Az inzulinfüggő szövetekben az mtDNS kópiaszám és az elhízott betegek endotheliális diszfunkciójának és gyulladásának markerei közötti kapcsolat

Absztrakt

Háttér

A mitokondriumok központi szerepet játszanak az energia-anyagcsere szabályozásában, és a mitokondriumok biogenezisét fokozza a nitrogén-oxid (NO) hatása, amely a vaszkuláris homeosztázis szabályozásában kulcsfontosságú jelátviteli molekula. Az energia-anyagcsere szabályozásának zavara kulcsfontosságú oka lehet az inzulinrezisztencia és a 2-es típusú diabetes mellitus kialakulásának. Ezenkívül a mitokondriális diszfunkció oxidatív stresszhez vezet, ami növeli a proinflammatorikus citokinek termelését. E tekintetben a tanulmány célja az volt, hogy azonosítsa az mtDNS kópiaszámának kapcsolatát a különböző helyeken található zsírszövetekben (szubkután zsírszövet (SAT), mesenterium (Mes), nagyobb omentum (GO)), májbiopsziás mintákban és mononukleáris vérsejtek (MNC-k) endothel diszfunkciós markerekkel (eNOS, ET-1, iCAM-1, vCAM-1, VEGF) és gyulladásos mediátorokkal (TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, leptin) elhízott betegeknél (testtömeg-index (BMI)> 35 kg/m 2) 2-es típusú cukorbetegséggel és anélkül.

Mód

A vizsgálatba 88 elhízott beteget (BMI> 35 kg/m2) vontak be, akiket a kalinyingrádi kórházban kezeltek. A kontroll csoport 20 egészséges donorból állt. Az mtDNS kópiaszám méréséhez csepp digitális PCR-t használtunk. A molekulák (TNF-α, IL-6, IL-8, VEGF, eNOS, ET-1, iCAM-1, vCAM-1, VEGF) koncentrációit a plazmában mértük a következő szendvics-enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatokkal (ELISA-k). ). A leptin mennyiségi meghatározását áramlás-fluorimetriával értékeltük egy «Bio-Plex Protein Assay System» rendszeren. A statisztikai elemzéseket és grafikonokat az R Statistical Software programban (3.3.1 verzió) kaptuk.

Eredmények

Megállapult az elhízás krónikus szubklinikai gyulladásának szisztémás jellege, és a vérplazmában az endothel diszfunkciós molekulák szintjének növekedését figyelték meg. A TNF-a, IL-6 és IL-8 szintje pozitívan korrelált a BMI, a szérum glükóz és a koleszterin szint emelkedésével.

Következtetések

Az mtDNS kópiaszáma a különböző zsírraktárakban magasabb volt 2-es típusú diabéteszes elhízott betegeknél, mint cukorbetegek nélküli elhízott betegeknél vagy a kontroll alanyoknál, és összefüggésben volt a leptin és a gyulladásgátló citokinek szintjével.

Háttér

A mitokondrium vonzó célpont az elhízás és szövődményeinek megelőzésében és kezelésében [1]. A mitokondrium központi szerepet játszik az energia-anyagcsere, a jelátvitel és az apoptózis szabályozásában [2]. A közelmúltban kiderült, hogy a mitokondriumok biogenezisét fokozza a nitrogén-oxid (NO) hatása, amely kulcsfontosságú jelátviteli molekula az érrendszeri homeosztázis szabályozásában, jelezve, hogy az NO termelésében vagy biológiai hozzáférhetőségében bekövetkező változások összefüggésbe hozhatók a a mitokondriumok működése [3]. Az NO és a mitokondrium jelátviteli komponensei, valamint az elhízás anyagcserezavarai közötti kapcsolat a különböző szövetekben még mindig nem világos.

Az inzulinfüggő szövetekben az energia-anyagcsere szabályozásának zavara kulcsfontosságú oka lehet az inzulinrezisztencia kialakulásának [2, 3]. Különösen kimutatták, hogy a mitokondriális diszfunkció oxidatív stresszhez vezet, ami elindítja az érelmeszesedés, a szív- és érrendszeri betegségek és az inzulinrezisztencia kialakulását [4, 5]. Az mtDNS szintjének változásai a perifériás vér leukocitáiban szintén oxidatív stresszhez vezethetnek, és korrelálhatnak a metabolikus szindróma kialakulásával [6]. Korábbi adataink azt mutatják, hogy a mononukleáris vérsejtekben (MNC) csökkent az mtDNS kópiáinak száma, és növekedett a szubkután zsírszövet (SAT) [7].

