Az elhízás megváltoztatja a bél mikrobiális ökológiáját

Közreműködött: Jeffrey I. Gordon, 2005. június 14

Absztrakt

Elemeztünk 5 088 bakteriális 16S rRNS génszekvenciát genetikailag elhízott ob/ob egerek, sovány ob/+ és vad típusú testvérek, valamint ob/+ anyáik disztális bél (cecalis) mikrobiotájából, és mindegyiküket ugyanazt a poliszacharidban gazdag étrendet etették . Noha az egér bélfajainak többsége egyedi, az egér és az emberi mikrobiota (k) hasonlóak az osztódás (szuperkirályság) szintjén, a Firmicutes és a Bacteroidetes dominál. A mikrobiális-közösségi összetétel az anyáktól származik. A sovány egerekhez képest és rokonságtól függetlenül az ob/ob állatok 50% -kal csökkenték a Bacteroidetes bőségét és a Firmicutes arányosan növekednek. Ezek a megosztottságra kiterjedő változások azt jelzik, hogy ebben a modellben az elhízás befolyásolja a bél mikrobiota sokféleségét, és arra utalnak, hogy a közösség szerkezetének szándékos manipulálása hasznos lehet az elhízott egyének energiaegyensúlyának szabályozásában.

Bár az elhízás kiváltó oka a túlzott kalóriabevitel a ráfordításokhoz képest, a bél mikrobiális ökológiájának különbségei az emberek között fontos tényezők lehetnek az energia homeosztázisban; azaz az elhízásra hajlamos egyének bélmikrobiális közösségekkel rendelkezhetnek, amelyek elősegítik az adott étrendből származó energia hatékonyabb kinyerését és/vagy tárolását, összehasonlítva a sovány egyének ezen közösségeivel. Ez a hipotézis számos alapvető kérdést vet fel az emberek és egerek bélmikrobiális ökológiájával kapcsolatban. Például hogyan hasonlítják össze a két gazda disztális bél mikrobiotáját? Fontos szerepet játszik-e a rokonság a mikrobaközösség összetételében? Befolyásolja-e az adipozitás a közösség szerkezetét, és ha igen, milyen taxonómiai szinten jelentkeznek ezek a hatások, és tükrözik-e a mikrobiota és a gazda energiamérlege közötti homeosztatikus visszacsatolás eddig nem értékelt formáját?

Bár az információk korlátozottak, a baktériumok sokféleségének jelenlegi koncepciója az emberi bélben az, hogy van egy korlátozottan alkalmazkodó baktériumokból álló készlet, amely valószínűleg a közvetlen családtól öröklődik, és valószínűleg a gazda genotípusa szerint szűrhető (5 Vizsgálatokra van szükség az emberi bél mikrobiális sokféleségét szabályozó szabályok jellemzéséhez. Figyelemre méltó, hogy a bél mikrobiota átfogó felsorolásáról még nem számoltak be a Mus musculus esetében, annak ellenére, hogy ez az emlősfaj nagyon vonzó modellt kínál a gazda genotípusának, az anyai expozíciónak, az étrendnek és az energiamérlegnek a bél mikrobiális ökológiájában betöltött szerepének szisztematikus feltárására. Ezért ebben a jelentésben C57BL/6 egereket használunk, amelyek homozigóta egy mutációra a leptin génben (ob/ob), amely sztereotip, teljesen behatoló elhízási fenotípust (6, 7), valamint sovány ob/+ és +/+ testvérek, annak bemutatására, hogy a distalis bélben a mikrobiális közösség összetétele az egész adipozitásra reagálva az egész divízió szintjén változik. Ez a megállapítás újabb perspektívát nyújt a bél mikrobiota és a gazda energiamérlege közötti kapcsolatról.

