Metabolikus átalakítás az Endomyces magnusii élesztő tartós termesztése során oxidatív és fermentatív szubsztrátokon

A mitokondrium potenciálfüggő festése az E. magnusii sejtekben, amelyeket JC1 (A), Rh123 (B) emelt a logaritmikus növekedési fázisban. (D, E) - a sejteket a logaritmikus (D) és a késői álló szakaszban (E) neveltük fel, és 0,3 μM DAPI-vel jelöltük a DNS számára. A, B - a sejteket 0,5 µM JC1 vagy Rh123-mal inkubáltuk 20 percig. Az inkubációs közeg 0,01 M foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS), 1% glicerint, pH 7,4 tartalmazott. A magas mitokondriális polarizáció területeit a koncentrált festék miatt élénk-sárga (A), élénk-vörös (B) fluoreszcencia jelzi. Az Rh123-festett készítmények vizsgálatához 02, 15 (Zeiss) szűrőket használtunk (100-szoros nagyítás). A fényképek AxioCam MRc kamerával készültek. C - az E. magnusii sejtek ultrastruktúrája 30 perces inkubálás után. N - mag, Mito - mitokondrium, V - vakuola. (C) - az E.magnusii sejtek infrastruktúrája. N - magok, V - vakuolok, Mito - mitokondriumok.

Az E. magnusii élesztő (A) és a sejt energiaállapotának (B) növekedési görbéi glicerint és glükózt tartalmazó táptalajon. (A) - Az abszorbanciát kétóránként értékeltük 590 nm (A590) hullámhosszú sejtszuszpenzióban spektrofotométer segítségével. A bemutatott adatok három független tenyésztés átlagát jelentik (összehasonlítható eredményekkel), mindegyik három példányban, a szórással. (B) - az E. magnusii élesztő mikroképei a logaritmikus növekedési fázisban glicerin- (a) és glükóz- (b) tartalmú táptalajokban. (B), (c - h) - a különböző növekedési fázisokban felnövekedett E. magnusii sejtek potenciálfüggő festése Rh123-mal. A sejteket 0,5 µM Rh123-mal inkubáltuk, és 0, 15, 20 és 30 perc után megvizsgáltuk. Az inkubációs táptalaj 0,01 M foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS), 1% glicerint vagy 1% glükózt tartalmazott, pH 7,4. A magas mitokondriális polarizációjú régiók élénkvörösek a koncentrált festék miatt. (Ba, c, e, g) - glicerintartalmú táptalaj; (Bb, d, f, h) - glükóztartalmú közeg. (c, d) - logaritmikus fázis; (e, f) —96 óra növekedés; (g, h) - 168 óra növekedés. Az Rh123-festett készítmények vizsgálatához 02, 15 (Zeiss) szűrőket használtunk (nagyítás × 100). A fényképek AxioCam MRc kamerával készültek.

A glicerint és glükóztartalmú táptalajban termesztett élesztő túlélése (A). Az eredményeket átlagértékekként ± SEM (n = 4) mutatjuk be. * A glükóz-hasznosító és a glicerint hasznosító sejtek közötti különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak (p B - E) - az E. magnusii élesztő mikroképei a glicerin 96 (B, C) és 168 (D, E) órás növekedésében - (C, E) és glükóz- (B, D) tartalmú táptalajok. A sejtek életképessége érdekében a különböző növekedési fázisokból származó élesztősejteket centrifugáltuk, steril vízzel mostuk. Az élesztősejteket PBS-ben szuszpendáltuk, és a sejt-szuszpenzió 200 µl-es mintáját összekevertük 100 µl metilénkékkel és 5 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Az életképességet fénymikroszkóppal vizsgáltuk Gorjajev kamrájával (× 400), legalább 1000 sejtből, egy biológiai ismétlésben. Az életképes sejtek színtelenek, az elhaltak pedig kékek voltak. (b - e) —Foltos hígítási vizsgálatok glükózt (b, d) vagy glicerint (c, e) tartalmazó YPD táptalajban (foltonként 2 µL) a 96 (b, c) és 168 (d) hőmérsékleten emelt E. magnusii élesztő számára, e) a növekedés órái.

