Glia szelektíven közelíti meg a szinapszisokat a vékony dendrites tüskéken

Nyikolaj Medvegyev

1 Nyílt Egyetem Élet- és Egészségtudományi Tanszék, Milton Keynes MK7 6AA, Egyesült Királyság

Victor Popov

1 Nyílt Egyetem Élet- és Egészségtudományi Tanszék, Milton Keynes MK7 6AA, Egyesült Királyság

2 Sejtbiofizikai Intézet, Orosz Tudományos Akadémia, Pushchino 142290, Oroszország

Christian Henneberger

3 Neurológiai Intézet, University College London, Queen Square, London WC1N 3BG, Egyesült Királyság

4 Celluláris Idegtudományi Intézet, Bonn Egyetem Orvostudományi Kar, Bonn, Németország

Igor Kraev

1 Nyílt Egyetem Élet- és Egészségtudományi Tanszék, Milton Keynes MK7 6AA, Egyesült Királyság

Dmitri A. Rusakov

3 Neurológiai Intézet, University College London, Queen Square, London WC1N 3BG, Egyesült Királyság

Michael G. Stewart

1 Nyílt Egyetem Élet- és Egészségtudományi Tanszék, Milton Keynes MK7 6AA, Egyesült Királyság

Társított adatok

Absztrakt

Ez a tanulmány 189 dendrit tüske és a környező asztroglia morfológiai modalitásának kapcsolatát vizsgálja a neuropil fragmensek teljes háromdimenziós rekonstrukcióinak felhasználásával. A háromdimenziós glia lefedettség integratív mértéke megerősíti, hogy a vékony gerincoszlop-szinapszis sűrűségeket szorosabban körülveszi a glia. Ez a megkülönböztetés azt sugallja, hogy a diffúziótól függő szinapszis – glia kommunikáció a „tanulási” szinapszisok közelében (vékony tüskékkel társítva) erősebb lehet, mint a „memória” szinapszisok közeli (nagyobb tüskékkel társított).

1. Bemutatkozás

A hippokampuszban az asztroglia membránokat benépesítő nagy affinitású transzporterek gyorsan pufferolják a szinaptikus kisülések által felszabaduló ingerlő neurotranszmitter glutamátot [1–4]. Ez az erős felvételi rendszer alacsony környezeti extracelluláris glutamáttartalmat (20–30 nM) tart fenn, „csendes” hátteret biztosítva az átmeneti gerjesztő jelek számára [5]. Az asztrociták azonban a szövet térfogatának kevesebb mint 10% -át foglalják el a hippocampus CA1 területén [6], és a szinkron szinaptikus felszabadulások a glutamát extra- vagy inter-szinaptikus hatását idézhetik elő [7–9]. Valójában az asztrocita-nyúlványok egyenetlenül fordulnak elő a hippocampus neuropilumában, szorosan megközelítve az gerjesztő szinapszisok csupán 20–30% -át [10], és nincs nyilvánvaló összefüggés a gazda dendritikus tüskék morfológiájával [11]. A szinapszisok glia lefedettsége azonban a szervezet fiziológiai állapotától függően változik [12,13], ami felveti a kérdést, hogy van-e adaptív jelentősége az asztroglia egyenetlen eloszlásának a hippokampusz szinapszisok közelében.

Ennek kivizsgálására először dokumentáltuk az építészetet és az élő asztrociták által elfoglalt szövettérfogat-frakciót a fogazott neuropilban, másodszor pedig három dimenzióban rekonstruáltuk az összefüggő asztrocita-töredékek ultrastruktúráját a szomszédos gerjesztő szinapszisokkal együtt. A szinapszisok és az asztroglia szembeállításának számszerűsítéséhez először kiszámoltuk az asztrocita membránok és a posztszinaptikus sűrűségek (PSD) legközelebbi széle közötti legrövidebb távolságokat 136 „vékony” és 53 „gomba” dendritikus tüskénél [14,15] a dentát granulátum sejtjeinél. Másodszor, egy integrált súlyozott távolság mérést alkalmaztunk, amely kumulatív adatokat szolgáltatott a PSD-k térbeli glial lefedettségéről. Megállapítottuk, hogy a glia membránjai lényegesen közelebb állnak a vékony dendrites tüskék PSD-jéhez, mint a gomba tüskék. Mivel a gombás és vékony dendrit tüskék társultak a különböző domináns szinaptikus receptorokhoz [16–18] és a szinaptikus plaszticitás különböző szakaszaihoz [19–21] (bár lásd: [22]), az eredmények arra utalnak, hogy a glia szelektíven megközelítheti azokat a szinapszisokat, amelyek a fiziológiai „tanulás” folyamatában.

