Funkcionális EF-kezek a GCAP2 neuron kalciumérzékelőben meghatározzák foszforilációs állapotát és szubcelluláris eloszlását In Vivo, és elengedhetetlenek a fotoreceptor sejtek integritásához

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Natalia López-del Hoyo, Santiago López-Begines

Tagság Bellvitge Orvostudományi Kutató Intézet (IDIBELL), Barcelona, Spanyolország

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Natalia López-del Hoyo, Santiago López-Begines

Tagság Bellvitge Orvostudományi Kutató Intézet (IDIBELL), Barcelona, Spanyolország

II. Fiziológiai Tudományok Tanszéke, Barcelona Egyetem-Bellvitge Egészségtudományi Campus, Barcelona, Spanyolország

Sejt- és neurobiológiai osztály, Zilkha Neurogenetikai Intézet, Keck Orvostudományi Egyetem, University of Southern California, Los Angeles, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Társulások Bellvitge Orvostudományi Kutató Intézet (IDIBELL), Barcelona, Spanyolország, Kórtani és Kísérleti Terápiás Tanszék, Barcelona Egyetem-Bellvitge Egészségtudományi Campus, Barcelona, Spanyolország

Natalia López-del Hoyo,
Santiago López-Begines,
Jose Luis Rosa,
Jeannie Chen,
Ana Méndez

Javítás

2014. október 17 .: A PLOS Genetics Staff (2014) korrekció: Funkcionális EF-kezek a GCAP2 neuronális kalciumérzékelőben meghatározzák annak foszforilációs állapotát és szubcelluláris eloszlását In Vivo, és elengedhetetlenek a fotoreceptor sejtek integritásához. PLOS Genetics 10 (10): e1004744. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004744 Javítás megtekintése

Ábrák

Absztrakt

Szerző összefoglalása

Idézet: Hoyo NL-d, López-Begines S, Rosa JL, Chen J, Méndez A (2014) Funkcionális EF-kezek a GCAP2 neuronális kalciumérzékelőben meghatározzák annak foszforilációs állapotát és szubcelluláris eloszlását in vivo, és elengedhetetlenek a fotoreceptor sejtek integritásához. PLoS Genet 10 (7): e1004480. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004480

Szerkesztő: Bruce A. Hamilton, Kaliforniai Egyetem, San Diego, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2013. augusztus 21 .; Elfogadott: 2014. május 17 .; Közzétett: 2014. július 24

Finanszírozás: Az AM elismeri a spanyol gazdasági és versenyképességi minisztérium (MINECO) finanszírozását: BFU2008-04199/BFI, BFU2011-26519/BFI, PRI-PIBIN-2011-1151; az Európai Közösség részéről: MIRG-CT-2007-210042; és az ONCE Alapítványtól. Az NLdH az IDIBELL PhD program elődoktori ösztöndíját kapta. A JC-t az Országos Egészségügyi Intézet (EY12155) és a Beckman Initiative for Macular Research támogatja. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Annak ellenére, hogy a GCAPs által közvetített Ca 2+ -visszajelzés fontos a cGMP szintézis szempontjából az érzékenység szabályozásában, a GCAP1 és a GCAP2 törlése egerekben nem vezet jelentős hatással a retina morfológiájára, jelezve, hogy a GCAP-k nem elengedhetetlenek a retinaszervezet [11]. A GCAP1 és GCAP2 gének mutációit azonban összekapcsolják az öröklődő autoszomális domináns retinopátiákkal. A GCAP1-et kódoló GUCA1A gén tíz heterozigóta mutációját kapcsolták össze autoszomális domináns kúp dystrophiával (adCD), kúp rúd dystrophiával (adCRD) vagy makula degenerációval (adMD) [12] - [20]. A GUCA1B gén egyik mutációja, a G157R, összefüggésbe hozható az autoszomális domináns retina dystrophiákkal, a retinitis pigmentosától a makula degenerációig [21].

