Az elhízás megváltoztatja a GH/IGF-I tengely gén kifejeződését az egér emlőzsír zsírpárnáiban: a kortisztatin és a szomatosztatin differenciális szerepe

Közreműködött ebben a munkában: Alicia Villa-Osaba, Manuel D. Gahete

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Alicia Villa-Osaba, Manuel D. Gahete

Sejtbiológiai, élettani és immunológiai tanszék, Córdobai Egyetem, Córdoba, Spanyolország, Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Reina Sofía Egyetemi Kórház, Córdoba, Spanyolország, CIBER Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición (CIBER) Córdoba, Spanyolország, Orvosi Osztály, Illinoisi Egyetem, Chicago és Jesse Brown Veterán Ügyek Orvosi Központja, Kutatási és Fejlesztési Osztály, Chicago, Illinois, Amerikai Egyesült Államok

Tartozás Pszichiátria és Magatartástudományi Tanszék, Stanford Egyetem Orvostudományi Kar, Stanford, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Sejtbiológiai, élettani és immunológiai osztály, Córdobai Egyetem, Córdoba, Spanyolország, Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Reina Sofía Egyetemi Kórház, Cordoba, Spanyolország

Társulások Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Reina Sofía Egyetemi Kórház, Córdoba, Spanyolország, Lipidek és Atherosclerosis Egység, Orvostudományi Intézet, Reina Sofía Egyetemi Kórház, Córdoba, Spanyolország

Társulások Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Reina Sofía Egyetemi Kórház, Córdoba, Spanyolország, Emlőmirigy-egység, Reina Sofía Egyetemi Kórház, Cordoba, Spanyolország

Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Reina Sofía Egyetemi Kórház, Córdoba, Spanyolország, CIBER Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición (CIBERobn), Córdoba, Spanyolország, Lipidák és Atherosclerosis Unit, Orvostudományi Klinika, Reina Sofí Córdoba, Spanyolország

¶ ‡ Ezek a szerzők társ-vezető szerzők ebben a munkában.

Alicia Villa-Osaba,
Manuel D. Gahete,
José Córdoba-Chacón,
Luis de Lecea,
Ana I. Pozo-Salas,
Francisco Javier Delgado-Lista,
Marina Álvarez-Benito,
José López-Miranda,
Raúl M. Luque,
Justo P. Castaño

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Villa-Osaba A, Gahete MD, Córdoba-Chacón J, de Lecea L, Pozo-Salas AI, Delgado-Lista FJ és mtsai. (2015) Az elhízás megváltoztatja a GH/IGF-I tengely gén kifejeződését az egér emlőzsír zsírpárnáiban: a kortistatin és a szomatosztatin differenciális szerepe. PLoS ONE 10 (3): e0120955. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0120955

Akadémiai szerkesztő: Zane Andrews, Monash Egyetem, AUSZTRÁLIA

Fogadott: 2014. április 24 .; Elfogadott: 2015. február 10 .; Közzétett: 2015. március 25

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a cikkben található.

Finanszírozás: Ezt a munkát a következő támogatások finanszírozták: BFU2010-19300, PI-0369-2012, BIO-0139, PI13/00651, CIBERobn (RML-hez és JPC-hez) és a „Sara Borrell” CD11/00276 program (MDG-hez). A Ciber egy Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad, Spanyolország kezdeményezése. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: Ennek a kéziratnak a szerzői a következő versengési érdekekkel rendelkeznek: Az RML jelenleg a folyóirat társszerkesztője. Nincsenek versengő pénzügyi érdekek. Ez nem változtatja meg a szerzőknek az adatok és anyagok megosztására vonatkozó PLOS ONE irányelvek betartását.

Bevezetés

A GH és az IGF-I emlő karcinogenezisének elősegítésére számos epidemiológiai tanulmány alapján azt javasolják, hogy a keringő GH és IGF-I szintek pozitív korrelációban vannak legalább a mellrák kockázatával [16–25], legalábbis a posztmenopauzás nők körében [26]. Ezenkívül a rágcsálók és a főemlősök modellrendszereinek in vitro és in vivo vizsgálatai azt mutatják, hogy a GH és az IGF-I az emlő hámsejtjeinek proliferációját és differenciálódását indukálhatja, miközben blokkolja az apoptózist [10]. Azonban a GH/IGF-I tengely pontos szerepe az emlőrák kialakulásában és előrehaladásában még mindig nem teljesen tisztázott, különösen az elhízás összefüggésében, egy olyan metabolikus állapotban, amely szorosan kapcsolódik az emlőrák kockázatához, legalábbis posztmenopauzás nőknél [27–29]. Az a tény, hogy az elhízott egerek xenográfiai emlődaganataiban a GH/IGF-I tengely egyes komponensei megváltoznak [30], megerősíti azt a döntő szerepet, amelyet a helyi GH/IGF-I tengely játszik az emlőmirigy normális és patológiás fejlődésében, különböző anyagcsere körülmények között.

