Az emberi parainfluenza vírus 3-as típusú HN-receptor kölcsönhatásának hozzájárulása a patogenezishez in vivo

Gregory A. Prince

Virion Systems, Inc., Rockville, Maryland, 1 és F. Edward Hébert Orvostudományi Kar Gyermekgyógyászati Osztály, Egységes Egészségtudományi Egyetem, Bethesda, Maryland, 20814, 2 és a Sinai-hegyi Orvostudományi Gyermekgyógyászati Klinika, New York, New York 10029 3

Martin G. Ottolini

Virion Systems, Inc., Rockville, Maryland, 1 és F. Edward Hébert Orvostudományi Kar Gyermekgyógyászati Klinika, Egységes Egészségtudományi Egyetem, Bethesda, Maryland, 20814, 2 és a Sínai-hegyi Orvostudományi Kar Gyermekgyógyászati Osztálya, New York, New York 10029 3

Anne Moscona

Absztrakt

A Paramyxoviridae család az emberi patológia számos fontos ágenséből áll, beleértve a kanyaró, a mumpsz, a légúti syncytialis és az emberi parainfluenza vírusokat. A 3. típusú emberi parainfluenza vírus (HPF3) a csecsemő és gyermekkori légúti megbetegedések második fő oka, és jelenleg nem áll rendelkezésre oltóanyag vagy vírusellenes terápia ehhez a szerhez.

A HPF3 burkolata két vírusglikoproteint tartalmaz, a hemagglutinin-neuraminidáz (HN) fehérjét és a fúziós (F) fehérjét. A sejtek HPF3-val történő fertőzését a vírusnak a gazdasejthez való kötődésével kezdjük meg a HN-glikoprotein és a sziálsavat tartalmazó sejtfelszíni receptor kölcsönhatásával. A vírus behatolása és bevonatlansága a vírusburok F fehérje által közvetített fúziója a sejt plazmamembránjával, ami a vírus nukleokapszidjának felszabadulásához vezet a citoplazmába. A fúzió megvalósulásához mind a vírusos HN-glikoprotein kölcsönhatása a sziálsav-receptorával, mind a vírusos F-glikoprotein jelenléte szükséges (5, 6, 8, 11, 12). Neuraminidáz aktivitása révén a HN receptorromboló képességgel is rendelkezik, amely szerepet játszik a fertőzés terjedésében (7).

Az in vitro HPF3 akut fertőzés fémjelzi a citopátiás hatását az extenzív sejtfúzió, amely syncytium képződést eredményez, amely magában foglalja a fertőzött sejt felületén expresszált F és HN fehérjék kölcsönhatását a szomszédos, nem fertőzött sejt membránjával. Egy korábbi vizsgálatban olyan HPF3 vírusokat izoláltak, amelyek nagymértékben képesek a sejtek fúziójára a tenyészetben; ez új megközelítést kínált a paramyxovírus által kiváltott sejtfúzió mechanizmusának és a HN fehérje e folyamatban betöltött szerepének megértésére. Az izolált HPF3 két erősen fuzogén változata, a C-0 és a C-22, fokozott aviditást mutatott a sziálsav receptorok iránt, a HN fehérje egyszeri aminosav-változásai miatt (12). Ezek a tanulmányok kimutatták, hogy a HN funkciójának kulcsfontosságú eleme a fúzió elősegítésében a sejttenyészetben az, hogy ragaszkodik a sziálsavat tartalmazó receptorokhoz.

Folytatva a neuraminidáz szerepének tanulmányozását a HPF3 életciklusában és patogenezisében, izoláltuk a HPF3 egy változatát (C-28), amelynek csökkent a neuraminidáz aktivitása a vad típushoz képest (wt) (7). Ennek a variánsnak a növekedési tulajdonságainak elemzése késleltetett (7 órás) késést mutatott a vírusrészecskék felszabadulásában; exogén neuraminidáz hozzáadása a tenyészethez korrigálta ezt a késést. Ezek a megállapítások a HN neuraminidáz aktivitását érintették a HPF3 vírusrészecskék felszabadulásában a fertőzött sejt felszínéről, és ezzel új fertőzéskört indítottak (7).

A HPF3 receptorkötő és neuraminidáz variánsainak használata pamut patkányban.