A GCAP1 mutációk többsége az EF-kéz doménjein térképez fel, és közvetlenül befolyásolja a Ca 2+ koordinációt, például a D100E és az N104K az EF-3-nál vagy az L151F és az E155G az EF-4-nél [13] - [15], [20], vagy a az EF-3 és EF-4 bejövő vagy kimenő α-hélixjei, például az E89K, Y99C, T114I, I143NT és G159V, olyan konformációs torzulásokat okozva, amelyek a Ca 2+ kötődést kevésbé kedvezővé teszik [15], [17], [18] . Ezek a mutációk a GC-aktiváció Ca 2+ IC50-jét magasabb szabad [Ca 2+] szintre tolják, így in vitro a mutáns fehérjék nem tudnak gátló állapotba kapcsolni, és a RetGC perzisztens aktivációjához vezetnek a [Ca 2 teljes fiziológiai tartományában. +] i [15], [20], [22] - [24]. Az in vivo, amint azt az Y99C és E155G GCAP1 mutációk esetében kimutatták, a csillapíthatatlan cGMP szintézis abnormálisan magas cGMP és Ca 2+ szintet eredményez a rudakban, és az ezt követő retina degeneráció jelentősen megakadályozható olyan körülmények között, amelyek elősegítik a PDE6 konstitutív stimulálását, mint pl. állandó fényterhelés [23], [25], [26].

Vannak a GCAP-ok olyan aspektusai, amelyek továbbra sem érthetőek, például a Ca 2+ -függő strukturális változások vagy a sejtek eloszlását meghatározó mechanizmusok. A GCAP1 és a GCAP2 egyaránt mirisztoilezett az NH2-terminálison. Míg a GCAP1 myristoylation nem csak a GCAP1 Ret-GC és Ret-GC maximális aktiválódás iránti affinitását, hanem az EF-4-nél növeli a Ret-GC gátlás Ca 2+ érzékenységét is [27], a GCAP2 myristoylationja befolyásolja annak általános szerkezeti struktúráját stabilitás a Ret-GC szabályozásának befolyásolása nélkül [28]. A GCAP1 és a GCAP2 egyaránt homodimereket képez a Ca 2+ disszociációja során, a GCAP2-ben dimerizáló képesség korrelál a Ret-GC aktiválásának képességével [29]. Míg azonban a GCAP2-ben a dimerizációt megfordítja a Ca 2+ kötés, a GCAP1 dimerizáció ellenáll a Ca 2+ jelenlétének, ami különbséget jelent a Ca 2+ -függő konformációs változásaikban [29]. Összességében elmondható, hogy a GCAP2 Ca 2+ mentes formája nagyobb aggregációs hajlamot mutat, mint a GCAP1. Ezenkívül a GCAP2 Ca 2+ -függő konformációs változásai korrelálnak a Ser201 helyspecifikus foszforilációjával, amelynek jelentősége még nem egyértelmű, mivel in vitro nem befolyásolja a Ret-GC szabályozást [30].

Sejt lokalizációjukat tekintve a GCAP1 a kúpnál bőségesebb, mint a rúd külső szegmenseinél [31]. A GCAP2 elsősorban a rudakra lokalizálódik, alacsonyabb szinteken pedig a kúpokban. A rudakban a GCAP2 lokalizációja nem korlátozódik a rudak külső szegmenseire. Körülbelül azonos szinten van a rúd belső szegmenseiben, alacsonyabban pedig a sejt proximálisabb rekeszeiben [32], [33]. A szinaptikus terminálon kimutatták, hogy a GCAP2 kölcsönhatásba lép Ribeye-vel, a szinaptikus szalagok fő szerkezeti komponensével, és in vivo túlzottan kifejezve [34], [35] a szinaptikus szalag dinamikájának jelentős változásaihoz vezet. A GCAP-k szubcelluláris eloszlását meghatározó mechanizmusok nagyrészt ismeretlenek, de azt javasolták, hogy a GCAP-kat a Retikuláris GC-k által irányított vezikuláris kereskedelem szállítsa az RD3 által támogatott folyamatban [36], [37].

Eredmények

A bEF - GCAP2 transzgenikus expressziója egérrudakban progresszív retina degenerációhoz vezet

A funkcionális EF-kéz domének relevanciájának vizsgálatához a GCAP2-ben a fehérje aktivitás és a fotoreceptor sejtek integritása szempontjából in vivo a GCAP2 mutáns formáját fejeztük ki inaktivált EF kezekkel: GCAP2 (E80Q/E116Q/D158N), a továbbiakban bEF - GCAP2, transzgenikus egerek rúdfotoreceptoraiban (1A. ábra). Korábban kimutatták, hogy a három funkcionális EF kéz inaktiválása a bGCAP2-ben megszünteti a Ca 2+ megkötő képességét [38]. Transzgénikus egerek előállításához kifejlesztettük a szarvasmarha GCAP2 izoformájának cDNS-jét, így a transzgénterméket SDS-PAGE elektroforetikus mobilitással lehetett megkülönböztetni az endogén egér formától. Hogy megkülönböztessük a GCAP2 mutációinak hatását a GCAP2 túlzott expressziójának a sejtre gyakorolt hatásától, a vizsgálatba egy kontroll transzgenikus vonalat vontunk be, amely a vad típusú szarvasmarha GCAP2-t expresszálja (E vonal, 1A, B ábra). Beszámoltak arról, hogy ez a vonal a vad típusú szarvasmarha GCAP2-et expresszálja ~ 2∼1 arányban az endogén GCAP2-hez viszonyítva [11].