2. Anyag és módszerek

a) Kétfoton mikroszkópia és morfometria

b) Szövet előkészítése és feldolgozása elektronmikroszkópiához

c) Háromdimenziós rekonstrukció és morfometria

A digitális elektronmikroszkópos felvételeket (1200 dpi) a SEM A lign 1.26 segítségével igazítottuk, és az egyes dendrit gerincek, PSD-k és asztrocita folyamatok kontúrjait digitálisan követtük nyomon az IGL T 1.26 verseny segítségével (http://www.synapses.clm.utexas.edu/). A metszet vastagságát a korábban leírtak szerint határozták meg [26], és általában 60–70 nm volt (szürke/fehér szín). Az egyes szerkezetek térfogatát és felületét kiszámítottuk, és háromdimenziós (3D) objektumokat készítettünk az IGL T faj felhasználásával. Az azonosított asztrocita folyamatok melletti dendrit tüskéket rekonstruáltuk és elemeztük (lásd: eredmények). A „gomba” tüskék további kritériumai a gerinckészülék és a komplex (perforált, U alakú vagy szegmentált) PSD jelenléte voltak, míg a „vékony” tüskék csak makula PSD-ket és gerinckészüléket nem [27,28].

Távolságmérésekhez rekonstruált felületeket használtunk, amelyeket kvázi szabályos háromszögrácsok reprezentáltak; rácscsúcsok adtak egy sor felületi koordinátát. Ahol szükséges, a centroidokat közvetlenül az ilyen halmazokból számították ki. A PSD-k (az összes felületi pont) és az asztrocita-membrán (az összes felületi pont felső távolsági határral rendelkező) közötti távolságának átfutását és mérését 3D-ben, az IGL T faj segítségével végeztük; a távolság metrika végig euklideszi volt. A 3D-rekonstrukciókat a 3D-S tudio -M ax 8 szoftverbe exportáltuk felületi rendereléshez. A statisztikai vizsgálatokhoz S tatistica-t (StatSoft) használtunk. Az ANOVA-kat, majd Bonferroni vagy Tukey (egyenlőtlen minták) teszteket O rigin P ro v. 7.5 alkalmazásával végeztük.

3. Eredmények

(a) Asztrociták a dentate gyrus-ban: neuropil térfogat-frakció az élő szövetben

A glia (GV) által elfoglalt szövettérfogat-résznek tükröznie kell a glutamátfelvétel alapvető tulajdonságait a területen. A GV-t eddig fix készítményekben mértük sztereológiai szabályok alkalmazásával [2,6]. Az élő szövetben a GV mérésére 2P mikroszkópiát alkalmaztunk: a 2P gerjesztés teljes egészében a körülbelül 1 µm vastag optikai rétegben történik, biztosítva, hogy a gyújtótávolságon kívül ne keletkezzen szennyező fluoreszcencia. Mivel a glia kiemelkedései általában sokkal vékonyabbak, mint az áttetsző gerjesztési réteg, a mintavételezett F (i, j) emisszió (i és j, pixelkoordináták az X – Y síkban) arányos a mutatóval töltött glia helyi térfogat-hányadával, ill. GV (i, j).

