Az in vivo fittség és az étrend reakciókészségének genetikai meghatározói több emberi bél Bacteroides-ben

Meng Wu

1 Genomtudományi és Rendszerbiológiai Központ, Washington Egyetem Orvostudományi Kar, St. Louis, MO 63108 USA

2 Center for But Microbiome and Nutrition Research, Washington Egyetem Orvostudományi Kar, St. Louis, MO 63108 USA

Nathan P. McNulty

1 Genomtudományi és Rendszerbiológiai Központ, Washington Egyetem Orvostudományi Kar, St. Louis, MO 63108 USA

Dmitrij A. Rodionov

3 Fertőző és gyulladásos betegségek központja, Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute, La Jolla, 92037 CA USA

4 A.A. Kharkevich Információátviteli Problémák Intézete, Orosz Tudományos Akadémia, Moszkva 127994, Oroszország

Matvei S. Khoroshkin

4 A.A. Kharkevich Információátviteli Problémák Intézete, Orosz Tudományos Akadémia, Moszkva 127994, Oroszország

Nicholas W. Griffin

1 Genomtudományi és Rendszerbiológiai Központ, Washington Egyetem Orvostudományi Kar, St. Louis, MO 63108 USA

2 Center for But Microbiome and Nutrition Research, Washington Egyetem Orvostudományi Kar, St. Louis, MO 63108 USA

Jiye Cheng

1 Genomtudományi és Rendszerbiológiai Központ, Washington Egyetem Orvostudományi Kar, St. Louis, MO 63108 USA

2 Center for But Microbiome and Nutrition Research, Washington Egyetem Orvostudományi Kar, St. Louis, MO 63108 USA

Phil Latreille

5 Monsanto Company, St. Louis, MO 63167, USA

Randall A. Kerstetter

5 Monsanto Company, St. Louis, MO 63167, USA

Nicolas Terrapon

6 Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques, Centre National de la Recherche Scientifique és Aix-Marseille Université 13288 Marseille cedex 9, Franciaország

Bernard Henrissat

6 Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques, National National de la Recherche Scientifique és Aix-Marseille Université 13288 Marseille cedex 9, Franciaország

7 Biológiai Tudományok Tanszék, Abdulaziz King Egyetem, Jeddah, Szaúd-Arábia

Andrei L. Osterman

3 Fertőző és gyulladásos betegségek központja, Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute, La Jolla, 92037 CA USA

Jeffrey I. Gordon

1 Genomtudományi és Rendszerbiológiai Központ, Washington Egyetem Orvostudományi Kar, St. Louis, MO 63108 USA

Társított adatok

Absztrakt

A négy emberi bél Bacteroides törzs mindegyikéből előállított több tízezer transzpozon mutáns könyvtárát, amelyek kettő ugyanazt a fajt képviseli, egyidejűleg vezették be a gnotobiotikus egerekbe, 11 másik vad típusú törzzsel együtt, egy 15 tagú mesterséges emberi bél mikrobiota előállításához. Az egerek két külön diéta egyikét kapták monoton, vagy mindkettőt sorrendben. A mutánsok bőségének számszerűsítése a különböző étrend-kontextusokban lehetővé tette az erőnléti tényezők, a rés, a stabilitás és az ellenálló képesség génszintű jellemzését, és egy olyan prebiotikumot (arabinoxilán) eredményezett, amely lehetővé tette a közösség célzott manipulálását. A leírt megközelítés általánosítható, és hasznos lehet a fenntartás szempontjából kritikus mechanizmusok és/vagy az emberi bél mikrobiota és a gazdaszervezet közötti rendkívül adaptív és tartós kapcsolat szándékos újrakonfigurálásához szükséges megközelítések meghatározásában a wellness elősegítésének módjaival.

Az emberi bél mikrobiota nagyon változatos (1–3). A jelenlegi álláspont szerint az egyén korai életében megszerzett törzsek évtizedekig fennmaradnak, és a törzsek megoszlanak a családtagok között. A mikrobiota gyorsan alkalmazkodni tud a változó körülményekhez, de azt, hogy az adott törzskészletek milyen mértékben osztják meg a versenyt a bél ökoszisztémájában található résért, vagy milyen mértékben versenyeznek ezekért, nem tudni. A szervezet fülkéjét meghatározó genetikai tényezők azonosítása fontos a közösség gyülekezését meghatározó mechanizmusok, a közösségi válaszok és a különböző zavarok utáni helyreállítás, valamint a mikrobákat egymással és gazdájukkal összekötő táplálékhálók megértéséhez. Ezeknek a tényezőknek a felfedezése új megközelítéseket eredményezhet a mikrobiota funkcionális tulajdonságainak szándékos manipulálására.

