömeg) d-től 3-ig, 50% -ot d 4-től 7-ig, 75% -ot d 8-tól 10-ig és 100% d 11-től 14-ig. A lovak a hozzárendelt keményítőszint további ½-át kapták reggel a részvétel előtt (08:00).

A székletmintákat három mintavételi időpontban gyűjtöttük össze. A kezdeti mintát a takarmányozási időszak végén, a keményítőforrások bevezetése előtt vettük (S0; d -2). A következő mintákat d6-on (S1) és a keményítő-táplálási periódus d13-ján (S2) gyűjtöttük. Az ürülékeket a székletürítés során fogó mintaként gyűjtötték össze, mielőtt a padlóval érintkeztek, hogy elkerüljék a talaj szennyeződését.

Közvetlenül az S0, S1 és S2 gyűjtés után a friss széklet almintáját (kb. 1 g) egy előre lemért steril Hungate csőbe helyeztük a későbbi baktériumszámlálás céljából. Amint a minta a csőben volt, kicserélték a gumidugót, és a tubust tuberkulin tűn keresztül 30 másodpercig CO2-ból tisztították. Ezeket a friss mintákat 37 ° C-on tartottuk, és a gyűjtéstől számított 2 órán belül a laboratóriumba szállítottuk. Az egyes kollekciók fennmaradó ürülékét a székletfolyadék pH-jának, a széklet DM-jének és a rövid láncú zsírsavak (SCFA) koncentrációinak meghatározására használták fel. A székletfolyadék pH-ját közvetlenül a gyűjtés után határoztuk meg az egyes székletminták egy részének összenyomásával, hogy hordozható pH-mérővel (IQ 150, pontosság ± 0,01 pH-egység; IQ Scientific Instruments, Loveland, CO) székletfolyadékot kapjunk a pH-méréshez. Körülbelül 100 g mintát szállítottak műanyag zacskóban a laboratóriumba a széklet DM analízisére, és két 15 ml-es kúpos ürüléket lefagyasztottak (-20 ° C) későbbi SCFA-elemzés céljából.

Bakteriális felsorolás

A laboratóriumba érkezés után a Hungate csöveket újra lemértük, és mindegyik mintát tízszeres (w/w) hígításnak vetettük alá anaerob PBS-sel (pH 7,4, N2-tartalmú; 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2PO4, 0,24 g KH2PO4/L), majd vortexen keverjük, amíg a szuszpenzió homogén lesz (

45 mp). A széklet-szuszpenziókat ezután sorozatosan hígítottuk (tízszeres/tömeg, anaerob PBS) anaerob kamrában (Coy, Grass Lake, MI, 95% CO2, 5% H2) a felsorolási közeg beoltása céljából.

Az összes amilolitikus baktériumot anaerob folyékony közegben számoltuk fel burgonya oldható keményítőjével [27]. A csöveket inkubáltuk (37 ° C, 3 nap). A baktériumok szaporodását okozó legnagyobb hígítást (vizuális vizsgálat) életképes számként regisztrálták. Az epe-esculin azid agaron (Enterococcosel; BD, Franklin Lake, NJ) felsorolták a Lancefield D csoport Gram-pozitív kókuszait (GPC), amelyek közé tartozik az Enterococcus spp., A Streptococcus bovis és a S. equinus. Lactobacillus spp. a Rogosa SL agaron (BD) vettük fel. A lemezeket aerob módon inkubáltuk (37 ° C, 3 nap). Lemezek 30 × -1) és defibrinált lóvérrel (5%; Quad Five, Ryegate, MT, USA). A lemezeket kiöntöttük, beoltottuk és inkubáltuk (37 ° C, 24 óra) anaerob kamrában, a fentiek szerint. Az E. colinak tűnő izolátumot ismételten izoláltuk, és aerob módon növesztettük E. coli szelektív és differenciál agaron (CHROMagar ™ E. coli; Chromagar, Párizs). Monenzin (10 μM) jelenlétében növesztettük annak biztosítására, hogy ne legyenek Gram-pozitív szennyeződések.

