8 és 10 szénatomos közepes láncú trigliceridekkel kiegészített idős patkányok felismerése és szinaptikus-plaszticitással kapcsolatos változásai

Nestle Nestle Egészségtudományi Intézet, kognitív egészség és öregedés, EPFL Innovation Park, H épület, 1015, Lausanne, Svájc

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Wang D, Mitchell ES (2016) 8 és 10 szénatomos közepes láncú trigliceridekkel kiegészített öregedő patkányok megismerésével és szinaptikus-plaszticitással kapcsolatos változásai. PLoS ONE 11 (8): e0160159. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0160159

Szerkesztő: Yael Abreu-Villaça, az Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Brazília

Fogadott: 2016. január 7 .; Elfogadott: 2016. július 14 .; Közzétett: 2016. augusztus 12

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Az ESM és a DW a Nestle Egészségtudományi Intézet, egy profitorientált intézmény alkalmazottai, és fizetés formájában kaptak támogatást. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: Az ESM és a DW a Nestle Institute of Health Sciences, egy profitorientált intézmény alkalmazottai. Ez nem változtatja meg a szerzőknek az adatok és anyagok megosztására vonatkozó PLOS ONE irányelvek betartását.

Bevezetés

Az oktánsav, illetve a dekánsav, a 8 szénatomos és a 10 szénatomos közepes láncú zsírsavak (MCFA) közepes láncú trigliceridként (MCT) találhatók olyan élelmiszerekben, mint a kókuszolaj és a kecsketej. A hosszabb láncú zsírsavaktól, például a palmitinsavtól eltérően az MCFA képes gyorsan bejutni a véráramba, és szabad zsírsavaként létezik, amelyek szabadon áthaladnak a sejtmembránokon. A portális vénába való belépés után az MCFA ketonokká alakul (béta-hidroxi-butirát, acetát és acetoacetát), amelyek az MCT1 transzporterek segítségével felvehetők az agyba [1]. A ketonok az acetil-CoA termelésének szubsztrátjaiként működnek, így alternatív energiaforrásként szolgálhatnak, ha alacsony a glükózszint [2]. Ez a glikolízis bypass tulajdonság a ketonoknál különösen fontos az idegsejtek számára, amelyek glükózt vagy ketonokat használnak elsődleges energiaforrásként az ATP előállításához. Az Alzheimer-kórban (AD) szenvedő betegekről kimutatták, hogy csökken az agy glükóz metabolizmusa és a glikolitikus enzimek, ezért a ketonok adjuváns üzemanyagként hasznosak lehetnek [3]. A legújabb kutatások kimutatták, hogy a közepes láncú zsírsavakból származó ketonok javítják a kognitív hatást cukorbeteg és AD betegeknél, és csillapítják a neurodegenerációt egy ALS egérmodellben [4].

Bár az elfogyasztott MCFA többsége ketonokká alakul, az ADME vizsgálatok kimutatták, hogy az MCFA maguk is bejuthatnak az agyba, és sokféle hatást gyakorolhatnak az idegsejtek működésére [5,6]. Például a közepes láncú zsírsavak aktiválják a szabad zsírsavakat, amelyek érzékelik a G-fehérjéhez kapcsolt receptorokat, például a GPR40 és a GPR84, amelyek nagyon expresszálódnak az agyban, és szerepet játszanak a glükóz szabályozásában és a gyulladásban [7]. A közelmúltban kimutatták, hogy a közepes láncú zsírsavak modulálják a mitokondriális enzim működését egy neuroblastoma sejtvonalban [8]. Konkrétan a dekánsav 6 napos adagolása növelte a citrát-szintáz, az I. komplex és a kataláz aktivitását, míg az oktánsavnak nem volt hatása. Érdekes módon a dekánsav a PPAR gamma receptorok ligandumának bizonyult, míg az oktánsavnak nincs aktivitása [9]. Eközben az oktánsavat szinte kizárólag a megismerést értékelő emberi és állatkísérletekben szokták használni, állítólagosan magasabb ketogén potenciálja miatt.

Nem ismert, hogy a dekánsav-triglicerid (MCT10) hatással van-e a kognícióra is, mivel egyetlen publikált tanulmány sem értékelte az MCT10-et az életkorral összefüggő kognitív hanyatlásra. Sőt, jelenleg még nem ismert, hogy az MCFA-fogyasztás után felszabaduló MCFA-k, mint például oktánsav vagy dekánsav, in vivo hatással vannak-e az idegsejtek metabolikus funkciójára.