Ahhoz, hogy a GV (i, j) helyi térfogatfrakcióvá alakuljon, összefüggésbe hoztuk a festékkel töltött sejtes soma belsejében lévő Fmax (i, j) fluoreszcenciával (azaz 100% -os térfogat-frakcióval) ugyanabban a fókuszsíkban (1. c ábra): GV (i, j) = (F (i, j) - F0)/(Fmax - F0) ahol F0 háttérfluoreszcencia (minden festett struktúrán kívül). Ezt a megközelítést két méréshez használtuk. Először kizártuk a soma által elfoglalt területeket és a vastag (több mint 1 µm) asztrocita folyamatokat. Az így kapott átlagérték (n = 10 sejt) tehát a finom glianyúlványok által elfoglalt szövettérfogat-arányt tükrözi. Fontos, hogy a lokális viszonylag állandó volt a szómától távol (1. c ábra), ami arra utal, hogy az asztrocita domén egészében homogén glia lefedettséget mutat. Másodszor megmértük az összes dendritszerű folyamatot magába foglaló GV értéket: GV = 8,9 ± 0,7% (n = 10). Ennek az értéknek meg kell felelnie az elektronmikroszkópos megfigyeléseknek, amelyek során az asztrocita-folyamatok fragmenseiből önkényesen vesznek mintát. Mivel a hippocampus asztrociták általában különálló neuropil doméneket foglalnak el, térbeli átfedés kevés vagy egyáltalán nincs [24,30,31], ezért a GV értékének biztosítania kell az asztroglia rekonstrukciójának teljességét az elektronmikroszkópos szinten.

b) A szinapszisok és a glia térbeli egymásba helyezése

A mediális molekuláris réteg sorozatos metszetű elektronmikroszkópos felvételeiben (Anyagok és módszerek) a korábban leírt kritériumok alapján azonosítottuk a glia fragmenseket [3,6,11,32], és ezt tovább erősítettük azáltal, hogy összefüggő struktúrákat kerestünk a sorozatban (2.a ábra; elektronikus kiegészítő anyag, S2 ábra). Az egész mintában a glia által elfoglalt átlagos szöveti térfogatfrakció GV = 9,18 ± 0,65% (n = 16 asztrocita fragmens). Ez kiváló összhangban volt az élő szövetekben mért GV-vel (lásd fent), jelezve a glia azonosításának pontosságát. Ezután rekonstruáltuk az asztrociták fragmentumait, a szomszédos PSD-ket tartalmazó dendrit tüskékkel együtt (2. b ábra; elektronikus kiegészítő anyag, S2 ábra).

A szomszédos szinapszisokkal szomszédos asztrocita fragmensek háromdimenziós rekonstrukciója. (a – d) Három dimenzióban (kék, (a, b)) rekonstruált fogazott asztrocita töredéke a szomszédos dendritikus tüskékkel (szürke és sötétsárga szerkezetek, (b)) együtt, PSD-vel ellátva (piros). A tüskék egyértelműen a vékony (sötét sárga, külön látható a (c) pontban) és a gomba (szürke, (d)) alcsoportokra vannak felosztva. Lásd az elektronikus kiegészítő anyagot, az S2 ábrát, az azonosított szerkezetű eredeti soros szakaszok példáival.

A 3D rekonstrukciók során egyértelműen meg tudnánk különböztetni a vékony (n = 136) és a gombás (n = 53) dendrit tüskéket (2. c – d ábra), amelyek átlagos fejtérfogatukban több mint ötszörösek [14,21,25]. Valójában a gomba és a vékony tüskék átlagos fejtérfogata 0.1998 ± 0.0156 és 0.0323 ± 0.0019 µm 3 (átlag ± s.e.m.) volt. A PSD centridák közötti 3D 3D legközelebbi távolság az összes tüske között 0,57 ± 0,02 µm (n = 190). Ez összhangban volt az ingerlő szinapszisok térfogatsűrűségével a dentate gyrus-ban [33,34], és hasonló volt a CA1 területen a legközelebbi szomszédok közötti átlagos szinaptikus távolsághoz [10,35]. Ez a következetesség tovább igazolta a rekonstrukciós eljárások pontosságát.

Finanszírozási nyilatkozat

Ezt a munkát a BBSRC (BB/J021687/1), a Wellcome Trust, az Orvosi Kutatási Tanács (Egyesült Királyság), az Európai Unió (FP6 Promemoria 512012), az ERC Advanced Grant, az NRW-Rückkehrerprogramm, az Emberi Határok Tudomány Program (HFSP RGY-0084) támogatta./2012) és az UCL Excellence Fellowship.