Étvágyjavítás és súlygyarapodás a TrkB agonisták perifériás beadásával nem emberi főemlősökben

Rinat, Pfizer Inc., South San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

étvágy

Rinat, Pfizer Inc., South San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Társulás Alpha Genesis, Inc., Yemassee, Dél-Karolina, Amerikai Egyesült Államok

Southwest Biomedical Research Alapítvány, San Antonio, Texas, Amerikai Egyesült Államok

Társulás Northern Biomedical Research, Muskegon, Michigan, Amerikai Egyesült Államok

Rinat, Pfizer Inc., Dél-San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Rinat, Pfizer Inc., South San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Rinat, Pfizer Inc., South San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Rinat, Pfizer Inc., South San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Rinat, Pfizer Inc., South San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Rinat, Pfizer Inc., Dél-San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Rinat, Pfizer Inc., Dél-San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Rinat, Pfizer Inc., South San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Rinat, Pfizer Inc., South San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Southwest Alapítvány az Orvosbiológiai Kutatásokhoz, San Antonio, Texas, Amerikai Egyesült Államok

Rinat, Pfizer Inc., South San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

  • John C. Lin,
  • David Tsao,
  • Paul Barras,
  • Raul A. Bastarrachea,
  • Bob Boyd,
  • Joyce Chou,
  • Rodnie Rosete,
  • Hua Long,
  • Alison Forgie,
  • Yasmina Abdiche

Ábrák

Absztrakt

A funkcionális mutációk elvesztése a receptor tirozin kináz TrkB útvonalában hiperfágia és kóros elhízáshoz vezetett emberben és rágcsálókban. Ezzel szemben a TrkB természetes ligandumai, a BDNF vagy az NT4 perifériás vagy központi stimulációja csökkentette az egerek testtömegét és táplálékfelvételét, alátámasztva azt az elképzelést, hogy a TrkB kulcsfontosságú anorexigén jel a melanocortin-4 receptor (Mc4r) rendszer után. Itt megmutatjuk, hogy nem főemlősökben a TrkB agonisták anorexigének voltak, ha központilag alkalmazzák őket, de meglepő módon orexigén hatásúak voltak, ami perifériás beadás esetén növelte az étvágyat, a testsúlyt, a zsírlerakódást és a szérum leptinszintet. A periférián beadott TrkB agonisták orexigén és elhízást elősegítő hatásai dózisfüggőnek tűnnek, nem járnak folyadékretencióval vagy a receptor lefelé történő szabályozásának bizonyítékaival. Eredményeinkből kiderült, hogy a TrkB jelátvitel kettős ellenőrzést gyakorol az energia homeosztázisában a főemlősökben, amely akár pazarló rendellenességek, akár elhízás kezelésére irányulhat.

Idézet: Lin JC, Tsao D, Barras P, Bastarrachea RA, Boyd B, Chou J és mtsai. (2008) Étvágyjavítás és súlygyarapodás a TrkB agonisták perifériás beadásával nem emberi főemlősökben. PLoS ONE 3 (4): e1900. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001900

Szerkesztő: Sadaf Farooqi, Cambridge University, Egyesült Királyság

Fogadott: 2007. augusztus 27 .; Elfogadott: 2008. február 12 .; Közzétett: 2008. április 2

Finanszírozás: A Pfizer Inc. finanszírozta és jóváhagyta a munka publikálását.

Versenyző érdeklődési körök: A JCL, JS és AR az itt leírt eredmények alapján szabadalmi bejelentést nyújtott be.

Bevezetés

Az agyi eredetű neurotróf faktor (BDNF) és a neurotrofin-4 (NT4) a trkB receptor tirozin-kináz két természetben előforduló liganduma [1]. Eredetileg az idegsejtek túlélésének és az idegsejtek kinövésének trofikus tényezőinek tekintették az embrionális fejlődés során, és ezek a tényezők sokféle biológiai funkciót tölthetnek be a felnőttben, például hosszú távú potencírozást és szinaptikus plaszticitást. A BDNF mRNS-ét általában a ventromedialis hipotalamuszban (VMH) fejezik ki [2], [3], [4], [5]. A BDNF mRNS VMH-expressziója számos olyan körülmények között csökken, ahol fokozott az étvágy, például táplálékhiány, melanokortin antagonizmus (mint A y letális sárga egereknél) és a melanocortin 4 receptor genetikai ablációja (Mc4r) [3].