Anyagok és metódusok

Állatok. A C57BL/6J ob/+ anyákat és ob/ob, ob/+ és +/+ utódaikat 12 órás fényciklus alatt, meghatározott kórokozóktól mentes állapotban nevelték. Az elválasztott és a felnőtt egereket PicoLab chow-diétával (Purina) ad libitum táplálták. Az egerekkel végzett összes kísérletet a Washingtoni Egyetem Állattanulmányi Bizottsága által jóváhagyott protokollok szerint hajtották végre. Valamennyi állatot leölték a nap egy időben.

16S rRNS gének PCR-amplifikációja. A Cecát az egerek leölése után azonnal helyreállították. Minden ép vakbél tartalmát kézi extrudálással nyertük ki, és felhasználásig azonnal (-80 ° C) lefagyasztották. Mindegyik minta fagyasztott alikvot részét (~ 100 mg) adtunk csövekhez, amelyek 500 μl extrakciós puffert (200 mM Tris, pH 8,0/200 mM NaCl/20 mM EDTA), 210 μl 20% SDS-t, 500 μl fenolt tartalmaztak: kloroform: izoamil-alkohol (24: 24: 1) és 500 μl 0,1 mm átmérőjű cirkónia/szilícium-dioxid gyöngyök (BioSpec Products, Bartlesville, OK). A mikrobiális sejteket mechanikusan 23 ° C-on gyöngyverővel (BioSpec Products; műszer 2 percre magasra állítva) megszakítottuk. Az izolált DNS-t elektroforézissel 1% -os agaróz géleken frakcionáltuk, és a domináns sávot MiniElute Gel Extraction kit (Qiagen) segítségével megtisztítottuk.

Minden egér esetében öt ismételt 25 μl PCR-t hajtottak végre, amelyek mindegyike 100-200 ng tisztított genomi DNS-t, 100 mM Tris-t (pH 8,3), 500 mM KCl, 20 mM MgSO4, 200 μM dNTP-t, 200 μM baktériumkoncentrációt tartalmazott. 8F specifikus primer (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′), az 1391R univerzális primer 200 μM koncentrációja (5′-GACGGGCGGTGWGTRCA-3 ′) (8), 1 M betain, 800 μg/ml BSA és 1 egység Taq polimeráz (Invitrogen). A kerékpározás körülményei 2 percig 94 ° C-on, majd 20 ciklus 94 ° C-on 1 percen át, 55 ° C-on 45 másodpercig és 72 ° C-on 2 percen keresztül, a végső meghosszabbítási idő pedig 20 perc 72 ° C-on. Az ismételt PCR-eket egyesítettük. A kapott 1,3 kb méretű amplikonokat Qiagen extrakciós készlet alkalmazásával gélen tisztítottuk, majd TOPO TA pCR4.0-ba szubklónoztuk, majd Escherichia coli TOP10-be (Invitrogen) transzformáltuk. Az extrakciós kontrollok (cecalis anyag hozzáadása nélkül) nem eredményezett kimutatható PCR-termékeket vagy telepeket. Minden egér esetében 384, klónozott amplikonokat tartalmazó telepet dolgoztunk fel szekvenálás céljából. A plazmid inszerteket kétirányban szekvenáltuk vektor-specifikus primerek alkalmazásával.

Szekvencia összeállítás, igazítás és robbanás . A 16S rRNS génszekvenciákat szerkesztettük és konszenzus szekvenciákká állítottuk össze [phred és phrap szoftvercsomagok, az xplorseq (9) program segítségével. A nem összeállított szekvenciákat elvetették. A arbr igazítás és a fa phrap minőségi pontszámú alapjai elérhetők a http://gordonlab.wustl.edu/mice címen; Az 1. táblázatban felsorolt szekvencia-megnevezéseket, amelyeket alátámasztó információként a PNAS webhelyén teszünk közzé) összehasonlítottuk a 47 210 szekvenciás Ribosomális Adatbázis Projekt (RDP-II) 9. kiadásával (10) és egy 11 831 szekvenciájú emberi vastagbél baktérium adatsorral. (11) a robbanás program használatával (12).