A filogenetikai azonosságokat 16S RNS gén szekvenálással határoztuk meg. Röviden, az egyes izolátumokból DNS-t nyertünk (lizozim és achromopeptidáz etanolos kicsapással), PCR univerzális 16S primerekkel (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA; 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, 3'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT) szaporítottuk, majd szekvenáltuk Genetikai Technológiai Központ (Lexington, KY) ABI 3730 DNS-analizátorával (Applied Biosystems, Norwalk, CT). A szekvenciákat összehangoltuk és elemeztük a Geneious segítségével (5.1. V.; [30]). Az izolátumok legközelebbi filogenetikai rokonait a GenBank BLAST keresésével határoztuk meg [31].

SCFA elemzések

A székletmintákat felolvasztjuk, 50% w/w vízzel összekeverjük és mikrocentrifugában (21 000xg, 2 perc) tisztítjuk. A részecskéket a felülúszókról mikrocentrifuga előkészítő oszlopokkal (Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter; Millipore) távolítottuk el. A rövid láncú zsírsavakat egy, a kutatócsoportunk és mások által korábban használt HPLC módszerrel számszerűsítettük (27, 32). A műszer egy Dionex HPLC (Sunnyvale, CA) volt, amely anioncserélő oszloppal (Aminex HP-87H; Bio-Rad, Hercules, CA), törésmutatóval (Shodex/Showa Denko, Kanagawa, Japán) és UV detektorral (Dionex, CA) volt felszerelve. Sunnyvale, Kalifornia). Az oszlopot 50 ° C-on üzemeltettük 0,4 ml/perc áramlási sebességgel és H2S04 (0,17 N) mozgófázissal. A vízhígítási lépést az eredmények figyelembe vették.

Statisztikai elemzések

Az amilolitikus baktériumok felsorolása

Magas keményítő-bevitelű amilolitikus baktériumok felsorolása során kezelési × minta-napi interakció volt (P 0,05).

a) A lovakat kezelésekhez rendeltük: csak széna (CON; n = 4), magas zab (HO; n = 4; 2 g keményítő/testtömeg-kg) vagy magas kukorica (HC; n = 4; 2 g keményítő/kg testtömeg). (b) A lovakat kezelésekhez rendeltük: csak széna (CON; n = 5), alacsony zab (LO; n = 5; 1 g keményítő/testtömeg-kg), alacsony kukorica (LC; n = 5; 1 g keményítő/kg) BW) vagy alacsony búzaszeműek (LW; n = 5; 1 g keményítő/testtömeg-kg). A keményítőforrások bevezetése előtt a csak takarmányozási takarmányozási időszak végén (S0; fekete oszlopok) nyertünk egy kezdeti mintát. További mintákat vettünk d6-ról, amikor a lovak a hozzárendelt keményítőforrás 50% -át kapták (S1; nyitott rudak), és d13-ról, amikor a hozzárendelt keményítőforrás 100% -át (S2; szürke sávok). A felsorolásokat anaerob folyékony közegben végeztük, oldható keményítővel a növekedési szubsztrátként. A csöveket inkubáltuk (37 ° C, 3 nap), és a baktériumok növekedését mutató végső hígítást életképes számként regisztráltuk. Azok az eszközök, amelyekben nincs közös angol betű, a mintanapon belül különböznek egymástól (P 4. táblázat. A ló amilolitikus baktériumok izolátumainak legközelebbi filogenetikai rokona (> 97% 16S génszekvencia azonosság).

Összefüggés volt a kezelés és az E. faecalis S1 (50% keményítő; P = 0,0617) és S2 (100% keményítő; P = 0,0082) túlsúlya között. Az Enterococcus faecalis volt a leggyakoribb domináns baktérium mind a kukorica, mind a búza közepesen táplált lovakban (S1, 7/10 E. faecalis; S2, 10/10 E. faecalis). Ezzel szemben a zabtáplált lovaknál az S1 és S2 csoportokon különféle domináns amilolitikus baktériumok voltak (7/14 Enterococcus spp., 4/14 Streptococcus spp., 2/14 Lactococcus lactis, 1/14 Clostridium sordellii).

