Egy új szerves ásványi komplex megakadályozta a magas hím zsírtartalmú étrend okozta hiperglikémiát, endotoxémiát, májkárosodást és endotheliális diszfunkciót fiatal hím Sprague-Dawley patkányokban

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, vizualizáció, írás - eredeti vázlat

Társadalomtudományi Élettudományi Kar, Arizona Állami Egyetem, Tempe, Arizona, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Konceptualizálás, források, írás - áttekintés és szerkesztés

Tagság: Isagenix International, LLC, Gilbert, Arizona, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, formális elemzés, finanszírozás megszerzése, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, erőforrások, szoftver, felügyelet, ellenőrzés, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - ellenőrzés és szerkesztés

Affiliates School of Life Sciences, Arizona State University, Tempe, Arizona, Amerikai Egyesült Államok, College of Health Solutions, Arizona State University, Phoenix, Arizona, Amerikai Egyesült Államok

Meli’sa S. Crawford,
Eric Gumpricht,
Karen L. Sweazea

Ábrák

Absztrakt

A metabolikus szindróma (MetSyn) prevalenciája 2012 óta 35% -kal emelkedett, és az amerikaiak több mint kétharmada olyan jellemzőket mutat be (elhízás, diszlipidémia, hiperglikémia, inzulinrezisztencia és/vagy endotheliális diszfunkció). A tanulmány célja egy új étrend-kiegészítő szerves ásványi komplex (OMC) ezekre a kockázati tényezőkre gyakorolt hatásainak értékelése volt a MetSyn rágcsálómodelljében. Hat hetes hím Sprague-Dawley patkányokat szokásos chow-val vagy 60% kcal zsírtartalmú, magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) tápláltak 10 hétig. A patkányokat OMC-vel is kezeltük ivóvízükben, 0 mg/ml (kontroll), 0,6 mg/ml vagy 3,0 mg/ml koncentrációban. A HFD-vel kezelt patkányok testtömege szignifikánsan megnőtt (p. 1. táblázat. Az OMC fizikai, kémiai és funkcionális jellemzői.

Morfometria

A testtömeget hetente mértük, hogy értékeljük az étrendre és az OMC kezelésre adott válasz változását. A nasoanalis hosszúságot, a farok hosszát és a has kerületét (közvetlenül a hátsó láb elülső részén) rugalmas mérőszalaggal mértük a 10 hetes vizsgálat végén. Az eutanáziát követően a vért szívpunkcióval vettük fel, a plazmát izoláltuk és -80 ° C-on lefagyasztottuk felhasználásig. Az epididimális zsírpárnát minden állatból kivontuk az adipozitás felmérésére a korábban leírtak szerint [11]. Lee elhízási indexét a testtömeg (g)/nasoanal hossza (cm) × 1000 gyökérgyökérként számoltuk [15, 16].

Glükoregulációs változók

A patkányokat táplálékkal korlátozták, táplálék alikvot adagolásával (2 g/patkány az alapvonalon és 4 g/patkány a 6. és 10. héten) 18 órakor, az éhomi vérvétel előtti este. A következő reggel éhomi vérmintákat (300–500 μL) gyűjtöttünk a farokvénából a kiinduláskor, a 6. és 10. héten. A szérumot ezután elválasztottuk a teljes vértől, és az elemzésekig -80 ° C-on tároltuk. Az éhomi szérum glükózkoncentrációt glükóz-oxidáz módszerrel mértük a kereskedelemben kapható készlet (kat. No. 10009582, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) alkalmazásával a gyártó protokollja szerint. Az éhomi szérum inzulin-koncentrációt egy kereskedelemben kapható készlet segítségével mértük (Cat. No. 90060, Crystal Chem, Elk Grove Village, IL). A kvantitatív inzulinérzékenység-ellenőrző indexet (QUICKI) a következőképpen számították ki: (1/(log inzulin (mU/L) + log glükóz (mM/L)). A QUICKI az inzulinérzékenység validált helyettesítő mértéke, amelyet mind klinikai, mind állatkísérletekben használtak [17 Patkányok vizsgálata kimutatta, hogy a QUICKI az inzulinérzékenység jobb mutatója, mint a HOMA-IR, mivel nem tartalmaz humán specifikus-normalizáló faktort [17].