Ebben a tanulmányban az MCT10 és MCT8 kezeléseket öreg patkányokkal etették 8 héten keresztül, és kognitív teljesítményüket összehasonlították az idős patkányokkal, akik napraforgóolajjal kiegészített étrendet kaptak.

Mód

Állatok, kezelés, ketonok és MCFA mérése

Viselkedés tesztelése

Társadalmi elismerés.

A patkányokat az MCT viselkedési hatásainak vizsgálatára társas interakciós teszttel végeztük 3 nappal az elpusztítás előtt. Ez a teszt egy ismeretlen fiatal patkány bevezetését jelenti a teszt patkány háziketrecébe 4 percig. Feljegyeztük az ifjú patkány megható, szimatoló és általános feltárásának mennyiségét, és a társas interakció teljes időtartamát használtuk a szocialitás és a szorongás mutatóiként. 1 óra elteltével a korábban feltárt fiatalkorúat és egy új fiatalkorúat 4 percre bevitték az otthoni ketrecbe. Ha egy patkánynak az első ülés során nem sikerült 30 másodpercnél hosszabb ideig felfedeznie a fiatalkorúat, akkor azt nem vették fel a végső elemzésbe. A társadalmi elismerést az új fiatalkorú felkutatására fordított idő és a mindkét fiatalkorú felderítésével töltött teljes időtartam alapján számították ki (JNEW/(JNEW + JOLD)).

Nyílt mező és objektumfelismerés.

Fehérje kivonás

A patkány agyszövet mintáit 1 mól NaCl, EDTA 0,5 M, EGTA 0,5 M, NaF 0,5 M, Na4O7P4 0,2 M, Na3VO4 0,5 M, Triton-100, SDS 10%, 5% deixycholate, 5% deixycholate, 5% PIXF, proteáz inhibitor tartalmú pufferben homogenizáltuk. koktél (Roche). A fehérjét 10000 g-vel 10 percig 4 ° C-on végzett centrifugálás után kaptuk. A fehérje koncentrációt Bradford módszerrel határoztuk meg.

IRS-1, IGF-1, GDNF és VEGF ELISA

Western blotok

A fehérje-elválasztáshoz a Life Technologies cég NuPAGE Novex Midi gélt (4–12%) használták. A következő antitesteket használtuk: Anti-PSD95 antitest (Abcam, Kat. # Ab18258), Synaptophysin (D35E4) XP ® Nyúl mAb (Cell Signaling, Kat. # 5461), Complex II alegység monoklonális antitest (21A11AE7 klón, Life Technology, # Foszfo-p70 S6 kináz (Thr421/Ser424) (Sejtjelzés, # 9204), S6K (p70) (Sejtjelzés, 2217), Foszfo-Akt (Ser473) antitest (Sejtjelzés, Cat. # 9271s), Akt (pan) (11E7) Nyúl mAb (Cell Signaling, Cat. # 4685s), Ube3a (Abgent, # 346954), β-Tubulin antitest (TUB 2.1, Santa Cruz, Cat. # Sc-58886) és β-Actin antitest (Sigma, Kat. # A1978). Inkubálás után a Li_COR Biosciences megfelelő infravörös fluoreszcens szekunder antitestjeivel (# 926–32213 IRDye® 800CW Donkey anti-Rabbit IgG és # 926–68072 IRDye® 680RD Donkey anti-Mouse IgG) a specifikus fehérje jelét detektáltuk és kvantifikáltuk a az Odyssey CLx képalkotó (LI-COR).

A génexpresszió detektálása PCR-rel

A teljes RNS-t extraháltuk és RNAdvance szövetkészlettel tisztítottuk (Agencourt, Beverly, MA, USA). Az RNS minták minőségét a Fragment Analyzer (Advanced Analytical Technologies, Inc., Ames, IA, USA) alkalmazásával ellenőriztük. A reverz transzkripciót Katara Clontech PrimeScript Reagent kit (Cat. # RR037A) segítségével hajtottuk végre, a gyártó utasításait követve, 500 ng RNS-mintát használva. A LightCycler ® 1536 DNS Green Master (Roche, Cat. # 5573092001) hozzáadása után a génexpressziót Roche LightCycler 480-on számszerűsítettük. A PCR reakcióhoz a következő gének primereit használtuk: Arc, Egr1, Egr2, Fosb, Srf, nr4a1, Plk3, Junb, Grin1, Gba2 és béta-tubulint használtunk endogén kontrollként.