Meghatároztuk azt is, hogy a sejttenyészetben a fertőzés kimenetele szempontjából kritikus HN neuraminidáz aktivitása meghatározó-e a tüdő fertőzésének kimenetelében, a C-28 variáns alkalmazásával, amelynek 40 tömeg% neuraminidáz aktivitása van ( 7). A C-28, az F-fehérje szekvenciájának változása nélkül, a HN fehérjében egyetlen pont mutációval rendelkezik, vagyis a 724 nukleotidon egy G-A mutáció, amely a 216 aszparaginsavat aszparaginná alakítja. A C-28 a sejttenyészetben a lassú felszabadulás miatt kezdeti növekedési késleltetést mutat, majd utoléri és nagyobb mértékű fúziót okoz, mint a tömeg. A C-28 megnövekedett fuzogenitása alacsony neuraminidáz aktivitásának tudható be, amely több sejtes sziálsav-receptort hagy a HN megkötésére.

Vírusreplikáció.

A két nemű, beltenyésztett fiatal felnőtt pamut patkányokat (Sigmodon hispidus) a Virion Systems, Inc. tenyésztő telepéből szereztük be, nagy polikarbonát ketrecekben elhelyezve, és standard rágcsáló-chow-val és vízzel etették őket. Az állatok szeronegatívak voltak az adventív paramyxovírusok, az RSV és más gyakori rágcsáló kórokozók szempontjából.

A patkányokat intranazálisan fertőztük 100 μl-rel, amelyek mindegyik vírushoz két különböző beviteli dózist, 10,5 és 10,5 PFU-t tartalmaztak. Az állatokat a fertőzés után 2, 4, 6, 8 és 10 nappal feláldoztuk a vizsgálatra, hogy a vírus replikációjának időbeli lefolyása és a betegség előrehaladása a tüdőben történjen. Az idõpontokat a következõ indoklás alapján választottuk ki. A fertőzés után 2 nappal a C-22, C-0 és C-28 nagy plakkokat mutat a sejt egyrétegében. Négy nap jelenti a wt HPF3 replikáció csúcsát a tüdőben, és 6 nap a wt HPF3 csúcsos tüdőgyulladásos válaszának ideje (18). A 8 és 10 napos időpontokat úgy választottuk meg, hogy a variáns vírusok késleltetett eltávolítását keressük.

Az állatok széndioxid-inhalációval történő feláldozását követően az egyes állatok orr- és tüdőszöveteit kettévágtuk (a másik felét szövettani elemzésre használtuk), és a korábban leírtak szerint külön-külön homogenizáltuk (18), majd -70 ° C-on tároltuk. megvizsgálva. A vírustitereket plakkvizsgálattal határoztuk meg MA104 afrikai zöld majom vesesejteken, és PFU-ként számoltuk szövet grammjára.

A vad típusú vírus olyan titerre replikálódott, amely hasonló vagy kissé magasabb volt a tüdő és az orr három variánsánál (1. ábra. 1. ábra). A különbségek a C-0 esetében voltak a legszembetűnőbbek, ahol a csúcstiterek szignifikánsan alacsonyabbak voltak (P ≤ 0,05, az összesítő adatok t-próbája), mint a tüdőben (2. és 4. nap) és az orrban (2. nap), és a C-22 esetében, ahol a csúcstiterek szignifikánsan alacsonyabbak voltak, mint az orr tömegének titerei (2. és 4. nap). A replikáció kinetikájában nem volt szignifikáns különbség, a wt- és variánsvírusok a 6. napig a tüdőben, a 8. napon pedig az orrban ürültek ki. Megjegyzendő, hogy a három változat mindegyikénél a variáns vírusok plakk-morfológiája megmaradt in vivo, a wt-fenotípusra való nyilvánvaló visszatérés nélkül. A variánssal fertőzött állatokból származó vírusok összes plakkja az egyes változatokra jellemző tipikus nagy, kerek plakkokat mutatta (7, 12).

A vírustiterek geometriai átlaga a gyapot patkányok tüdejében és orrában a 2., 4., 6., 8. és 10. napon a C-28, C-22, C-0 és wt HPF3 fertőzés után. Minden pont nyolc (tüdő) vagy négy (orr) állatot jelent. A 2. és 4. napon a C-22 és a C-0 egyes titerei, amint azt a szöveg is jelzi, szignifikánsan alacsonyabbak voltak (P ≤ 0,05), mint a wt.

A tüdőszövet kórszövettana.