A konszenzus szekvenciákat az arb szoftvercsomagban [www.arb-home.de (14)]> 10 000 kicsi alegységű rRNS-szekvencia (a 13. hivatkozásban leírt adatbázis kibővített változata) adatsorához igazítottuk. az arb autoaligner és a kézi kezelés. A 16S rRNS molekula hipervariábilis régióit figyelmen kívül hagytuk az arb adatbázissal ellátott „lanemaskPH” szűrő használatával (13). Igazított szekvenciákat adtunk az arb szomszéd csatlakozó fához (páros távolságok alapján, Olsen-korrekcióval) a parsimony beszúró eszközzel. A rossz elemzésű belső régiókkal történő szekvenciákat, amelyek igazítási problémákhoz vezetnek, kizártuk a további elemzésből.

Egér közösségi klaszterezése unifrac . Egy filogenetikus fát, amely csak a tanulmány 16S rRNS-szekvenciáját tartalmazza, exportáltuk az arb-ból, és az egyes szekvenciákhoz feljegyeztük a származási egér megjelölését. A filogenetikai fában található információkat használtuk az egerek baktériumközösségei közötti különbség mérésére az unifrac metrika segítségével. A teljes elágazás hosszát kiszámítottuk az egér minden egyes baktériumközösségében, amely a fában volt. Ezután minden lehetséges egérpár esetében meghatároztuk a két közösség által megosztott és az egyes közösségekre (az unifracokra) jellemző teljes elágazás hosszának a részét. Az unifrac a közösségek összehasonlításakor méri a 16S rRNS szekvenciák közötti divergencia mértékét, anélkül, hogy a szekvenciákat filotípusokhoz rendelnék (a hozzárendelés szükséges lépés, ha hagyományos közösségi ökológiai indexeket használnak, és elmoshatja a szekvenciák közötti különbségeket, ha egyenlő kategóriákként kezelik őket).

Az unifrac metrika két permutációját használtuk. Az első permutáció a mintában jelen lévő 16S rRNS-szekvenciákat elemzi, tekintet nélkül azok bőségére. A második permutáció súlyozza az elágazás hosszát, az egyes egerek szekvenciáinak relatív bősége alapján. A két permutációt külön alkalmazva csoportosítottuk az egyes állatok baktériumközösségeit a súlyozatlan pár-csoport módszerrel, aritmetikai átlaggal. A fa specifikus csomópontjainak robusztusságát, az egyes egerek jelenlétére vagy hiányára, valamint a mintavételi lefedettségre való tekintettel jackknifing segítségével teszteltük. Mindkét unifrac permutáció esetében elvégeztük a fő-koordináták elemzését, majd az első két fő koordináta ANOVA-jával meghatároztuk az anya identitásának és ob genotípusának a közösség összetételére gyakorolt hatását.

Megvizsgáltuk a genotípus hatását a baktériumok két legjobban képviselt osztódásának, a Bacteroidetes és Firmicutes bőségére is, kontrollálva a rokonságot és a nemet. Az egyes osztályokhoz tartozó szekvenciákat arb-ban számoltuk, és kiszámítottuk az egyes egerekben képviselt osztások százalékos arányát.

Valamennyi adatot az ANOVA előtt valószínűségi diagramokkal ellenőriztük. Az ANOVA-t modell-összehasonlító megközelítéssel (15) végezték a proc glm és a kontrasztkódok programjának felhasználásával a sas szoftvercsomagban (8. verzió, SAS Institute, Cary, NC). P ≤ 0,05-es határértéket használtunk arra, hogy jelezzük a szignifikáns hatást a II-es típusú SS-re (azonos cellaméret) és a III-as típusú SS-re (az egyenlőtlen cellaméret).