A BDNF vagy trkB lókuszok funkcióvesztéses mutációi egerekben hyperphagia és elhízás szindrómához vezettek. Ide tartoznak a BDNF-hiányos alléllel heterozigóta egerek [2], [4], a postnatalis agy-specifikus BDNF-delécióval rendelkező egerek [5], valamint a trkB hipomorf alléljával rendelkező egerek [3]. Figyelemre méltó módon egy de novo trkB mutációt azonosítottak egy szellemileg retardált, kórosan elhízott gyermeknél [6]. Ennek a mutáns humán trkB allélnak a kináz aktivitása nagymértékben csökken. Emellett kiderült, hogy a hiperfágia és az elhízás emberi esete a BDNF expresszióját befolyásoló kromoszóma transzlokációt hordoz magában [7]. Ezenkívül a különféle TrkB agonisták központi és perifériás beadása elnyomta a táplálékfelvételt és a testsúlyt az elhízás számos egérmodelljénél [2], [3], [8], [9]. Ezek a megállapítások együtt alátámasztják azt az elképzelést, hogy az agyban expresszált trkB BDNF általi aktiválása elengedhetetlen az étvágyszabályozáshoz és az energia homeosztázishoz.

A trkB agonizmus mint emberi elhízás terápiás megközelítésének megvalósíthatóságának vizsgálatához számos kísérletet hajtottunk végre NT4, BDNF és TrkB agonista antitest alkalmazásával a főemlősök több fajában. Az NT4 és a BDNF is, közvetlenül az agyba juttatva, elnyomta a sovány majmok élelmiszer-fogyasztását. Várakozásainkkal ellentétben az NT4 és a TrkB agonista antitest szignifikánsan megnövelte a táplálékfelvételt, a testsúlyt, a zsírtömeget és a keringő leptinszintet a sovány majmokban, sőt az elhízott páviánokban is. További elemzés egy új, periférián hozzáférhető, orexigenikus TrkB rendszert javasolt, amely aktiválva képes egyensúlyba hozni a központi anorexigén TrkB rendszert.

Eredmények

A TrkB agonisták beadása hipofágia esetén és egerek fogyása

Mivel az NT4 agonista profilja nagyon hasonló, mint a BDNF [10], [11], [12], ezt a két tényezőt külön-külön és felcserélhetően használjuk a természetben előforduló TrkB agonista szerekként. A diéta által kiváltott elhízás (DIO) egérmodell napi intravénás (IV) kezelése 0,6, 2 vagy 4 mg/kg NT4-el dózisfüggő csökkenést eredményezett az étkezés (1a. Ábra) és a testtömeg (1b. Ábra) dózisfüggő csökkenésében. Súlycsökkenést figyeltek meg a 11. napon is 2 mg/kg BDNF, 2 mg/kg NT4 heti injekcióval (1c. Ábra) vagy 3 mg/kg TrkB szelektív agonista antitest egyszeri intravénás injekciójával (1d. Ábra; Tsao et al., 2007; a TrkB agonista antitest előállításáról és jellemzéséről további részletekért lásd még az S1 kiegészítő módszereket, az S1 – S2 kiegészítő ábrákat és az S1 kiegészítő táblázatot. A 12 hetes, elhízott nőstény db/db egerek napi szubkután (SC) kezelése 20 mg/kg NT4-vel (n = 8 csoportonként) 30 napig a napi táplálékbevitel tartós 50-80% -os csökkenéséhez is vezetett. 1e), és egy lineárisan időfüggő, 40% -os testsúlycsökkenés (1f. Ábra), amely megerősíti, hogy a TrkB aktiválása önmagában anorexiát és súlyvesztést okoz a rágcsálókban, függetlenül a leptin jeltől [9]. Ilyen kezelési körülmények között nem mutatkozott tolerancia, deszenzitizáció, alkalmazkodás vagy rezisztencia az NT4 nagy dózisának való kitettséggel szemben.

a, napi 0,6, 2 vagy 4 mg/kg NT4 (n = 6 csoportonként) IV-es injekció dózisfüggő átlagos napi táplálék-bevitel csökkenését eredményezte 5 napos felnőtt hím DIO egerekben (egyirányú ANOVA, P = 0,0098, F = 4,967 Dunnett utóvizsgálatával, P 2. ábra. Középen, de nem periférián szállított TrkB agonisták elnyomják a táplálékfelvételt rhesus majmokban.