Ebben a tekintetben a tanulmány célja az volt, hogy azonosítsa az mtDNS kópiaszámának kapcsolatát a különböző helyeken található zsírszövetekben (SAT, mesentery (Mes), nagyobb omentum (GO)), a májbiopsziás mintákban és az endothel diszfunkció markerekkel rendelkező MNC-kben. (eNOS, endothelin-1 (ET-1), intercelluláris adhéziós molekula 1 (iCAM-1), vaszkuláris sejt adhéziós molekula 1 (vCAM-1), vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) és gyulladásos mediátorok (TNF-α, IL) -6, IL-8, C-reaktív fehérje (CRP), leptin) elhízott betegeknél (testtömeg-index (BMI)> 35 kg/m 2) 2-es típusú cukorbetegségben és anélkül.

Anyagok és metódusok

Tanulmányi tárgyak

A vizsgálatba 88 elhízott beteget vontak be, amelyet a kalinyingrádi régió kórházában kezeltek. A kontroll csoport 20 egészséges donorból állt (BMI = 22,3 ± 3,1 kg/m 2), a lipid- és szénhidrát-anyagcsere antropometriai és biokémiai mérésével egészséges tartományban.

A hasi elhízásban szenvedő betegeket a szénhidrát-anyagcsere állapota alapján a következőképpen rangsoroltuk: 54 T2DM-es beteg (BMI = 42,9 ± 8,45 kg/m 2) és 34 T2DM nélküli beteg (BMI = 41,6 ± 4,5 kg/m 2).

A kontrollcsoport és az elhízott betegek 2-es típusú cukorbetegségben vagy anélkül nemben és korban hasonlóak voltak.

A vizsgálathoz használt minták perifériás vénás vér (MNC), zsírszövetek (SAT, Mes és GO) és májszövet voltak. A betegeket a rekonstrukciós és plasztikai sebészeti osztály vezetője, P.A. Zatolokin, Ph.D., a kalinyingrádi körzet regionális klinikai kórházában. A betegeknél a szokásos laparoszkópos műtétek során zsírszöveti biopsziás mintákat vettek. A bariatrikus műtétek elvégzésének technikai folyamatát a bariatriumi sebészek módszertani ajánlásainak megfelelően egységesítették (http://www.ifso.com/ A RYGB-t Lonroth technikával végeztük. A jelen vizsgálat során felhasznált anyagok vénás vérminták voltak, amelyeket reggel éhgyomri betegektől vettek.

Érvényesítés

Az elhízás és a T2DM jelenlétét egy speciális kórházban végzett részletes klinikai és instrumentális vizsgálat alapján állapították meg, az Egészségügyi Világszervezet (1999–2013) kritériumai alapján a cukorbetegség és más típusú hiperglikémia diagnosztizálására. A tájékoztatott beleegyezést minden beteg aláírta. A diagnózis ellenőrzését és a betegek felvételét a vizsgálati csoportokba a rekonstrukciós és plasztikai sebészeti osztályon végezték a kalinyingrádi regionális klinikai kórház alapján.

A vizsgálat lefolytatásához a helyi etikai bizottság engedélyt kapott (a helyi etikai bizottság 2013. október 23-i, az Immanuel Kant Balti Szövetségi Egyetem Innovációs Parkjában tartott ülésének 4. jegyzőkönyve).

Vérkémia

A szénhidrát- és lipid-anyagcsere közvetítőit (glükóz, koleszterin, nagy sűrűségű lipoprotein (HDL), alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL), trigliceridek, CRP) mértük egy CA-180 automatikus biokémiai analizátorral (Furuno Electric Co., Ltd., Japán).

Enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat

A molekulák (TNF-α, IL-6, IL-8, VEGF) koncentrációit a plazmában mértük a következő szendvics enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatokkal (ELISA): Alfa-TNF-IFA-BEST, Interleukin-6-IFA- BEST, Interleukin-8-IFA-BEST, VEGF-IFA-BEST (Vector-Best kits, Oroszország; BIO Vendor, Csehország) Lazurite analizátorban (Dynex Technologies Inc., USA). Az eNOS és az endothelin-1 koncentrációit szérumban/plazmában mértük ELISA Kit for Nitric Oxide Synthase 3 Endothelial (NOS3) (Cloud-Clone Corp., USA) és Endothelin 1–21 kit (Biomedica, Ausztria) segítségével. Az iCAM-1 és a vCAM-1 oldható keringő formáinak koncentrációját szérumban/plazmában mértük 1 humán intercelluláris adhéziós molekula, ICAM-1 ELISA Kit és humán vaszkuláris sejtadhéziós molekula 1, VCAM-1 ELISA kit (Cusabio Biotech Co., Ltd., USA).