Taxonkosarak és Chao-Jaccard bőségalapú hasonlósági indexek. Távolsági mátrixot hoztak létre arb-ban, kizárva a 16S rRNS-molekula hipervariábilis régióit, mert azok nem illeszthetők egymáshoz. A szekvenciákat taxonokba illesztettük, páros szekvenciaazonosság alapján, az alsó végén 86-99% -os vágási határokkal. A Chao-Jaccard bőségen alapuló hasonlósági indexet (16) használtuk az összes lehetséges egérpár összehasonlításához minden taxon szinten (azaz 86% és 99% közötti azonosság) a programbecslések felhasználásával (7.5 verzió; fejlesztette: RK Colwell) (http://purl.oclc.org/estimates).

Eredmények és vita

A Firmicutes és Bacteroidetes dominanciája az egerek távoli belekben. A C57BL/6J ob/+ párzás utódait és három anyjukat vizsgálták. Az 1. és 3. anya (M1 és M3) különböző almokból származó testvérek voltak. Az M2 két almot készített, a másodikat közvetlenül az első után. Az újszülött egereket az anyjukkal és az alomtársakkal együtt elválasztásig, a harmadik posztnatális héten nevelték. Az egereket ezután egyedül, mikroizolátor ketrecekben helyezték el, egészen 8. hét korukig, amikor megölték őket. Az anyákat 1 év múlva, 4 hónappal az almaik megölése után ölték meg. A testvéreket és az anyákat ugyanolyan szokásos, poliszacharidokban gazdag rágcsáló-chow étrendben táplálták.

A korábbi vizsgálatokkal összhangban az ob/ob egerek 42 ± 4% -kal több chow-t fogyasztottak, mint sovány ob/+ és +/+ testvéreik (P 88%) a Bacteroidetes-hez tartoznak a Bacteroidetes 4b-hez, amelyből hiányzik a tenyésztett képviselő (11). Az emberi vastagbél mikrobiotában alacsony szinten található fehérjék és aktinobaktériumok, valamint a korábban az emberi szájban (íny) található mikrobiotában azonosított TM7, amelyek mindegyike az egér cecalis baktériumközösségének ≤ 1% -át tette ki.

A cianobaktériumok mélyen elágazó kládja az egerek és más állatok belében. A fent leírt osztódások mellett egy olyan baktériumcsoport tagjait is megtaláltuk, amelyeket korábban emberi és más állati bélekben mutattak ki (1C. Ábra), de filogenetikailag nem jellemezték őket. Elemzésünk egy koherens, bélhez kapcsolódó kládot tárt fel, amely a Cyanobacteria mélyén gyökerezik, egy olyan osztódás, amelynek tagjai oxigénes fotoszintézist végeznek. Ez a csoport a nem fotoszintetikus ősi cianobaktériumok leszármazottait képviselheti, amelyek alkalmazkodtak az állatok gyomor-bél traktusainak életéhez. Számos más, világosság nélküli környezetből származó szekvencia társult a bélkláddal. Ezen mélyen gyökerező cianobaktériumok genomjának szekvenálása fényt deríthet a nagy oxigénellátási eseményre, amely ~ 2,2 milliárd évvel ezelőtt történt, amikor a cianobaktériumok alaposan megváltoztatták a Föld légkörének kémiai tulajdonságait.

A rokonság erősen befolyásolja a mikrobiális sokféleséget. Ezután összehasonlítottuk az egerek baktérium-közösség összetételét, nemrégiben kifejlesztett számítási módszerek alkalmazásával, amelyek meghatározzák az egyes állatok számára egyedi filogenetikai fán az ág hosszának a részét (unifrac metrikus; lásd Anyagok és módszerek). Az unifrac metrika két permutációját használtuk: Az első csak azokat a taxonokat veszi figyelembe, amelyek jelen vannak, bőségüktől függetlenül; a második súlyok elágazási hosszai az egyes egerek szekvenciáinak relatív bősége alapján (lásd: Anyagok és módszerek, Támogató eredmények, valamint 3. és 4. ábra, amelyeket alátámasztó információként tesznek közzé a PNAS webhelyén, és amelyek bemutatják az unifrac alkalmazását a 11 831 tagú emberi vastagbél adathalmaz).

