A dokozahexaénsav lipidomiás elemzése (22: 6, ω3) A nyugati étrend által kiváltott alkoholmentes steatohepatitis mediált csillapítása hím Ldlr -/- egerekben

A dokoszahexaénsav (DHA) által közvetített alkoholmentes steatohepatitis (NASH) remissziójának vizsgálata hím Ldlr -/- egerekben. Az ebben a lipidómikus elemzésben használt májmintákat a korábban közzétett tanulmányunkból nyertük, amely felmérte a DHA NASH remissziót elősegítő képességét [52]. Röviden, a 10 hetes egereknek chow-étrendet adtak (Purina Pico Lab diet 5053), és referencia-étrendként (RD) szolgálták őket. Az RD csoportot az RD-n a vizsgálat időtartama alatt, azaz 30 hétig tartották (hét; RD30, állatok száma (N) = 5). Az egereket a nyugati diétával (WD) (Research Diets, D12079B) is tápláltuk 22 hétig. 22 hét múlva a WD-vel táplált egerek egy csoportját eutanizálták a vér és a máj helyreállítása érdekében. Ez a csoport (WD22, N = 5) szolgált a betegség progressziójának alapjául. A maradék WD-vel táplált egereket olívaolajjal (WDO30, N = 6) vagy DHASCO-val (WDD30, N = 7) kiegészített WD-re cseréltük, és 8 hét múlva (8 hét) eutanizáltuk. További részletekért lásd: Anyagok és módszerek.

A diéta hatása a membrán lipidjeire. (A): A lipidek kumulatív telítettségi indexe minden lipidosztályban. A telítettségi indexet (SI) a következőképpen számítottuk ki: egy mínusz (a kettős kötések száma) elosztva (a zsíros acil-szénatomok száma mínusz egy). A kumulatív telítettségi index kiszámításához az SI-t megszorozzuk az egyes lipidfajok csúcsintenzitásával, és az összes lipidet összeadjuk az egyes lipidosztályokon belül. (B): A diéta hatása az összes lipidosztály kumulatív telítettségi indexére. Az eredményeket a változások számaként adjuk meg, átlag ± az átlag standard hibája (SEM); *, q q q -érték a hamis felfedezési arány (FDR) által korrigált p-érték].

A máj lipidjeire gyakorolt étrendi hatások fő összetevőjének elemzése. Az elemzés során felhasználták a tanulmány és az eddigi tanulmányunk [52] összes lipid adatait. Az adatok a korábban leírt zsírsav-metil-észtereket [52], valamint az UPLC-MS/MS és a HPLC-dMRM analízissel kapott összes membrán lipid és oxilipin adatot tartalmazzák. A főkomponens-elemzést a Metabolanalyst 4.0 [66] statisztikai csomagjának felhasználásával hajtották végre.

Hőtérkép, amely bemutatja az étrend hatásait a 25 legfontosabb lipid tulajdonságon. Mint a 3. ábrán, az összes lipidadatot felhasználtuk egy ANOVA (egyirányú) elvégzéséhez, és hőtérképet készítettünk a Metabolanalyst jellemzők statisztikai csomagjának felhasználásával [66]. A 25 legjelentősebb lipid tulajdonságot a hőtérkép szemlélteti. Az egyes lipidek q-értéke a hőtérkép bal oldalán található. A jobb oldali oszlopok az egyes lipidosztályok specifikus lipidjeit sorolják fel, amelyek a hőtérképen voltak. A nyilak jelzik a WDO30 és WDD30 étrend hatását az RD30 csoporthoz képest (növekedés, csökkenés, nincs változás (NC)) (vagy olívaolajjal (WDO), vagy DHASCO (WDD) kiegészítve.

Az ω6 PUFA (A) és ω3 PUFA (B) eredetű máj oxilipinekre gyakorolt WD és DHA hatások összefoglalása. A diagramok szemléltetik az étrendben esszenciális zsírsavak C18-22 PUFA-val történő átalakulásának és a PUFA oxilipinekké történő átalakulásának útját. Az útvonalakat a Gabbs et al. [61]. A kék színnel kiemelt oxilipinek az oxilipineket képviselik, amelyeket LC/MS vagy gázkromatográfia segítségével számszerűsítettünk (5. és 6. ábra). Az oxilipin metabolizmusában szerepet játszó enzimek szürke dobozokban vannak (7. ábra). Piros és zöld nyilakkal jelzik a WDO és az RD30 (piros nyilak) és a WDD30 és az RD30 (zöld nyilak) hatásait (növekedése; csökkenése) a zsírsavak, oxilipinek és a PUFA és az oxilipinek anyagcseréjében részt vevő transzkriptumok májbőségére. A vékony és vastag nyilak gyenge és erős választ jelentenek az étrendre. EFA: esszenciális zsírsavak; ROS, reaktív oxigénfajok. Hóbortok, zsírsav-deszaturáz; Elovl, zsírsav-elongáz; pβOx, peroxiszomális β-oxidáció; COX, ciklooxigenáz; ALOX, arachidon-lipoxigenáz; CYP, citokróm P450, Ephx1, mikroszómális epoxid-hidroláz; Ephx2, oldható epoxid-hidroláz.