Továbbá összefüggés volt a mintanap és az E. faecalis túlsúlya között a HC (P = 0,0764), HO (P = 0,0941), LC (P = 0,0022) és LW (P = 0,0271) kezeléseken belül. A kukoricával etetett lovaknál (mind HC, mind LC) az E. faecalis izolálásának gyakorisága a keményítőbevitel növekedésével nőtt (HC: S0, 2/7 E. faecalis; S1, 57% E. faecalis; S2, 100% E . faecalis), és hasonló tendenciát figyeltünk meg a közepesen etetett búza lovaknál is (S0, 25% E. faecalis; S1 és S2, 100% E. faecalis). Ezzel szemben az E. faecalis izolálás gyakorisága csökkent a keményítőbevitel növekedésével a HO lovaknál. Az S2-nél az E. faecalis-t nem izolálták egyetlen HO-étrendet tápláló ló sem.

A GPC baktériumok felsorolása

A csak takarmányozási időszak végén, amikor minden lovat csak szénával tápláltak (S0), az egyes lovak székletében megfigyelt GPC baktériumok száma 2,05 × 104 4 és 6,55 × 10 5 cfu/g széklet között mozgott . Volt egy kezelés × minta nap interakció a magas keményítőbevitelű fekális GPC felsorolásoknál (P 2. ábra. Az étrendi keményítőforrás (kukorica, zab és búzafélék) hatása a D csoport Gram-pozitív kokkok életképes számára (GPC; enterococcusok és Streptococcus bovis/equinus) ló székletében.

a) A lovakat kezelésekhez rendeltük: csak széna (CON; n = 4), magas zab (HO; n = 4; 2 g keményítő/testtömeg-kg) vagy magas kukorica (HC; n = 4; 2 g keményítő/kg testtömeg). (b) A lovakat kezelésekhez rendeltük: csak széna (CON; n = 5), alacsony zab (LO; n = 5; 1 g keményítő/testtömeg-kg), alacsony kukorica (LC; n = 5; 1 g keményítő/kg) BW) vagy alacsony búzaszeműek (LW; n = 5; 1 g keményítő/testtömeg-kg). A keményítőforrások bevezetése előtt a csak takarmányozási takarmányozási időszak végén (S0; fekete oszlopok) nyertünk egy kezdeti mintát. További mintákat vettünk d6-ról, amikor a lovak a hozzárendelt keményítőforrás 50% -át kapták (S1; nyitott rudak), és d13-ról, amikor a hozzárendelt keményítőforrás 100% -át (S2; szürke sávok). Azok az eszközök, amelyekben nincs közös angol betű, a mintanapon belül különböznek (P 4 - 9,65 × 10 4 cfu/g ürülék S0-ban. Kezelés × minta nap interakció volt a nagy keményítő bevitelű laktobacillusok felsorolása esetén (P 0,05), HC-lovak (P 3. ábra. Az étrendi keményítőforrás (kukorica, zab és búzafélék) hatása a ló bacillusok életképes számára a ló székletében.

a) A lovakat kezelésekhez rendeltük: csak széna (CON; n = 4), magas zab (HO; n = 4; 2 g keményítő kg BW -1) vagy magas kukorica (HC; n = 4; 2 g keményítő)/testtömeg kg). (b) A lovakat kezelésekhez rendeltük: csak széna (CON; n = 5), alacsony zab (LO; n = 5; 1 g keményítő/testtömeg-kg), alacsony kukorica (LC; n = 5; 1 g keményítő/kg) BW) vagy alacsony búzaszeműek (LW; n = 5; 1 g keményítő/testtömeg-kg). A keményítőforrások bevezetése előtt a csak takarmányozási takarmányozási időszak végén (S0; fekete oszlopok) nyertünk egy kezdeti mintát. További mintákat vettünk d6-ról, amikor a lovak a hozzárendelt keményítőforrás 50% -át kapták (S1; nyitott rudak), és d13-ról, amikor a hozzárendelt keményítőforrás 100% -át (S2; szürke sávok). Azok az eszközök, amelyekben nincs közös angol betű, a mintanapon belül különböznek (P 5 - 4,55 × 10 5 cfu/g. Kezelés × minta nap interakció volt a teljes keményítőbevitelű laktát-hasznosító baktériumok felsorolásakor (P 0,05). kezelés × minta-napi interakció a teljes laktát-hasznosító baktériumok számára, alacsony keményítőbevitel mellett (P 0,05).