Tekintettel a GH/IGF-I emlőmirigy (pato) fiziológiájában betöltött döntő szerepére, annak szükséges kölcsönös függőségére az SST/CORT/ghrelin rendszerekkel, valamint az étrend okozta elhízás (DIO) valószínűleg a helyi expresszióban kifejtett hatására ezen szabályozási rendszerek közül feltételezzük, hogy a GH/IGF-1 tengely (és/vagy szabályozó rendszerei) helyi deregulációja előfordulhat az emlő zsírpárnáiban elhízási körülmények között, valamint az SST vagy a CORT hiánya miatt, ami ezért befolyásolhatja a ( pato) az emlőmirigy fiziológiája. Ezért a jelen tanulmány első ízben arra irányult, hogy elemezze ezen szabályozó rendszerek expressziós mintázatát a CORT és SST kiütések (KO; -/-) MFP-jében, párhuzamosan a megfelelő kontroll egerekkel (+/+). alacsony zsírtartalmú (LF; sovány kontroll) vagy magas zsírtartalmú (HF; elhízott csoport) étrend.

Anyagok és metódusok

Állatok

Az összes kísérleti eljárást a Cordobai Egyetem Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá. A C57Bl/6J nőstény egereket házon belül tenyésztették, és normál fény (12 órás fény, 12 órás sötét ciklus; világítás 07:00 órakor világított) és hőmérsékleti (22–24 ° C) körülmények között tartották szabad hozzáféréssel csapvízhez/élelemhez.

A heterozigóta tenyészpárokból (n = 12 egér/genotípus) generált CORT -/-, SST -/- és megfelelő alomtárs-kontroll (CORT +/+ és SST +/+) egerekből LF-étrendet etettek (Research Diets, Gentofte, Dánia; D12450B; 10% Kcal zsír, 70% Kcal szénhidrát, 20% Kcal fehérje) vagy HF diéta (Research Diets; D12492; 60% Kcal zsír, 20% Kcal szénhidrát, 20% Kcal fehérje) 16 hétig, kezdve 4 hetes kor, amint arról korábban beszámoltunk [49]. Az egerek testtömegét hetente kétszer ellenőriztük. Az egerek leölése előtt legalább egy héttel mindegyiket kiképeztük és kezeltük a személyzethez és a kezelési módszerekhez való igazodás érdekében. Minden nőstény véletlenszerű ciklusos körülmények között altatás nélkül dekapitálással leölték a törzsvért, és az inguinalis MFP-ket éles ollóval gyűjtötték, kezdve a mellbimbóhoz közeli proximális területtől a mirigy disztális vége felé az állat gerince felé, összegyűjtve az összes az inguinalis emlő területét körülhatároló zsírszövet MFP-k heterogén sejtpopulációt képeznek, amelyek tartalmazzák a zsírszövetet és a hámsejteket, amelyek aránya elhízási körülmények között módosulhat. A mintákat azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztották, és további feldolgozásukig -80 ° C-on tárolták.

A plazma leptin értékelése

A törzsvért WT-, CORT-KO- és SST-KO-egerekből gyűjtöttük össze, majd leölés után azonnal összekevertük MiniProtease inhibitorral (Roche; Barcelona, Spanyolország), jégre helyeztük, centrifugáltuk, és a plazmát -80 ° C-on tároltuk a leptin meghatározásáig. A keringő leptinszinteket kereskedelmi ELISA kit segítségével (Millipore; Madrid, Spanyolország) értékeltük.

Teljes RNS izolálás és retrotranskripció

Az inguinalis MFP-kből származó teljes RNS-t TRIzol Reagent (Invitrogen, Barcelona, Spanyolország) felhasználásával izoláltuk a gyártó utasításai szerint, és DNase-vel kezeltük (Promega, Barcelona, Spanyolország). A kinyert RNS mennyiségét (a DNase kezelés előtt és után) a NanoDrop2000 spektrofotométerrel (Thermo Scientific, Wilmington, EEUU) határoztuk meg. 1 μg RNS-t fordítottunk át cDNS-be véletlenszerű hexamer primerek alkalmazásával [First Strand Synthesis (MRI Fermentas, Hanover, MD)].

Kvantitatív valós idejű PCR (qPCR)

A qPCR reakciókat a Brilliant III SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA) alkalmazásával hajtottuk végre a Stratagene Mx3000p rendszerben. Minden reakcióhoz 10 μl mesterkeveréket, 0,3 μl minden primert, 8,4 μl desztillált H2O-t és 1 μl cDNS-t (50 ng) 20 μl össztérfogatban összekevertünk. A qPCR-t a következő lépésekből álló programmal hajtottuk végre: (1) 95 ° C 3 percig, (2) 40 denaturálási ciklus (95 ° C 20 másodpercig) és izzítás/meghosszabbítás (61 ° C 20 másodpercig) és (3) egy utolsó ciklus, ahol a végső PCR-termékeket fokozatosan hőmérsékletfüggő disszociációnak vetették alá (55 ° C-tól 95 ° C-ig, ahol 0,5 ° C/30 sec-on emelkedett) annak igazolására, hogy csak egy termék amplifikálódott. Az összes RNS-mintát, amelyet nem fordítottunk át, és cDNS-kontrollt nem hajtottunk végre minden lemezen, hogy ellenőrizzük a genomi DNS-szennyeződést, és nyomon kövessük az esetleges exogén szennyeződést. Az RT reakcióban felhasznált RNS mennyiségének és az RT reakció hatékonyságának változásainak ellenőrzésére az egyes érdekes transzkriptumok mRNS kópiaszámát az emlőzsírpárnák két optimális háztartási génjének normalizációs faktorával állítottuk be: β-aktin és GAPDH, a Genorm 3.3 vizuális alapalkalmazás alkalmazásával, ahol ezen háztartási gének expressziója nem változott jelentősen (az adatokat nem mutatjuk be).