A hisztopatológiai változások nem korreláltak a vírustiterekkel a három paraméter egyikében sem, amelyet a tüdőben mértünk. A peribronchiolitis (2. ábra (2. ábra) 2) mind a négy csoportban kiemelkedő eredmény volt, enyhe eltérésekkel (P (2. ábra) 2) és interstitialis pneumonitis (az adatokat nem mutatunk be), míg ilyen kóros elváltozásokat nem tapasztaltunk a wt vírus által, annak ellenére, hogy a wt magasabb titereket ért el, mint a variánsok. A 3. ábra a látható hisztopatológia reprezentatív példáit mutatja. A 3A. Ábra a wt-vel fertőzött tüdőszövetet mutatja be peribronchiolitisben, de sem alveolitist, sem interstitialis tüdőgyulladást. A 3B. 3B. Ábra a wt-vel fertőzött tüdőszövet alveoláris szövetét mutatja, betegségre utaló jelek nélkül. A 3C. Ábra a C-0 variánssal fertőzött tüdőszövetet mutatja be peribronchiolitisben, amely nem különbözik a wt. A 3D ábra mutatja a C-0 variánssal fertőzött tüdőszövet alveoláris szövetét, feltűnő alveolitis (sejtek a légtérben) és interstitialis pneumonitis (megvastagodott alveoláris falak) ábrán.

A pulmonalis patológia pontszámainak számtani átlaga (plusz standard hibák) a peribronchiolitis és az alveolitis súlyosságára vonatkozóan. Az intersticiális tüdőgyulladás ugyanazt a mintát mutatta, mint az alveolitis, és nem szerepel ebben az ábrában. A csillagok olyan értékeket jeleznek, amelyek lényegesen magasabbak, mint a fertőzés utáni fertőzés ugyanazon a napon mért értékek. Minden csoport nyolc állatból állt.

Reprezentatív példák a tüdőszövet hisztopatológiájára. (A) wt vírussal fertőzött tüdőszövet, amely peribronchiolitist mutat. Nagyítás, × 64. (B) wt vírussal fertőzött tüdő, amely nem mutat alveoláris vagy interstitialis patológiát. Nagyítás, × 128. (C) C-0 variánssal fertőzött tüdő, amely peribronchiolitist mutat. Nagyítás, × 64. megkülönböztethetetlen attól, amelyet a wt okoz. (D) C-0 variánssal fertőzött tüdő, amely feltűnő alveolitist (sejtek a légtérben) és interstitialis pneumonitist (megvastagodott alveoláris falak) mutat.

Az orrszövet kórszövettana.

Az orrszövetek vizsgálatához mindegyik patkány koponyáját 10% -os formalinba helyeztük, majd a metszés előtt mészkőmentesítettük. Minden állathoz 1 mm-es intervallumokkal több koronális metszetet készítettünk. Három paramétert külön-külön pontoztak minden egyes mintához: hámsejtkárosodás, háminfiltráció (elsősorban neutrofilek) és exudátum (humorális vagy sejtes) az orr légterébe.

A négy vírus egyike sem okozott szignifikáns kóros változásokat a vizsgált három paraméter egyikében sem (az adatokat nem mutatjuk be), ez a megállapítás összhangban áll a gyapot patkányok wt HPF3 fertőzésével kapcsolatos korábbi megfigyelésekkel (18).

A HPF3 receptor-kötő és neuraminidáz variánsai által okozott fokozott betegség következményei.

A C-22 és C-0 variánsok fokozott fúziót okoznak a sejttenyészetben a szialinsavat tartalmazó receptor megnövekedett HN aviditása miatt (12). Megállapítottuk, hogy míg a C-22-nek és a C-0-nak nincs előnye a tüdőben történő replikáció szempontjából, és valójában egy kicsit alacsonyabb titerre replikálódik, mint a wt vírus, fokozott patológiát okoznak. A megváltozott HN, megnövekedett receptor iránti érzékenységével tehát a tüdő patogenezisének egyik meghatározója.

A C-28 a wt HPF3 neuraminidáz aktivitásának csak körülbelül 40% -át teszi ki, ami a fertőzött sejt felszínéről való lassú felszabadulás miatt kezdeti növekedési késést okoz. A C-28 variáns felszabadulása végül utoléri a tömeg tömegét, mivel a felhalmozódott virionok lehetővé teszik a megfelelő neuraminidáz aktivitást. Ennek a variánsnak egy másik jellemzője, hogy szélesebb körű fúziót okoz a sejttenyészetben, mint a tömeg, mivel az alacsonyabb neuraminidáz aktivitás több receptet hagy a szomszédos sejteken kölcsönhatásba a HN-vel. Nagy érdeklődés volt tehát annak meghatározása, hogy ez a vírus kevesebb betegséget okoz-e a kezdeti növekedési lemaradás miatt, vagy a sejttenyészetben tapasztalt magasabb fuzogenitása súlyosabb betegséget eredményez-e a tüdőben.