Ez a megközelítés nem csak lehetővé tette számunkra a 15 tagú mesterséges közösség összeszerelésének vizsgálatát, hanem a táplálkozási zavarokra és az ezen zavarok (stabilitás és rugalmasság) utáni helyreállításra adott válaszok jellemzését közösségi szinten, az egyes fajok/törzsek szintjén, valamint a génszint. Meghatározzuk azokat a megosztott, valamint faj- és törzsspecifikus genetikai és metabolikus jellemzőket, amelyek befolyásolják a Bacteroides alkalmasságát a bél környezetében.

Több transzpozon mutáns könyvtár egyidejű jellemzése in vivo (multitaxon INSeq)

A négy baktériumtörzsből előállított könyvtárunk 87 000–167 000 izogén transzpozon (Tn) mutánsból állt. Minden mutáns a Tn elem beillesztésének egyetlen helyét tartalmazta. E négy Bacteroides nyitott olvasási keretének (ORF) 81,5–91,8% -a tartalmazott Tn inszerciót, ami lehetővé tette számunkra, hogy e gének megszakadása nem zárja ki a könyvtárak felépítéséhez használt gazdag közegben való növekedést (az elemzéshez lásd a Kiegészítő Eredményeket). „alapvető” gének, amelyek nem képviseltetik magukat a különféle mutáns könyvtárakban, különös tekintettel a szénhidrát-, aminosav- és vitamin/kofaktor bioszintézisében/katabolizmusában részt vevőkre).

Közösségi gyülekezés, stabilitás és rugalmasság a különféle étrendekre reagálva

Felnőtt (10-12 hetes) hím csíra nélküli C57BL/6J egereket alacsony zsírtartalmú/magas növényi eredetű poliszacharid (LF/HPP) chow-ra vagy olyan étrendre helyeztünk, ahol a kalóriák nagyrészt hidrogénezett zöldségrövidítésből és marhahúsból származnak. faggyú, és ahol a szénhidrátok szacharózra, kukoricakeményítőre és maltodextrinre (pl. egy emészthetetlen cellulóz kötőanyagra) korlátozódtak [magas telített zsír/magas egyszerű cukortartalmú (HF/HS) étrend]. Az étrendeket 7 nappal azelőtt vezettük be, hogy az állatok a mesterséges közösség egyetlen szájon át kapták volna a négy mutagenizált törzs könyvtárat és 11 vad típusú törzset (1A. Ábra). A kontrollkísérletek során minden vad típusú törzsből álló 15 tagú közösséget vagy 15 tagú közösségeket használtak, amelyek csak egyetlen mutáns könyvtárat tartalmaztak (S4A ábra). Az egyedileg ketrecbe helyezett egerek csoportjait az LF/HPP vagy a HF/HS étrenden tartották a kísérlet időtartama alatt, míg más csoportokat reciprok étrend-oszcillációknak vetettek alá (LF/HPP → HF/HS → LF/HPP vagy HF/HS → LF/HPP → HF/HS) (n = 5 egér/diétás kezelés/közösségtípus/gnotobiotikus izolátor; 1A. Ábra). Az egyes kísérletek során összegyűjtött ürülékmintákból előállított DNS rövid leolvasású puskás szekvenálását (COmmunity PROfiling by Sequencing; COPRO-Seq) alkalmaztuk a közösség minden tagjának relatív bőségének meghatározásához.