Két független transzgenikus vonalat hoztunk létre, amelyek a bEF - GCAP2 különböző szintjét fejezték ki. Az A vonal a bEF-GCAP2-t 2,76 2.1 arányban fejezte ki az endogén GCAP2-hez viszonyítva, míg a B vonal magasabb relatív expressziós szinttel (3,85∶1 arány) rendelkezett, az 1B. Ábra és az S1 ábra, lásd: Módszerek.

Annak értékelésére, hogy a rudakban a bEF-GCAP2 expresszió kompenzációs változásokat okoz-e a cGMP metabolizmusban részt vevő más fehérjék expressziós szintjeiben, összehasonlítottuk a PDE6 és Ret-GC expressziójának szintjét vad típusú retinahomogenátumokban, valamint az A és B vonalak transzgénikus egereiben ( Ábra 1C). A PDEα, β és γ alegységek, vagy a GC1 és GC2 szintjei többnyire nem voltak hatással az A vonalú egerekben, míg a postnatalis 22. napon az összes fehérje csökkenését figyeltük meg a B vonalban (p22), ami a drámai rövidüléssel és a rúd külső szegmenseinek dezorganizálódása nagyon korai életkortól kezdve megfigyelhető ebben a vonalban (1D. ábra).

A bEF-GCAP2-t expresszáló egerek progresszív retina degenerációt mutattak, amelynek súlyossága korrelált a transzgén expressziójának szintjével. Az 1D. Ábra a normál retina morfológiáját mutatja a kontroll transzgenikus E vonalon p40-kor és 3 hónapos korban. Ezzel szemben a retina degeneráció egyértelmű jeleit figyelték meg azoknál az egereknél, amelyek az A és B vonalakból származó bEF - GCAP2-t expresszálták. A B vonalból származó egerek, amelyek a legmagasabb bEF - GCAP2 szintet fejezik ki, a rúd külső szegmenseinek jelentős rövidülését és a a külső magréteg (ONL) vastagsága már p40-ben, az ONL vastagsága 6–7 magsorra csökkent. Az A vonalból származó egereknél a betegség lassabban halad, 3 hónapnál észrevehető, amikor az ONL vastagsága 7–9 magsorra csökken.

Mivel a vad típusú bGCAP2 expressziója egy éven át nem okozott retina degenerációt az E vonalon (az eredményeket nem mutatjuk be), az A és B vonalakból származó egerekben megfigyelt retina degeneráció valószínűleg a GCAP2 mutáns formájának megkülönböztető tulajdonságaiból következik, megköti a Ca 2+ -ot. A különböző transzgén expressziós szintek miatt azonban nem zárhattuk ki, hogy a megfigyelt fenotípus a bGCAP2 túlzott expressziójából származhat. Ennek a lehetőségnek a kizárása érdekében az E kontrollvonalat homozigóta állapotba hoztuk, hogy olyan vonalat kapjunk, amely a bGCAP2-t az A mutáns vonallal egyenértékű szintnek fejezte ki. Ez a vonal normál külső szegmenshosszúságot és szervezettséget, valamint normál külső magréteg-vastagságot mutatott felfelé. hat hónapos korig, amikor ciklikus fényben nevelik [34]. Ezen eredmények alapján arra a következtetésre jutunk, hogy a GCAP2-ben a Ca 2+ kötődését károsító mutációk in vivo retina degenerációhoz vezetnek.

A retina degenerációja a bEF - GCAP2 segítségével a GCAP -/- háttérben reprodukálódik, és korrelál a vizuális funkció elvesztésével

Annak érdekében, hogy tanulmányozzuk a mutáns fehérje sejtfiziológiára gyakorolt hatását, a transzgénikus vonalakat GCAPs -/- egerekbe tenyésztettük, hogy a bEF - GCAP2 vagy a kontroll bGCAP2 expresszióját kapjuk endogén fehérje hiányában.