Absztrakt

1. Bemutatkozás

93 millió felnőtt [10] és

Az Egyesült Államokban 14 millió gyermek [11] elhízott. Mint ilyen, mind az elhízott gyermekeket, mind a felnőtteket veszélyezteti a NAFLD kialakulása [12]. Az életmód, az étrend, a genetika és az endokrin státusz hozzájárul a NAFLD kialakulásához és az alkoholmentes steatohepatitis (NASH), a cirrhosis és az elsődleges hepatocelluláris rák (HCC) előrehaladásához [7,13]. Ezenkívül a NAFLD a szív- és érrendszeri betegségek kockázati tényezője [14,15,16]. A NAFLD legfontosabb négy kockázati tényezője az elhízás, a T2DM, a dyslipidaemia és a metabolikus szindróma [17,18].

2. Eredmények

2.1. A nyugati étrend (WD) hatása a membrán lipidekre

2.2. Az étrend hatása a máj nem észterezett oxilipinjeire

50% -át a munkadokumentumnak. Csak a Cyp2c29 expresszióját sikerült részben helyreállítani DHA hozzáadásával az étrendhez. Sem a WDO, sem a WDD nem befolyásolta a Cyp2J vagy Ephx altípusok expresszióját.

2.3. Társulások a máj lipidjei és a NASH gyulladás és fibrózis markerek között

2.3.1. Gyulladás

2.3.2. Fibrózis

3. Megbeszélés

4. Anyagok és módszerek

4.1. A DHA által közvetített NASH remisszió vizsgálata hím Ldlr -/- egerekben

A DHASCO-ban és a DHASCO-ban lévő összes acil-lánc 40% -a nem tartalmaz EPA-t, DPA-t (22: 5, co3), ARA-t vagy LA-t [50]. A DHA az étrendben 2% összes kalóriát tartalmaz (WDD30, n = 7). Az izokalórikus étrendek érdekében olívaolajat adtak a WD étrendhez, vagyis a WDO30-hoz. A WDO30 és WDD30 csoportokat 8 hétig tartottuk étrendjükön. Ezután az egereket egy éjszakán át éheztetett, és eutanizálták a máj és a vér összegyűjtésére. Az összes mintát az extrakcióig -80 ° C-on tároltuk. Ennek a tanulmánynak a kialakítása lehetővé tette a betegség progressziójának értékelését 22-től 30 hétig és a DHA képességét a betegség progressziójának befolyásolására (1. ábra).

4.2. RNS extrakció és qRTPCR

4.3. Minta előkészítés a lipidómikus elemzéshez

20–25 mg) kerámia gyöngyöket és LC – MS fokozatú hideg metanolt (240 μL) tartalmazó 2 ml-es előre súlyozott polipropilén csövekbe helyeztük. Deuterált lipid-visszanyerési standardokat (5 μl Splash ® Lipidomix ® tömegspecifikus szabványokat (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) adtunk minden mintához. A mintákat Precellys ® 24 gyöngyalapú homogenizátorban 2 percig 1350 1/perc sebességgel homogenizáltuk. . Hideg MTBE-t (750 μL) adtunk a mintákhoz, majd vortexeltük (10 s) és rázattuk (6 perc) 4 ° C-on. A fázisszétválasztást LC – MS minőségű víz (188 μL) hozzáadásával indukáltuk, majd vortexeltük és centrifugálás (14 000 fordulat/perc, 2 perc). A felső szerves fázist (300 μl) kinyerjük és Labconco centrivap vákuum-koncentrátorral (Kansas City, MO, USA) bepároljuk. A szárított lipid-kivonatokat metanol/toluol 9: 1 arányú elegyében szuszpendáljuk., v/v, 100 μl) keverék, amely további belső standardként CUDA-t (1-ciklohexil-ureido, 3-dodekánsav, 50 ng/ml; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) tartalmazott. A mintákat vortexeltük (10 s) és centrifugáltuk (14 000 fordulat/perc, 2 perc) az LC – MS/MS elemzés előtt.

4.4. Mintakészítés az oxilipinek elemzéséhez

4.5. Kromatográfiai és tömegspektrometriai körülmények lipidek és oxilipinek elemzéséhez

4.5.1. Céltalan lipidomika

35 000 teljes szélesség a maximum felénél (FWHM)) és nagy érzékenységű üzemmódban (

15 000 FWHM) az MS 2-ben. Az összes elméleti fragmens-ion spektrum (SWATH) szekvenciális ablakszerzését pozitív/negatív ion módban használtuk mint adatfüggetlen gyűjtési (DIA) rendszert az összes mintához. Az adatfüggő adatgyűjtést (DDA) külön minőség-ellenőrzési (QC) minta segítségével alkalmaztuk a SWATH-felvételből származó annotációk igazolására a leggyakoribb lipidfajok esetében. Részletes információk a SWATH-feltételekről, amelyek a Cél nélküli elemzés SWATH-paraméterek című kiegészítő információjában találhatók.