Összességében tekintve minden mutáns könyvtár a szülői vad típusú törzshez hasonlóan viselkedett a közösségben fennálló arányos bőségét tekintve (S4B. Ábra, S3. Táblázat). Mindkét monoton táplált kezelési csoportban a B. cellulosilyticus WH2 relatív bősége magas volt, bár szignifikánsan nagyobb volt az LF/HPP chow-val etetett állatokban (36 ± 1,6%, szemben 16 ± 3,1% -kal 16 nap után a diétákon; p 2 = 0,676, p = 0,001). A B. cellulosilyticus mutánsok relatív bősége figyelemre méltóan konzisztens volt az egyedileg ketrecbe helyezett egerek között, amelyek monoton táplálékot kaptak egy adott étrenddel, beleértve a különböző gnotobiotikus izolátorokban elhelyezett egércsoportokat is (Student párosítatlan t-tesztje; S6A ábra). Ez a kezelési csoporton belüli konzisztencia fennmaradt, mivel a mutáns populáció konfigurációja az ezt követő 11 napos monoton étrend-fogyasztás során alakult ki [1B. S6B, C; mivel egy adott faj/törzs INSeq könyvtárát hasonlítottuk össze in vivo szelekció után különböző étrendi kezelések során, a nem filogenetikus Hellinger metrikát (11) használtuk a kezelési csoportokon belüli vagy azok közötti könyvtárak közötti különbségek kiszámításához].

A 16 napos monoton étrend-fogyasztás végén összegyűjtött székletminták multi-taxon INSeq-ja 550 HF/HS étrendspecifikus B. cellulosilyticus fittséget meghatározó tényezőt és 34 LF/HPP étrend-specifikus meghatározót eredményezett: az 550 HF/HS étrendből 244- specifikus gének KEGG Orthology (KO) hozzárendeléssel rendelkeztek; ebben a csoportban jelentősen gazdagodtak a KEGG „membrántranszport” kategóriájába tartozó gének (pl. egyik operon vasszállításban, másik foszfáttranszportban), „Kofaktorok és vitaminok metabolizmusa” [például hét gén a kobalamin bioszintézis útja, összhangban azzal a nézettel, hogy a kobalamin és más helyettesített korrinek szintetizálásának és felhasználásának képessége a bélben való túlélés fontos meghatározója (9, 12)] és a „fehérje hajtogatása, válogatása és lebontása” (lásd az S4A táblázatot) e gének funkcionális jelöléseihez és fitnesz mutatóihoz).

A COPRO-Seq-hez használt ugyanazon széklet DNS-minták INSeq-elemzése alkalmat adott arra, hogy egyszerre jellemezzék, hogy a B. cellulosilyticus és a B. ovatus mutánsok összesített gyűjteménye mennyire képes megmaradni és felépülni az étrend zavaraiból (egy INSeq- a rugalmasság és stabilitás alapú meghatározása) és az ilyen gyógyulás változása az állatok között (a sztochaszticitás INSeq alapú mérőszáma). A B. cellulosilyticus WH2 INSeq könyvtár nagy rugalmasságot mutatott a rövid táplálkozási zavarok iránt, abban az értelemben, hogy a könyvtár egésze a kísérlet során fennmaradt, bár egyes mutánsok nem. Ez azonban nem mutatta ugyanazt a stabilitást, mint a 15 tagú közösség; a diéta oszcillációit tapasztalt egereknél a Hellinger-távolságok azt mutatják, hogy a mutánsok könyvtára nem konvergált ugyanabba az állapotba, mint a monoton táplált egerekben, hanem inkább újrakonfigurált populációként fennmaradt. Ez látható a könyvtárak közötti Hellinger távolságban a kísérlet végén, amikor az étrend a variancia 38,7% -át magyarázta, de a diéta és a kezelés közötti kölcsönhatás 35,1% -ot magyarázott (PERMANOVA, p = 0,001, S7B ábra) - a az étrend oszcillációja előtti magyarázó erejénél jóval nagyobb érték (R 2 = 8,2%).

Az alapvető in vivo fitnesz-determinánsok azonosítása négy Bacteroides törzsben

Azok a gének, amelyek a négy Bacteroides törzs között konzerválódtak, és amelyek mindkét táplálkozási környezetben jelentős hatást mutatnak az összes törzs fittségére, meghatározhatók az in vivo fittséget meghatározó tényezők alapvető készletének e nemzetség ezen tagjai számára; mint ilyenek tájékoztatnak bennünket az erőforrások iránti igényekről és a szelektív nyomásról, amelyeket ezek a taxonok tapasztalnak a bélben ebben a közösségi összefüggésben és e két táplálkozási körülmény között.