Áramlási citometria

A leptin mennyiségi meghatározását áramlásfluorimetriával értékeltük «Bio-Plex Protein Assay System» (Bio-Rad, USA) automatizált lézer analizátorral, Bio-Plex Pro Human Diabetes 10-Plex Assay kereskedelmi tesztrendszerrel (Bio-Rad, USA). . A módszer abból áll, hogy a vizsgált molekulákat megkötik a mikrogömbök (mágneses szemcsék) felületén adszorbeált specifikus antitestekkel, ami lehetővé teszi akár 100 elemző meghatározását egy kútban. Az eredményeket egy automatikus Bio-Plex-200 System mikrolemez fotométer (Bio-Rad, USA) és a Bio-Plex Manager szoftver (Bio-Rad, USA) segítségével olvastuk fel. A leptin-koncentrációkat standard görbe (meghatározott dinamikus tartomány 2–32 000 pg/ml) segítségével határoztuk meg a gyártó utasításainak megfelelően.

Csepp digitális PCR

A zsírszövetekből (SAT, Mes és GO), az MNC-kből és a májszövetből történő DNS-kivonást egy kereskedelmi forgalomban lévő QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, USA) segítségével hajtottuk végre. A minták DNS-koncentrációját Implen NanoPhotometer spektrofotométerrel mértük. Az mtDNS kópiaszámot ddPCR-vel határoztuk meg. A kivont DNS-mintákat ApaI restrikciós endonukleázzal előkezeltük (New England Biolabs, Ipswich, USA). A ddPCR komponensei között volt egy kereskedelmi forgalomban lévő 2x ddPCR Master Mix (Bio-Rad, Pleasanton, USA), fluoreszcens TaqMan szondák és oligonukleotid primerek, és a reakcióelegyet automatikus cseppgenerátorba töltöttük (Bio-Rad, Pleasanton, USA).

Az emulgeált ddPCR-keveréket standard 96 lyukú lemezekre vittük át, és termociklerben (Bio-Rad T100 termoszikler) amplifikáltuk a következő hőmérsékleti protokoll szerint: 95 ° C 10 percig, 40 ciklus 94 ° C-on 30 s-ig és 53 ° C 60 másodpercig, és egy utolsó ciklus 98 ° C-on 10 percig. Az amplifikációs reakció után a fluoreszcencia erősségét QX200 cseppolvasóval (Bio-Rad, Pleasanton, CA) mértük. Az adatokat a QuantaSoft programcsomaggal (1.7.4.0917 verzió) elemeztük. Az mtDNS sejtenkénti abszolút példányszámát az alábbiakban ismertetett módszerekkel számítottuk ki a következő képlet segítségével:

Statisztikai analízis

A kvantitatív indikátoreloszlás normalitásának ellenőrzését Shapiro-Wilk teszttel végeztük. Mivel a vizsgált minták normális eloszlásnak felelnek meg, az átlagos mintaértékek egyenlőségének hipotézisét Student t-tesztjeivel igazolták. A normál eloszlási törvényt be nem tartó független kvantitatív minták közötti különbségek jelentőségének értékeléséhez nemparametrikus Kruskal-Wallis tesztet alkalmaztunk. A csoportok közötti statisztikailag szignifikáns különbségek kimutatásához páronkénti elemzést végeztünk Mann-Whitney teszttel. A különbségeket jelentősnek ítélték meg a o 0,05), normális eloszlása és a diszperziós maradványok konzisztenciája (heteroszkedaszticitási teszt, p-értékek)

Eredmények

Az elhízott betegek lipid anyagcsere-rendellenességek jelei mutatkoznak a 2-es típusú cukorbetegség jelenlétében és hiányában. Magasabb LDL-szintet és alacsonyabb HDL-szintet regisztráltak a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegek csoportjában, mint a kontroll csoportban. A HDL és a triglicerid szintje magasabb volt a 2-es típusú cukorbetegségben nem szenvedő betegeknél, mint a kontrollokban (1. táblázat).