Patkány-Egr1-F: aacaaccctacgagcacctg; Patkány-Egr1-R: aaaggggttcaggccacaaa;

Patkány-Fosb-F: gccttcaactagcacaagcac; Patkány-Fosb-R: ctgatccgtttccgcctgg;

Patkány-Srf-F: atgcagtgatgtatgccccc; Patkány-Srf-R: cagccatctggtgaagctga;

Patkány-Nr4a1-F: gcatggtgaaggaagttgtcc; Patkány-Nr4a1-R: aaaattgctgcacgtcaccg;

Patkány-Egr2-F: aaacggcttctctggcactc; Patkány-Egr2-R: ttgatcatgccatctccagcc;

Patkány-Junb-F: gtttacatggcccccttcca; Patkány-Junb-R: agtatccccacaggctgagt;

Patkány-Arc-F: acagacacagcagatccagc; Patkány-Arc-R: tgagtcatggagccgaagtc;

Patkány-Gba2-F: ctaccctgcatgttgtccgt; Patkány-Gba2-R: tcagctgtccggaaaccttc;

Patkány-Grin1-F: cttcagtccctttggccgat; Patkány-Grin1-R: agttggcagtgtaggaagcc,

Patkány-Actin-F: gtcgtaccactggcattgtg; Patkány-Actin-R: ctctcagctgtggtggtgaa

Patkány-Plk3-F: gcaagcagtggagatggatt; Patkány-Plk3-R: ggacagctgatagccaaagc

Statisztikai analízis

Egyirányú ANOVA-t használtunk a viselkedés, a fehérje és az mRNS expressziójának elemzésére. A súlyváltozást ismételt mért ANOVA segítségével elemeztük. Ha szignifikáns különbségeket találtunk a csoportok között, akkor a post-hoc teszteket Tukey-ként alkalmaztuk, összehasonlításként a kontrollcsoporttal vagy Bonferroni-összehasonlítással az MCT csoportok között. Minden adatot átlagként (± SEM) mutatunk be.

Eredmények

Súly, plazma ketonok és közepes láncú zsírsavak

Az étrend minden csoport számára jól tolerálhatónak tűnt, azonban az állatok rendkívüli kora miatt 3 állat pusztult el a beavatkozás utolsó hetében: 1 mortalitás a kontrollcsoportban és 2 mortalitás az MCT8 csoportban. Ezeket az állatokat nem vették bele a viselkedés, a post mortem és a vérvizsgálatokba. Az MCT kezeléseknek nem volt szignifikáns hatása a táplálékfelvételre (napi átlagos bevitel grammban: CON, 23,3 ± 2,4; MCT8, 21,6 ± 1,4; MCT10 22,1 ± 1,8). Annak ellenére, hogy a táplálékbevitelben nincs különbség, mindkét MCT kezelés hasonló beavatkozást tartott fenn a beavatkozás során, míg a napraforgóolajjal kiegészített csoport hízott (1A ábra). A kolorimetrikus készletekkel mért plazma béta-hidroxi-butirát (BHB) növekedett az MCT10- és MCT8-kezelt csoportban a kontrollokhoz képest (1B. Ábra), ugyanakkor az agy BHB-je GC-MS-vel mérve minden csoportban hasonló volt (1C. Ábra). A plazma oktánsav mérése az MCT8-mal kezelt csoportokban átlagosan 6,4 ± 1,4 μM volt (1D ábra), míg az MCT10 csoport plazma dekánsav átlagos szintje 18,2 ± 2,1 μM volt (1E ábra).

(A) a tömeg százalékos változása, * p 2. ábra. A kognitív teljesítmény növekedett az MCT csoportokban a kontroll étrendhez képest, egyirányú ANOVA elemzéssel.

(A) társadalmi felismerés a kiinduláskor és a krónikus MCT-kezelés után 8 héttel. ** p 3. ábra. Az inzulin jelző fehérje foszforilációs és növekedési faktorok.

(A) IRS-1 foszforilációs ser (307) *, p 4. ábra: szinapszis-asszociált fehérjék és növekedéssel kapcsolatos utak.

(A) S6K (p70) foszforiláció (pS 240/244) F (2,8) = 10,8 *, p 5. ábra. Relatív mRNS expresszió MCT-vel kezelt patkányok prefrontális kérgében: a plaszticitással összefüggő transzkripciós faktorok.