a, Jármű infúziója normál felnőtt rhesusmajmokba (kiindulási testsúly 4–7 kg) ICV-katéteren keresztül nem változtatta meg lényegesen az élelmiszer-fogyasztást (n = 2 hím és 2 nő csoportonként). b, Dózisfüggő és reverzibilis ételfogyasztás-csökkenés követte az ICV-infúziót normál felnőtt rhesusmajmokban, növekvő dózisú NT4 vagy BDNF adagolással (n = 2 hím és 2 nő csoportonként). c, 2 mg/kg NT4 (n = 1 hím és 2 nő csoportonként) napi SC injekciója 21 nap alatt sovány, felnőtt rhesus majmokban (az alap testtömeg 3–6 kg) nem változtatta meg jelentősen a napi táplálékfelvétel szintjét.

A TrkB agonisták perifériás beadása hiperphágiahoz és súlygyarapodáshoz vezet majmoknál

a – d, A nem elhízott, felnőtt nők, a Cynomolgus (az alap testtömeg 3–5 kg) napi kezelése 2 mg/kg/nap NT4 IV-vel (n = 3 csoportonként) 30 napig a napi jelentős növekedéséhez vezetett táplálékfelvétel (a), kumulált táplálékfelvétel (b) és testtömeg (c) a vízbevitel jelentős változása nélkül (d). Az e – f, sovány, felnőtt nőstény Cynomolgus majmok (n = 3 csoportonként), akiket hetente kétszer kezeltek 5 mg/kg TrkB agonista antitest intravénás injekcióval, jelentősen megnövelte a kumulatív táplálékfelvételt (e) és a súlygyarapodást f)

Annak tesztelésére, hogy a TrkB aktiválása önmagában elegendő-e az elhízás és az étvágy kiváltásához, a sovány, felnőtt nőstény Cynomolgus majmokat hetente kétszer 5 mg/kg TrkB agonista antitest intravénás injekcióival kezelték. Ezeknek a majmoknak a halmozott táplálékfelvétel is 40% -kal (3e. Ábra) és 10% -kal nőtt a testtömegben (3f. Ábra) 2 héten belül. Így a TrkB tirozin-kináz receptor aktiválása természetes agonista, NT4 vagy TrkB agonista antitest perifériás beadásával erős orexigén és elhízást elősegítő hatásokhoz vezet a főemlősökben.

A perifériás NT4 injekciók növelik az élelmiszer-fogyasztást, a testsúlyt, a zsírtömeget és a keringő leptint elhízott páviánokban

A perifériás TrkB agonisták mint orexigén szignál általános és hatékonyságának meghatározása a főemlősökben felnőtt, elhízott nőstény páviánoknak intravénás injekciót adtak napi 2 mg/kg NT4-nek 25 napon keresztül. Annak ellenére, hogy a kiinduláskor elhízott, az összes NT4-kezelt állat napi 2-3-szorosára növelte a napi táplálékfelvételt (4a. Ábra), és 35 keksz teljes napi táplálékát 18 napig elfogyasztotta. Amikor az étkezési összeget napi 45 kekszre emelték (19. naptól a 25. napig), két állat még mindig elfogyasztotta a teljes juttatást (S7a kiegészítő ábra). Az NT4 kezelés ideje alatt a kumulatív táplálékbevitel 2,5-szeresére nőtt (S7b kiegészítő ábra). A hiperfág viselkedés az NT4 utolsó adagját követő 7 napon belül alábbhagyott (4a. Ábra). Az NT4 napi infúziója szintén 16% -os testtömeg-növekedést eredményezett ezekben az elhízott páviánokban, amelyeknek a kezelés visszavonása után több mint 30 napig tartott a kiindulási szintre való visszatérése (4b. Ábra). A súlygyarapodásnak megfelelően ezek az NT4-kezelt páviánok szignifikánsan magasabb éhomi szérum leptinszintet mutattak (9433 ± 841 pg/ml, n = 3), mint a kontroll csoporté (2707 ± 1603 pg/ml, n = 3) 3 hét múlva. kezelését (P 4. ábra. A TrkB agonisták hatása az elhízott páviánok étvágyára és súlyára.