Az oxidatív stressz és a hepatocita sérülés biomarkerei

A plazma szuperoxid-diszmutáz (SOD) aktivitást a vizsgálat végén mértük kereskedelemben kapható készletekkel (Cat. No. 706002, Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan). A vizelet hidrogén-peroxid- és kreatinin-koncentrációit kereskedelemben kapható készletekkel mértük (katalógusszám: ab102500, Abcam, Cambridge, MA; kat. Szám: CR01, Oxford Biochemical Research, Rochester Hills, MI). A plazma ALT és AST aktivitását a 10 hetes táplálási protokoll végén is megvizsgáltuk kereskedelemben kapható készletekkel (MAK052 és MAK055 katalógusszám; Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

A plazma endotoxinok mennyiségi meghatározása

A plazma lipopoliszacharid koncentrációit egy kereskedelmi forgalomban kapható készlettel (Cat. No. 88282, Thermo Fisher Scientific Rockford, IL) határoztuk meg a gyártó protokollja szerint.

Endothelium-függő értágulat

Az acetilkolin (ACh, 1,0 M, Sigma Aldrich) és a fenilefrin (PE, 1,0 M, Sigma Aldrich) törzsoldatait ioncserélt vízben készítettük, alikvotizáltuk, és felhasználásig -20 ° C-on tároltuk. Az eutanáziát követően középvonalas laparotómiát hajtottak végre a mesenterialis árkád eltávolítására, amelyet azonnal jéghideg HEPES-pufferolt sóoldatra vittek át (mM-ben: 134,4 NaCl, 6 KCl, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2, 10 HEPES és 10 glükóz, pH 7,4 NaOH-val). Az árkádot szilikát bevonatú boncolóedénybe és a mesenterialis rezisztencia artériákba rögzítették (

1mm hosszú; 126 ± 3 μm, i.d.) izoláltunk és HEPES-pufferolt fiziológiás sóoldatot tartalmazó edénykamrába (Cat. No. CH-1, Living Systems Instrumentation, St. Albans, VT) vittünk át. Ezután az izolált artériákat üvegpipettákkal kanilizáltuk, selyem ligatúrákkal rögzítettük, és hosszanti irányban kinyújtottuk, hogy megközelítőleg in situ hosszúságúak legyenek. Az edényeket ezután egy szervo-vezérlésű perisztaltikus szivattyúval (Living Systems Instrumentation) 60 Hgmm nyomásra nyomás alá helyeztük, és az edénykamrát elemzés céljából egy invertált Nikon mikroszkóp színpadára helyeztük. Az edényeket folyamatosan melegítettük (37 ° C) fiziológiás sóoldattal (PSS, mM-ben: 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2PO4, 0,83 MgS04, 19 NaHCO3, 1,8 CaCl2 és 5,5 glükóz) 10 ml/perc sebességgel. . A PSS-t 21% O2, 6% CO2, N2 egyensúlyt tartalmazó gázkeverékkel levegőztették a pH és az oxigénellátás fenntartása érdekében.

Az izolált artériák PSS-ben végzett 30 perces kiegyensúlyozását követően az ereket előre szűkítettük a növekvő PE koncentrációval a szuperfúzióban, amíg el nem érte a nyugalmi belső átmérőjük 50% -át. Az endothelium-függő vazodilatációt úgy értékeltük, hogy az előszűkült artériáknak fokozatosan kitettük az AC-endotélium-függő értágítót (lépésenként 10–9–10-5 M, 3 perc lépésenként), majd kalciummentes PSS oldatot mM: 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2PO4, 19,0 NaHCO3, 5,5 glükóz és 3 EDTA) a passzív belső átmérő mérésére. Az intraluminális átmérőt (i.d.) folyamatosan figyeltük a fényes mezőképek videomikroszkópiájával, éldetektáló edényátmérő rendszerrel (IonOptix, Milton, MA, USA). A vazodilatációt a PE által közvetített érszűkület százalékos megfordulásaként számoltuk.

Western blot elemzések

statisztikai elemzések

Minden adatot átlag ± SEM-ben fejezünk ki. A több időpontban összegyűjtött adatokat (testtömeg, glükóz, inzulin és endothelium-függő értágulat) kétirányú, ismételt ANOVA-mérésekkel elemeztük diétával és OMC-dózissal. A százalékos adatokat az elemzés előtt a normál eloszlás megközelítőleg normál eloszlására transzformáltuk. Az összes többi adatot kétirányú ANOVA-val elemeztük diétával és OMC-dózissal. Ahol jelentős hatásokat észleltek, Tukey posthoc elemzéseket alkalmaztak. A ≤ 0,05 valószínűséget statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Eredmények