Az elhízott betegek szérumában a CRP tartalma meghaladta a kontroll alanyokét, elérve a maximális értékeket a 2-es típusú cukorbetegségben (1. táblázat).

Minden elhízott páciensnél a proinflammatorikus molekulák - IL-6, IL-8 és TNF-a - szintjének növekedését és a vérplazmában a leptin metabolikus rendellenességeinek markerét figyelték meg a kontroll alanyokhoz viszonyítva (táblázat 2). Ezen tényezők koncentrációja magasabb volt a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedőknél, mint a cukorbetegeknél (2. táblázat).

A 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegek csoportjában a Mes és SAT zsírszöveteiben az mtDNS kópiaszámának növekedését és az MNC-kben az mtDNS csökkenését figyelték meg a kontroll csoportéhoz képest. Ezenkívül az mtDNS kópiaszámának növekedését a GO-ban és az mtDNS csökkenését a májsejtekben 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegeknél találták, összehasonlítva a 2-es típusú cukorbetegséggel nem rendelkező betegekével. Azonban az mtDNS kópiaszáma a vizsgált szövetekben 2-es típusú cukorbetegségben nem különbözött a kontroll alanyokétól.

Vita

Elhízás esetén a krónikus szubklinikai gyulladás szisztémás jellege megállapításra kerül.

A proinflammatorikus citokinek, a TNF-a, az IL-6 és az IL-8 plazmaszintje minden elhízott betegben megemelkedett, és pozitív kapcsolatban álltak egymással (1. ábra) (2. táblázat). Ezenfelül ezen tényezők szintje pozitívan korrelált a BMI-vel, a szérum glükóz- és koleszterinszinttel, a TNF-a és az IL-6 szintje pedig a szérum LDL-koncentrációival. Az általunk talált korrelációk jelezhetik a proinflammatorikus mediátorok domináns szerepét a szénhidrát- és lipid-anyagcsere zavarainak kialakulásában elhízott, 2-es típusú cukorbetegségben és anélkül (1. ábra, 2. táblázat).

A szakirodalomban az adatok kétértelműek az elhízott betegek zsírszövetekben az mtDNS kópiáinak számában bekövetkező változások tekintetében [9]. Vizsgálatunkban az mtDNS tartalma a különböző zsírraktárakban magasabb volt 2 típusú diabéteszes elhízott betegeknél, mint diabétesz nélküli elhízott betegeknél vagy kontroll alanyoknál.

Feltételezzük, hogy az mtDNS példányszámának növekedése a zsírszövetek vizsgált biopsziás mintáiban kompenzációs mechanizmusnak tekinthető, amelynek célja a mitokondrium normális biogenezisének fenntartása oxidatív stressz körülményei között, amelyet a proinflammatorikus citokinek nagy koncentrációja közvetít. Az oxidatív stressz során bekövetkező reaktív oxigénfajok (ROS) káros hatásával elindul a mitokondriális genom replikációs mechanizmusa és az organelle felosztása [10]. A fentieket alátámasztják az SAT-ban az mtDNS száma és az IL-6 (r = 0,3) és a TNF-a (r = 0,4) proinflammatorikus citokinek szintje közötti pozitív korrelációk, valamint az MNC-k mtDNS-je és az IL-6 szintje közötti negatív korrelációk (r = - 0,42) és a TNF-a (r = - 0,33) (o

Következtetések

Elhízott betegeknél (BMI> 35 kg/m 2), függetlenül a 2-es típusú cukorbetegség jelenlététől/hiányától, szisztémás szubklinikai gyulladás és endothel diszfunkció jelei mutatkoztak meg.

A vizsgált szövetekben az mtDNS kópiaszámának növekedése összefüggésben állt az IL-6, IL-8 és TNF-a proinflammatorikus citokintartalom növekedésével a vérplazmában a vizsgált alanyok összes csoportjában.

Az mtDNS kópiaszámának növekedése a vizsgált szövetekben összefüggésben volt a szénhidrát- és lipid-anyagcsere zavarával, valamint az endothelium-1 tartalom növekedésével a 2-es típusú diabéteszes elhízott betegeknél.

Az mtDNS kópiaszámának növekedése a zsírszövetekben (GO, SAT) és az MNC összefüggésben volt a szénhidrát- és lipid-anyagcsere zavarával.