a – d, napi 2 mg/kg NT4 napi IV infúzió elhízott páviánokba (az alap testtömeg 20–30 kg, n = 3 csoportonként) az élelmiszer-bevitel (a) és a testtömeg visszafordítható növekedéséhez vezet ( b). A kettős röntgenabszorpciós (DEXA) vizsgálat a teljes zsír növekedését (c) tárta fel, a sovány testtömeg változása nélkül (d). Az e – f, IV-es adagolás hetente kétszer, 2 mg/kg NT4 adagolással 6 héten át súlygyarapodáshoz vezet (f), az elhízott páviánoknál az élelmiszer-bevitel (e) változása nem változik (n = 3 csoportonként). g, A TrkB jelzőrendszer kettős, anorexiás és orexigén tengelyét ábrázoló sematikus modell.

A kettős röntgenabszorpciós (DEXA) vizsgálat az NT4 kezelés mély hatását tárta fel a testösszetételre (4c. És 4d. Ábra). Az NT4-vel kezelt páviánok 1,65 ± 0,31 kg-ot (átlag ± SEM) híztak, míg a vivőanyaggal kezelt páviánok 1,36 ± 0,47 kg-ot a teljes zsírtömegről (4c. Ábra, P = 0,01, kétfarkú Student-teszt Welch-korrekcióval). Nem volt szignifikáns különbség a sovány testtömegben (4d. Ábra, P = 0,10) vagy a csont ásványi sűrűségében (az adatokat nem közöljük) a csoportok között. Ezért a TrkB perifériás aktiválása erőteljes orexigén hatást eredményez, ami a testtömeg és a zsírtömeg növekedéséhez vezet még az elhízással nem rendelkező emberi főemlősöknél is.

A perifériás NT-4 injekciók elhízást megelőző hatása nem a receptorok deszenzibilizációjának köszönhető

Formálisan lehetséges volt, hogy a hatásos TrkB agonisták krónikus expozíciója TrkB receptorok leépüléséhez vezethetett, és ezáltal a funkcióvesztés fenotípusához vezetett. Ezért megvizsgáltuk az időszakos, heti kétszeri IV adagolás hatását 2 mg/kg NT4 adagolással az elhízott páviánokon 6 héten keresztül. A kezelt állatok fokozatosan elérték a 7–8% -ot, míg a vivőanyag-csoport átlagosan a testtömeg 3–4% -át veszítette el, ami jelentős különbséget eredményezett e csoportok között (4f. Ábra). A táplálékbevitelben azonban nem történt jelentős változás a súlygyarapodás kíséretében (4e. Ábra).

Az NT4 napi, vagy heti kétszeri adagolását követő hasonló elhízást elősegítő hatás (4a – f. Ábra), amelynek főemlősök felezési ideje kevesebb, mint 30 perc (az adatokat nem mutatjuk be), összeegyeztethetetlen a TrkB hipotézisével receptor le szabályozás. Hasonlóképpen, a pávián perifériás fehérvérsejtekben nem észleltek következetes változásokat a TrkB receptor szintjeiben, amelyek a receptor lefelé történő szabályozását jelezhették volna, 24 mg napi IV kezelést követően 2 mg/kg NT4-gyel (kiegészítő ábra S7c). Végül, összhangban a főemlősök ezen megfigyeléseivel, egyetlen egérmodellben sincs bizonyíték a TrkB toleranciára, deszenzitizálódásra vagy rezisztenciára az általunk tesztelt TrkB agonisták bármely dózisával (1. ábra). Ezek a megállapítások azt mutatják, hogy a periférián alkalmazott NT4 elhízást megelőző hatásait nem közvetíti a receptorok lefelé történő szabályozása, és hogy a perifériás NT4 beadása közvetlenül csökkentheti az anyagcserét, függetlenül attól, hogy milyen hatással van a főemlősök táplálékfelvételére.

Vita

Az itt leírt eredmények arra utalnak, hogy a főemlősökben létezik egy új, periférián hozzáférhető, orexigén és elhízást elősegítő TrkB tengely, amely szemben áll a hagyományos, központilag elhelyezkedő anorexigén TrkB tengellyel (4g. Ábra). A rendszer mindkét ága a TrkB jelátviteli utat használja, és a metabolikus végeredményt a differenciálisan lokalizált TrkB jelek relatív erőssége határozza meg. Tudomásunk szerint ez az első példa a főemlősökben, amelyek teljesen ellentétes metabolikus és viselkedési eredménnyel járnak, ugyanazon jelátviteli út által közvetítve a térbeli elkülönítésen keresztül. A perifériásán hozzáférhető, orexigén TrkB jel anatómiai működési helyei jelenleg ismeretlenek, de magukban foglalhatják az enterális idegrendszert, a hasnyálmirigy és a bél neuro-endokrin rendszerét, a vagális ideget és/vagy a kerületi szerveket.