Morfometria

A HFD patkányok lényegesen nagyobb súlyt nyertek a megfelelő Chow-táplált kontrollokhoz képest (1. ábra). Hasonlóképpen, az epididymális zsírpárna tömege, a derék kerülete és a naso-anális hossza egyaránt szignifikánsan megnőtt a HFD patkányokban a kontrollokhoz képest, bár a farok hossza nem volt különbözõ a csoportok között (2. táblázat). Lee elhízási indexe nem különbözött szignifikánsan a HFD és a Chow táplált patkányok között, jelezve, hogy a patkányok egyszerűen túlsúlyosak, szemben az elhízottakkal (2. táblázat). Az OMC nem befolyásolta a morfometrikus változót (1. ábra, 2. táblázat).

A patkányokat vagy (A) standard rágcsáló chow-val, vagy (B) 60% kcal zsírtartalmú, magas zsírtartalmú étrendből (HFD) tápláltuk 10 héten keresztül. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Az adatokat kétirányú RM ANOVA-val (SigmaStat 3.0, Systat Software, San Jose, Kalifornia) elemeztük. *p 2. táblázat: Morfometria tíz héten.

Glükoregulációs változók

A patkányok 6 és 10 hetes HFD után jelentős hiperglikémiát alakítottak ki (p. 3. táblázat. A koplalás biokémiai paraméterei.

Az oxidatív stressz biomarkerei

A plazma SOD aktivitás szignifikánsan magasabb volt 0,6 mg/ml OMC-vel kezelt Chow patkányokban, mint az azonos dózissal kezelt HFD-vel táplált patkányok (p = 0,047; 2A. Ábra). Ezt a különbséget valószínűleg a Chow állatok SOD aktivitásának növekedése okozta. A SOD aktivitásában egyéb változásokat nem figyeltek meg. Az OMC-kezelés nélküli HFD-vel táplált patkányok vizeletében a H2O2 koncentrációja szignifikánsan megemelkedett a Chow-táplált kezeletlen állatokhoz képest (p = 0,032). A vizelet H2O2 koncentrációját az OMC nem befolyásolta (2B ábra).

(A) A plazma szuperoxid-diszmutáz (SOD) aktivitása és (B) vizelet-hidrogén-peroxid (H2O2) koncentrációja normalizálódik a vizelet kreatininjére. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki, és kétirányú ANOVA-val elemezzük, n = 6–10 csoportonként a plazma és n = 4–8 csoportonként a vizeletnél. *p 3. ábra: A plazma lipopoliszacharid (LPS) koncentrációja.

Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki, és kétirányú ANOVA-val elemezzük, n = 6–10 csoportonként. *p 4. ábra: Plazma alanin-aminotranszferáz és aszpartát-aminotranszferáz aktivitás.

Plazma ALT (A) és AST (B) aktivitás a 10 hetes diéta után. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki, n = 6–10 csoportonként. Az adatokat kétirányú ANOVA-val elemeztük. #p 5. ábra. OMC-vel kezelt Chow és HFD-vel táplált patkányok artériáinak endothelium-függő vazodilatációja.

Az izolált mesenterialis rezisztencia artériákat a nyugalmi belső átmérő 50% -ára szűkítettük, majd a szuperfúzióban növekvő ACh koncentrációnak tettük ki, hogy a fenilefrin által közvetített értágulat százalékos megfordulását érjük el. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Az adatokat az analízis előtt kétirányú, ismételt ANOVA-mérésekkel transzformáltuk az normális eloszlás megközelítésére. *p 6. ábra: Az eNOS és az iNOS fehérje expressziójának Western blot-analízise OMC-vel kezelt Chow és HFD-vel táplált állatokból izolált mesenterialis artériákban.

A) Az eNOS monomer (140 kDa) fehérje expressziójának denzitometriája. B) Az iNOS (130 kDa) fehérje expressziójának denzitometriája. Az összes densitometriás értéket a β-aktin terhelés kontrollra normalizáltuk, és a Chow kontrollértékek arányában fejeztük ki. Az adatok átlag ± SEM-ként vannak feltüntetve. A grafikonon szereplő számok a mintanagyságokat jelölik (n). * p Laboratóriumunk Met-kutatása megerősítette, hogy a HFD-táplálás elősegíti a MetSyn-asszociált következményekkel összhangban álló tüneteket [11, 12]. Például a 6 hetes hím Sprague-Dawley patkányok etetése a HFD-vel megnövelte a testtömeget és a hasi zsírosságot, károsodott az endothelium-függő értágulat és megemelte az éhomi glükózt. Hasonló megállapításokról számoltak be a Wistar patkányoknál [20, 21], ami alátámasztja a törzsfüggetlen, kóros hasonlóságot a MetSyn étrend által kiváltott modelljében.