Azt javasolták, hogy az influenza vírus esetében a neuraminidáz aktivitás fontos lehet a légzőszervi mucinosavak eltávolításában, lehetővé téve a vírus célsejtjeihez való eljutást (1). Míg egy neuraminidáz-hiányos influenza vírus mutáns alkalmazásával végzett kutatás azt mutatja, hogy az egerek légzőrendszerében történő replikációhoz nem feltétlenül szükséges a neuraminidáz funkció (10), lehetséges, hogy egy ilyen mechanizmus hozzájárul a patogenezishez. Precedens van a virulencia csökkenésére az állatok influenza vírusainak csökkent neuraminidáz aktivitásának eredményeként (16, 26). Ezért lehetséges, hogy a C-28 kevésbé virulens lehet, mint a tömeg HPF3. A fent említett lehetőség mellett a C-28 vírus utódainak a gazdasejt felszínéről való felszabadulásának késleltetése megakadályozhatja a vírus átterjedését a tüdő új sejtjeire, megakadályozva ezzel a súlyos betegségeket. Eredményeink azonban azt mutatják, hogy a neuronaminidáz hiányát okozó HN mutációval rendelkező C-28 fokozott patológiával jár.

Több bizonyíték is felvetette annak lehetőségét, hogy a receptor-kötő és a neuraminidáz aktivitások közötti egyensúly kritikus lehet a HPF3 életciklusa szempontjából. Korábban kimutatták (13), hogy a neuraminidáz szintje határozza meg, hogy a tenyészetben a HPF3 fertőzés kimenetele akut sejtfúziós vagy tartós, fúzió nélküli fertőzés lesz-e. Más vizsgálatok kimutatták, hogy a fertőzött sejtkultúrában jelen lévő exogén neuraminidáz szelektív nyomása alatt, amely a rendelkezésre álló sziálsav-receptorok egy részének eltávolítását szolgálja, a vírusvariánsok két különféle típusa jelenik meg: (i) csökkent neuraminidáz-változatok (7) és (ii) megnövekedett receptorkötési aviditású variánsok (12, 14). Az a tény, hogy mindkét típusú változat azonos szelektív receptorhiányos nyomás alatt jelent meg, arra utal, hogy bármelyik funkció változása kompenzálhatja a receptorhiányt.

Hőmérséklet-érzékeny Newcastle-betegség vírus (NDV) variáns és két szekvenciális reverzáns vírus vizsgálata során kiderült, hogy a neuraminidáz változásai kompenzálhatják a kötődési változásokat (24, 25). Az eredeti NDV-variáns, aminosav-szubsztitúcióval a 129. pozícióban, hiányos volt a vörösvértestek megkötésében; egy második mutáció, a 175. pozícióban, csökkentette a neuraminidáz aktivitást, de helyreállította a kötődést; a harmadik szekvenciális mutáció, a 193. pozícióban, részben helyreállította a neuraminidáz aktivitást. Ez a szekvenciális evolúció azt sugallja, hogy a két tevékenység közötti egyensúly a szelektív előny és a túlélés meghatározója. Míg az NDV nemrégiben meghatározott kristályszerkezete (2) azt sugallja, hogy a HN katalitikus és kötõ funkciói egyetlen helyen találhatók, más adatok szerint az egyes mutációk az egyik funkciót befolyásolhatják anélkül, hogy befolyásolnák a másikat (17).

A pamut patkányok C-28 fertőzése ebben a vizsgálatban megvilágította azt a kérdést, hogy a HPF3 neuraminidáznak közvetlen vagy közvetett szerepe van-e a HPF3 patogenezisében. Az eredmények arra utalnak, hogy a C-28 HN neuraminidáz-hiánya nem okoz jelentős hibákat a vírus replikációs képességében, de intenzívebb betegségeket okoz a tüdőben. Nagyon érdekes lesz egy nemrégiben jellemzett variáns tesztelése, amely teljesen neuraminidázhiányos; Míg a C-28 a 40% wt neuraminidáz aktivitással rendelkezik, ez a variáns teljesen neuraminidáz hiányos, mégis képes hatékonyan megkötni és bejutni a sejtekbe (17).

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Közegészségügyi Szolgálat AI 31971 támogatással támogatta A.M. a Nemzeti Egészségügyi Intézetektől.

Köszönjük Richard Pelusónak és Olga Greengardnak a hasznos beszélgetéseket.