A TrkB rendszer alapértelmezett állapota az egész testben anorexigénnek tűnik, amit jelez az a tény, hogy a rágcsálók [2], [3], [5] vagy emberek [6], [7] a BDNF funkcióveszteségét vesztik vagy a TrkB lokusz korai kezdetű elhízást és hiperfágiát mutatott. Az anorexigén TrkB inger azonban, amelyet a BDNF közvetít a VMH-ban, étrend-ellenőrzés alatt áll, és kimutatták, hogy az egerekben végzett koplalást követően elnyomott [3]. Ezért egy adott élettani állapotban a központi anorexigén vagy a perifériás vagy exexigén TrkB rendszer uralhatja a metabolikus kimenetet a receptor aktivációjának relatív szintjétől függően (4g. Ábra). A periférikusan hozzáférhető, orexigén TrkB tengely a rágcsálókban vagy hiányzik, vagy kvantitatív módon el volt takarva a dominánsabb, központi anorexigén TrkB tengellyel, amely kicsi állatoknál hozzáférhetőbb lehet a periférián alkalmazott TrkB receptor agonisták számára [13].

Érdekes módon a felnőtt anorexia nervosa betegeknél állítólag a normálnál alacsonyabb a BDNF szérumszintje, míg az elhízott felnőtteknél a normálnál magasabb a szérum BDNF szintje [14], [15], [16], [17]. Eddig ezeket a megállapításokat a központi anorexigén TrkB rendszer sikertelen kompenzációs válaszaként értelmezték, hasonlóan a leptin rendszerrel megfigyelthez [18], [19]. Adataink most felvetik annak a különös lehetőségét, hogy az étkezési rendellenességeket, például az anorexia nervosát, részben a keringő BDNF „normálnál alacsonyabb” szintje és az ebből adódó perifériásan hozzáférhető orexigén TrkB tengely aktiválásának hiánya okozhatja. Ezzel szemben az elhízás részben a perifériás BDNF „szupranormális” szintjének tudható be, amely túlzottan aktiválja az orexigén TrkB jelátvitelt. Jelentős mennyiségű BDNF van jelen a vérlemezkékben [20] és az agyalapi mirigyben [21], amelyek potenciális TrkB agonisták forrásai lehetnek az orexigén TrkB tengely perifériás szabályozásához. Ha igaz, akkor a perifériásán hozzáférhető orexigén TrkB-hely szelektív aktivátorai új terápiás szereket jelentenek az anorexia és a cachexia kezelésében, míg ennek a rendszernek a szelektív inhibitorai hasznosak lehetnek a hyperphagia és az elhízás kezelésében.

Mód

Az alkalmazott anyagok és módszerek további részleteit az S1 kiegészítő módszerek tartalmazzák.

Fehérjék

Rekombináns humán BDNF fehérjét a Peprotech-től (Rocky Hill, New Jersey) szereztünk be. A rekombináns humán NT4 fehérjét tisztítottuk és újratekertük egy E. coli tenyészetből, amely az NT4 túl expresszálására lett kialakítva, standard eljárások alkalmazásával (lásd S1 kiegészítő módszerek). A TrkB agonista antitesteket a humán TrkB fehérje teljes extracelluláris doménjének felhasználásával állítottuk elő immunogénként Balb/c egerekben, hogy hibridómákat állítsunk elő (lásd az S1 kiegészítő módszereket).

Állatkísérletek

Valamennyi állatkísérletet az adott intézmény IACUC által jóváhagyott protokolljainak megfelelően végeztük (lásd az S1 kiegészítő módszereket). A vegyület beadásának különféle módjait, az élelmiszer-fogyasztás és a testtömeg mérését részletesen az S1 kiegészítő módszerekben írták le. Ebben a cikkben egy adott vizsgálat „1. napja” azt a napot jelöli, amikor a terápiás szer első adagját beadták.

Statisztika