Az egér transzkriptumok specifikus primereit (1. táblázat) Primer3 szoftverrel terveztük és validáltuk ugyanazzal a paraméterrel, amiről korábban beszámoltunk [50,51]. Mindegyik transzkriptumból standard görbéket készítettünk, és a kísérleti mintákkal párhuzamosan futtattuk az abszolút gén expresszió számának meghatározása érdekében (kópiaszám).

Statisztikai analízis

A kísérlet összes csoportjának mintáit egyidejűleg dolgozták fel. Kétirányú ANOVA-t alkalmaztunk a két faktor [étrend (LF, HF) és/vagy genotípus (WT, CORT-KO, SST-KO)] és kölcsönhatásuk hatásának összehasonlítására, majd Bonferroni post-hoc tesztet. Valamennyi értéket átlag ± SEM-ben fejezzük ki; p 1. ábra Az LF- és HF-diéta hatása a testsúlyra WT, CORT-KO és SST-KO nőstény egerekben.

Az értékek a testtömeg-növekedés százalékos arányát képviselik az LF diétával táplált egerek 100% -ához képest. A kétirányú ANOVA szerinti globális különbségek az egyes grafikák tetején láthatók (G: genotípus-hatás; D: diéta-hatás I: a genotípus és a diéta közötti kölcsönhatás hatása; *, p és SST-KO egerek etették LF és HF diétával.

Az értékek a plazma leptin ng/ml átlag ± SEM értékét jelentik. A kétirányú ANOVA szerinti globális különbségek az egyes grafikák tetején láthatók (G: genotípus-hatás; D: diéta-hatás I: a genotípus és az étrend kölcsönhatásának hatása; *, p sst4> sst5TMD1> sst1 = sst3 (3. ábra, középső Ezzel szemben a teljes hosszúságú, natív sst5 és a ligandumok (SST és CORT) nem expresszálódtak lényegesen MFP-kben. A Ghrelin-rendszert expresszálták egér MFP-kben is, ahol az In2-ghrelin variánst jobban expresszálták, mint a natív ghrelin, míg a GOAT enzimet és a ghrelin receptort (GHS-R) elhanyagolható mértékben expresszálták (3. ábra, alsó panel).

Az értékek az egyes transzkriptumok mRNS-kópiaszámának átlagát ± SEM-et jelentik (n = 5-6 egér).

A DIO és az SST/CORT elvesztésének hatása a GH/IGF-I tengelyre az egér emlő zsírpárnáiban.

A diéta okozta elhízás hatásának, valamint az SST és a CORT implikációjának elemzésére a GH/IGF-I, SST/CORT és a ghrelin rendszerek expressziójának szabályozásában az MFP-kben CORT- és SST-KO nőstény egereket és azok megfelelő LF vagy HF diétával táplált kontroll (4. ábra).

A GH-R, IGF-I, IGF-II, IGF-IR és PRL-R mRNS-szintjét qPCR-rel mértük. Az értékek az egyes transzkriptumok mRNS-kópiaszámának átlagát ± SEM-et jelölik a normalizációs faktorral korrigálva (n = 5–6). A kétirányú ANOVA szerinti globális különbségek az egyes grafikák tetején láthatóak (G: genotípus-hatás; D: diéta-hatás I: genotípus és étrend közötti kölcsönhatás hatása; *, p 5. ábra. A diéta által kiváltott elhízás hatása az expresszióra az SST/CORT/receptor altípusok CORT-KO, SST-KO és ezek kontroll kontroll egereinek emlő zsírpárnáiban.

Az sst1, sst2, sst3, sst4 mRNS-szintjét qPCR-rel mértük. Az értékek az egyes transzkriptumok mRNS-kópiaszámának átlagát ± SEM-et jelölik a normalizációs faktorral korrigálva (n = 5–6). A kétirányú ANOVA szerinti globális különbségek az egyes grafikák tetején láthatók (G: genotípus-hatás; D: diéta-hatás I: a genotípus és az étrend kölcsönhatásának hatása; *, p 6. ábra. A diéta által kiváltott elhízás hatása az expresszióra ghrelin-rendszer vizsgálata a CORT-KO, az SST-KO és a megfelelő kontroll egerek emlő zsírpárnáiban.