Olyan étrend-kiegészítő azonosítása, amely specifikusan képes manipulálni a B. cellulosilyticus bőségét

A B. cellulosilyticus WH2 több szénhidrát-aktív enzimmel (CAZYmes) van ellátva, amely a glikán emésztésére szolgál, mint bármely más, eddig szekvenciálisan ismert Bacteroidetes genom (7). 510 CAZYme-jét, amely glikozid-hidrolázokat, poliszacharid-liázokat, szénhidrát-észterázokat és kapcsolódó, nem katalitikus szénhidrát-kötő modulokat tartalmaz, elosztják 113 PUL között. Figyelemre méltó, hogy a 113 PUL-ból csak egy (BcellWH2_04321-4327) működött jelentős fitnesz-meghatározó tényezőként a HF/HS diéta összefüggésében (3A. Ábra). Az ebben a PUL-ban lévő hat génre feltérképezett 127 Tn mutáns fitnesz-mutatói figyelemre méltóan konzisztensek voltak az egyedileg ketrecbe helyezett állatok között az étrendjük függvényében. Ezenkívül, amint azt a fentiekben megjegyeztük, ezeknek a mutánsoknak a relatív bősége magasabb volt azoknál az egereknél, amelyek HF/HS-LF/HPP-HF/HS diétás oszcillációval estek át, mint azoknál az egereknél, amelyek monoton táplálták a HF/HS étrendet (3A. Ábra). Ez a PUL a genomnak a BcellWH2_04292-BcellWH2_04327 átívelő régiójában található, amely három hibrid kétkomponensű rendszert tartalmaz (lásd a Kiegészítő Eredményeket és az S12 ábrát a feltételezett HTCS regulonok elemzéséhez ebben a genomi régióban).

(A) Az INSeq elemzésből kiderül, hogy a PUL BcellWH2_04321-4327 összes génje jelentős fitnesz-indexekkel (z-értékekkel) rendelkezik a HF/HS diéta összefüggésében. A hibrid kétkomponensű rendszer (HTCS) szabályozót kódoló BACWH2_04327 az egyetlen gén ebben a PUL-ban, amely jelentős fitnesz hatással van az LF/HPP étrendre. A PUL-ban lévő gének funkcionális megjegyzései a transzkripciójuk irányával együtt jelennek meg. Az egyes gének fitnesz mutatóit a különböző étrend-összefüggésekben (narancssárga, HF/HS; zöld LF/HPP) ábrázoljuk átlagértékként ± SEM. A vízszintes szaggatott vonal jelzi a szignifikancia határát (p. 3A. Ábra, S12A., B. Ábra). A HF/HS étrend savas hidrolízisének termékeinek GC/MS elemzése kis mennyiségű xilózt és arabinózt mutatott ki (61,2 ± 7,5 ug/g, illetve 62,8 ± 6,2 ug/g). Korábbi in vitro növekedési vizsgálataink a B. cellulosilyticus WH2-ről, amelyet minimális tápközegben tenyésztettek, kiegészítve a 31 különböző szénhidrát-szubsztrát egyikével, valamint a baktérium RNS-Seq elemzését, amely a log-fázis közepén kinyert azokból a minimális táptalajokból, amelyek támogatták a növekedését, kiderült, A PUL-t xilán és arabinoxilán indukálta (7; S13A. Ábra). Az arabinoxilánok egy xilán gerincből készülnek, α-L-arabinóz oldalláncokkal. Tartalmaznak továbbá ferulinsavat és más fenolsavakat, amelyek kovalensen kapcsolódnak hozzájuk észterkötéseken keresztül. A BcellWH2_04321 családtag termékének valószínű szerepe ebben a specifikus PUL-ban a ferul-észterek eltávolítása az arabinoxilánból. A GH10 xilanáz megcélozza a xilan gerincét, míg a GH35 enzim valószínűleg eltávolítja az α-kapcsolt L-arabinóz oldalláncokat (az α-L-arabinóz azonos a β-D-galaktózzal, a C-6 rész kivételével).

A B. ovatus, a mesterséges közösség egyetlen olyan Bacteroides törzse, amely minimális táptalajban képes növekedni, amely egyedüli szénforrásként tisztított arabinoxilánt tartalmaz (S13B ábra), tartalmaz egy PUL-ot (Boavatus_01723-32), amely akkor indukálódik, ha ezt a táptalajt arabinoxilánnal egészítik ki. (vagy xilán) (6). A 15 tagú közösségben élő egerekből gyűjtött székletminták több taxonos INSeq-je azt mutatta, hogy a xilánnal és az arabinoxilánnal indukálható B. cellulosilyticus PUL BcellWH2_04321-27-vel ellentétben ez a PUL nem szükséges a B. ovatusok túléléséhez a HF/HS étrendben. kontextus (azaz a SusC és a xilanáz gének Tn mutánsai nem okoztak jelentős fitnesz hibákat; S13C ábra).