a) A lovakat kezelésekhez rendeltük: csak széna (CON; n = 4), magas zab (HO; n = 4; 2 g keményítő/testtömeg-kg) vagy magas kukorica (HC; n = 4; 2 g keményítő/kg testtömeg). (b) A lovakat kezelésekhez rendeltük: csak széna (CON; n = 5), alacsony zab (LO; n = 5; 1 g keményítő/testtömeg-kg), alacsony kukorica (LC; n = 5; 1 g keményítő/kg) BW) vagy alacsony búzaszeműek (LW; n = 5; 1 g keményítő/testtömeg-kg). A keményítőforrások bevezetése előtt a csak takarmányozási takarmányozási időszak végén (S0; fekete oszlopok) nyertünk egy kezdeti mintát. További mintákat vettünk d6-ról, amikor a lovak a hozzárendelt keményítőforrás 50% -át kapták (S1; nyitott rudak), és d13-ról, amikor a hozzárendelt keményítőforrás 100% -át (S2; szürke sávok). Azok az eszközök, amelyeknek nincs közös angol betűjük, a mintanapon belül különböznek (P 6-107 cfu/g. A cellulózbaktériumok száma állandó maradt a kontroll étrendet tápláló lovaknál, de csökkent a HC-vel és HO-val táplált lovaknál (kezelés × mintanap: P 0,05).

a) A lovakat kezelésekhez rendeltük: csak széna (CON; n = 4), magas zab (HO; n = 4; 2 g keményítő/testtömeg-kg) vagy magas kukorica (HC; n = 4; 2 g keményítő/kg testtömeg). (b) A lovakat kezelésekhez rendeltük: csak széna (CON; n = 5), alacsony zab (LO; n = 5; 1 g keményítő/testtömeg-kg), alacsony kukorica (LC; n = 5; 1 g keményítő/kg) BW) vagy alacsony búzaszeműek (LW; n = 5; 1 g keményítő/testtömeg-kg). A keményítőforrások bevezetése előtt a csak takarmányozási takarmányozási időszak végén (S0; fekete oszlopok) nyertünk egy kezdeti mintát. További mintákat vettünk d6-ról, amikor a lovak a hozzárendelt keményítőforrás 50% -át kapták (S1; nyitott rudak), és d13-ról, amikor a hozzárendelt keményítőforrás 100% -át (S2; szürke sávok). Azok az eszközök, amelyekben nincs közös angol betű, különböznek a mintanapon (P 97% 16S génszekvencia azonosság) és a jellemzésen belül.

Köszönetnyilvánítás

Az ebben a cikkben közölt információk (15-07-084. Szám) a kentuckyi mezőgazdasági kísérleti állomás projektjének részét képezik, és az igazgató jóváhagyásával teszik közzé. Ezt a munkát a Nemzeti Élelmezési és Mezőgazdasági Intézet (Hatch) és a Prairie Zabtermesztők támogatják. Az MDF-et az USDA-ARS, a Nemzeti Program 215. támogatta. A szerzők elismerik Gloria Gellin technikai segítségét, valamint Laura Strasinger, Ashley Fowler és Tayler Hansen állattenyésztési segítségét.

Tulajdonosi vagy márkanevek szükségesek a rendelkezésre álló adatok tényszerű jelentéséhez; azonban az USDA nem garantálja és nem szavatolja a termék színvonalát, és a név USDA általi használata nem vonja maga után a termék jóváhagyását, és mások kizárását sem, amelyek alkalmasak lehetnek. Az USDA esélyegyenlőségi munkaadó.

Szerző közreműködései

A kísérletek megtervezése és megtervezése: BEH LML MDF. Végezte a kísérleteket: BEH SHH AC. Elemezte az adatokat: BEH LML. Hozzájáruló reagensek/anyagok/elemző eszközök: LML MDF. Írta a dolgozat: BEH LML MDF.