Az unifrac módszereket alkalmazták a rokonság és a genotípus sokféleségre gyakorolt hatásának tesztelésére, standard többváltozós és paraméteres statisztikákkal (fő-koordináták elemzése és a súlyozatlan pár-csoport módszer aritmetikai átlaggal és ANOVA alkalmazásával a fő koordinátákra). Az eredményeket a közösségi hasonlóság elemzésével alátámasztottuk, amely figyelembe veszi a mintavételi lefedettséget és a „nem látott” taxonokat. Ezt a megközelítést, a Chao-Jaccard bőségen alapuló hasonlósági indexet (16) alkalmazták a taxonokra, amelyeket a 16S rRNS szekvencia azonossági küszöbök határoltak, amelyek 86% és 99% között mozogtak.

Az eredményekből kiderült, hogy az anyák és utódaik hasonló közösségi tagsággal rendelkeznek a cecalis mikrobiotákban, függetlenül ob genotípusuktól. Ez a tulajdonság mindkét generáció számára érvényes volt; azaz a testvérek (M1 és M3) anyák hasonló összetételű mikrobiótákat osztottak, utódaik (unokatestvéreik) mikrobiotái hasonlóak voltak. Ráadásul az azonos anyától származó két alom (M2) mikrobiotikájának összetétele nem volt szignifikánsan különbözõ, míg az M2 család összetétele szignifikánsan különbözött az M1/M3 családtól (a rokonság hatása P 0,67-re jelentõs, ami a csomópont jelenléteinek száma, amikor minden egérből véletlenszerűen 200 szekvenciát választottak n = 100 ismétléshez, kivéve az M2A-1 és M2A-2 egereket, amelyek "rel =" gallery-fragment-images-370370058 "adat-ábrával rendelkeztek -caption = "

A rokonság és az elhízás hatása a bél mikrobiális ökológiájára. (A) Súlyozatlan páros csoportos módszer aritmetikai átlag (UPGMA) fával, az egyes egerek cecalis mikrobiális közösségei közötti páros különbségek alapján (UniFrac metrika, 5088 szekvencia alapján). Sötétkék, 1. anya és utódai (M1-); rózsaszínű, 2. anya és utódai; világoskék, M3 és utódai. az 1. és 3. anya testvérek különböző almokból. 2. anyának két egymást követő alma volt (M2A- és M2B-). Minden csomópont robusztus a hozzá tartozó egerek vonatkozásában (az összes csomópont értéke> 0,95 jackknife-érték, amely azt az idő százalékát jelzi, amikor a csomópont ott volt, amikor egy véletlenszerűen kiválasztott egeret eltávolítottak a távolságmátrixból n = 1000 ismétlés esetén). A négyzettel jelölt csomópontok robosztusak a szekvenciaszámra (jackknife értékek> 0,67, ami azt mutatja, hogy a csomópont hányszor volt jelen, amikor minden egérből véletlenszerűen 200 szekvenciát választottak n = 100 ismétléshez, kivéve az M2A-1 és M2A-2 egereket, amelynek * volt, P ¶ Kinek kell címezni a levelezést: E-mail: jgordonmolecool.wustl.edu .

A szerző közreműködései: R.E.L., F.B. és J.I.G. tervezett kutatás; R.E.L., F.B. és P.T. végzett kutatás; C.A.L. és R.D.K. új reagensekkel/analitikai eszközökkel járult hozzá; R.E.L., F.B., P.T., C.A.L., R.D.K. és J.I.G. elemzett adatok; és R.E.L., C.A.L. és J.I.G. írta a lap.

Adattárolás: Az ebben a cikkben közölt szekvenciákat a GenBank adatbázisba raktuk le [csatlakozási sz. DQ014552-DQ015671 (anyák) és AY989911-AY993908 (utódok)].

Szabadon elérhető online a PNAS nyílt hozzáférési lehetőségén keresztül.