A 14 napos kezelési periódus végén összegyűjtött székletminták COPRO-Seq elemzése kimutatta, hogy az arabinoxilán a B. cellulosilyticus mennyiségének jelentős növekedését eredményezte a HF/HS étrendet tápláló egerekben (korrigált p-érték 3C. Ábra), de nem volt szignifikáns hatása az LF/HPP diéta kontextusában (lásd a 30. napot a 14. naphoz képest a C csoportnál). Összhangban az INSeq eredményekkel, amelyek azt mutatják, hogy a B. ovatusban az arabinoxilán-felhasználás PUL nem fitnesz meghatározó a HF/HS diéta összefüggésében, nem figyeltünk meg jelentős hatást az arabinoxylan kezeléssel e közösség tagjának relatív bőségére (3C. Ábra). Megerősítettük ezeket a megállapításokat egy külön kísérletben, ahol a 15 tagú közösséget hordozó gnotobiotikus egerek két csoportját 56 napig HF/HS étrenddel kezeltük ivóvízük 15% (w/v) arabinoxilán hozzáadásával vagy anélkül. Ebben a nagyobb dózisú, hosszabb időtartamú, monoton étrend-kísérletben a B. cellulosilyticus WH2 mennyisége jelentősen megnőtt (csakúgy, mint a rövid szálú cecalis zsírsavak és a dekonjugált epesavak szintje), míg a B. ovatus nem adott választ (S14A, B ábra ). Az arabinoxilan kezelés nem eredményezett statisztikailag szignifikáns különbséget a teljes testtömegben (Student t-teszt).

Összesen 27 gént azonosítottak a B. cellulosilyticus genomban, amelyek jelentős fitnesz-determinánsként funkcionáltak, amikor az egerek HF/HS étrendet és arabinoxilánt kaptak, de nem akkor, amikor az állatok csak HF/HS étrendet kaptak (S11A táblázat). Ezek a következőket tartalmazzák: (i) az operonban található összes gén (BcellWH2_00893-895), amely szulfotranszferázt és szulfáttranszferázt (EC 3.7.74) tartalmaz, összhangban a dekonjugált epesavak megfigyelt növekedésével, amelyet az UPLC-MS dokumentál, a szekréttartalom (1. ábra). (S14C), és (ii) számos olyan gén, amelyek rávilágítanak arra, hogy az arabinoxilán elérhetőségének növekedése miként növeli az ammónium felhasználásának fontosságát az aminosavak és fehérjék szintézisében ebben a közösségben és az étrendben [ammónium transzporter (BcellWH2_05255), plusz glutamin és glutamát szintetázok ( BcellWH2_5244 és BcellWH2_05271).

Annak ellenére, hogy a B. ovatus nem mutatott szignifikáns változást relatív bőségében, amikor az egerek arabinoxilán-kiegészített vizet kaptak, az INSeq multi-taxon 41 gént tárt fel, amelyek nem voltak fittséget meghatározó tényezők, ha az egerek önmagában fogyasztották a HF/HS étrendet, de „megszerezték” a jelentős z- pontszám, amikor az arabinoxilánt bevezették (a listát lásd az S11B táblázatban). Hét szorosan összefüggő glikoziltranszferáz gént tartalmaz (Bovatus_03504-11), ami arra utal, hogy ez a szervezet megváltoztatja a glikán-felhasználási stratégiáját, amikor arabinoxilánnal találkozik a bélkörnyezetben.

Tájékoztató

Nem tudjuk megkülönböztetni az adott étrend vagy étrend-oszcilláció közvetlen hatását az adott közösség tagjára, és az adott étrend vagy étrend-zavarok elsődleges hatását egy vagy több olyan közösségi tagra, amely kölcsönhatásba lép a taggal/törzzsel, és annak bőségében változásokat mutat. A monokolonizációkra korlátozódhatnánk, hogy megállapítsuk az étrendnek ezekre a tulajdonságokra gyakorolt közvetlen hatásait, de elvesztettük volna képességünket arra, hogy leírjuk ezeket a válaszokat, és megállapítsuk ezen organizmusok réseit egy mikrobiális közösség „természetesebb” környezetében.