A zöldségből és gyümölcsből származó étrendi nitrátokat egyre inkább elismerték kardioprotektív előnyeik miatt [27]. Ezek az előnyök annak a vérnyomáscsökkentő hatásnak tulajdoníthatók, amely az étkezési nitrátok orális kommenzális baktériumok általi nitritekké történő átalakulásából származik [27]. Valójában úgy gondolják, hogy a magas vérnyomás (DASH) diéta diétás megközelítései részben csökkentik a vérnyomást a megnövekedett gyümölcs- és zöldségfogyasztás révén, ami 174 és 1222 mg közötti étrendi nitrátkoncentrációt eredményez [27]. Noha nem tartalmaz friss gyümölcsöt vagy zöldséget, az OMC elemzései azt mutatják, hogy a talajból származó komplex 1230 ppm (mg/l) nitrátot tartalmaz, ami részben megmagyarázhatja az OMC-vel kezelt HFD-vel táplált állatok értágító válaszainak javulását.

Adataink azonban nem támasztják alá az OMC antioxidáns szerepét, mivel ezeket a szinteket a kiegészítő nem befolyásolta. Érdekes, hogy az OMC nem csillapította az oxidatív stresszt. Ez a megfigyelés arra utalhat, hogy az OMC enyhíti a HFD által kiváltott anyagcserezavarok patofiziológiai zavarait nem antioxidáns-függő mechanizmusok révén. Bár maga a fulvosav in vitro antioxidáns tulajdonságokat mutatott [36], az OMC elemzése alacsony általános ORAC pontszámot mutatott ki.

Az ROS, például a H2O2 megemelkedett szintjét összefüggésbe hozzák a máj steatosisának kialakulásával szabad zsírsav peroxiszomális béta-oxidációval [8]. A ROS generációja kiválthatja a hepatociták apoptózisát, elősegítheti a gyulladásos választ és növelheti az ALT aktivitását, amely a májkárosodás egyik fő mutatója [37]. Sőt, mások beszámoltak a májkárosodás és az endotoxémia közötti asszociatív kapcsolatról. Például Kai és munkatársai [38] megfigyelték, hogy az LPS injekciók súlyosbítják a májkárosodást a HFD-vel táplált patkányokban olyan mechanizmusok révén, amelyek a megnövekedett peroxiszóma proliferátor-aktivált receptorokat (PPAR) és a béta-oxidációs enzimeket idézik elő. Továbbá a gyulladásos gének aktiválódnak az adipocitákban a szabad gyökök létrehozásával [39]. Az OMC májvizsgálati és gyomor-bélrendszeri módosító hatásainak a jelenlegi tanulmányban megfigyelt összesített eredményei arra utalnak, hogy a MetSyn ebben a modelljében sokoldalú mechanizmusok járulnak hozzá annak általános előnyeihez.

A jelenlegi vizsgálat korlátja az egyes csoportok kis mintamérete volt, ami korlátozottan értelmezheti az eredményeket. Az ex vivo vazodilatációs vizsgálatok korlátai között szerepelt az NO-ra adott endothelium-független válaszok mérésének hiánya nitrogén-oxid donor, például nátrium-nitroprussid alkalmazásával, valamint az oxidatív stressz szerepének mérése az értágító válaszban az egyes kezelések során. A jelenlegi vizsgálat egyéb korlátai közé tartozik a válasz csak hím rágcsálóknál történő vizsgálata, valamint a vérnyomásra és az ételbevitelre vonatkozó adatok hiánya.

Összefoglalva, a jelen tanulmány kimutatta, hogy az OMC, egy új és egyedülálló talajból származó termék, megakadályozta a HFD által kiváltott metabolikus diszfunkcióval járó számos szövődményt. Feltételezzük, hogy a szerves savak, nyomelemek, nitrát- és ásványi anyag-összetétel kombinációja együtt működik ebben a védelemben nem antioxidáns mechanizmusok révén.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetet mondanak William Clarknak, Ashlee Starr-nak és Anthony Basile-nak a technikai és állattenyésztési segítségért. A szerzők köszönetet mondanak Morgan Nelsonnak is a Western blot elemzésekhez nyújtott segítségért.