A glicerint és glükóztartalmú táptalajban termesztett élesztő túlélése (A). Az eredményeket átlagértékekként ± SEM (n = 4) mutatjuk be. * A glükóz-hasznosító és a glicerint használó sejtek közötti különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak (p B - E) - az E. magnusii élesztő mikroképei a glicerin 96 (B, C) és 168 (D, E) órás növekedésében - (C, E) és glükóz- (B, D) tartalmú táptalajok. A sejtek életképessége érdekében a különböző növekedési fázisokból származó élesztősejteket centrifugáltuk, steril vízzel mostuk. Az élesztősejteket PBS-ben szuszpendáltuk, és a sejt-szuszpenzió 200 µl-es mintáját összekevertük 100 µl metilénkékkel és 5 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Az életképességet fénymikroszkóppal vizsgáltuk Gorjajev kamrájával (× 400), legalább 1000 sejtből, egy biológiai ismétlésben. Az életképes sejtek színtelenek, az elhaltak pedig kékek voltak. (b - e) —Foltos hígítási vizsgálatok glükózt (b, d) vagy glicerint (c, e) tartalmazó YPD táptalajban (foltonként 2 µL) a 96 (b, c) és 168 (d) hőmérsékleten emelt E. magnusii élesztő számára, e) a növekedés órái.

Becslések az összes sejtes dién konjugátum (DC) és a reaktív oxigénfaj (ROS) szintjéről a glicerin- (A) és a glükóz- (B) asszimiláló E. magnusii élesztőkben, különböző növekedési stádiumokban. Az intracelluláris ROS-termelés dinamikáját a H2DCF-DA dihidro-2 ', 7'-diklór-fluoreszcein-diacetát-észter spektroszkópos fluoreszcens szondájával követtük nyomon. Az összes sejtes DC-t heptán és izopropil keverékével extraháltuk, és 4000 x g-n 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót kevés vízzel összekeverjük, a heptánfázist etanolban oldjuk. A 220-300 nm közötti ultraibolya abszorpciós spektrumok spektrumát a Beckman DU-8 spektrofotométerrel mértük úgy, hogy a maximum 232–234 nm, a váll pedig 260–280 nm volt. A DC-k kiszámításához 2,2 × 105 × M −1 × s –1 cm l moláris extinkciós együtthatót alkalmaztunk. A kísérletek inkubációs közege 50 mM KPi-t (pH 5,5) tartalmazott; és 1% glükóz. Az értékek átlagosan ± S.E.M 5–6 független kísérletből származnak. A ROS termelés intenzitása a "pozitív kontroll" változatában 234195,83 fluoreszcencia intenzitást, egységet tett ki. a, b, c — 0,05> p> 0,005.

Absztrakt

A mitokondrium potenciálfüggő festése az E. magnusii sejtekben, amelyeket JC1 (A), Rh123 (B) emelt a logaritmikus növekedési fázisban. (D, E) - a sejteket a logaritmikus (D) és a késői álló szakaszban (E) emeltük, és 0,3 μM DAPI-vel jelöltük a DNS számára. A, B - a sejteket 0,5 μM JC1 vagy Rh123-mal inkubáltuk 20 percig. Az inkubációs közeg 0,01 M foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS), 1% glicerint, pH 7,4 tartalmazott. A magas mitokondriális polarizáció területeit a koncentrált festék miatt élénk-sárga (A), élénk-vörös (B) fluoreszcencia jelzi. Az Rh123-festett készítmények vizsgálatához 02, 15 (Zeiss) szűrőket használtunk (100-szoros nagyítás). A fényképek AxioCam MRc kamerával készültek. C - az E. magnusii sejtek ultrastruktúrája 30 perces inkubálás után. N - mag, Mito - mitokondrium, V - vakuola. (C) - az E.magnusii sejtek infrastruktúrája. N - magok, V - vakuolok, Mito - mitokondriumok.

Az E. magnusii élesztő (A) és a sejt energiaállapotának (B) növekedési görbéi glicerint és glükózt tartalmazó táptalajon. (A) - Az abszorbanciát kétóránként értékeltük 590 nm (A590) hullámhosszú sejtszuszpenzióban spektrofotométer segítségével. A bemutatott adatok három független tenyésztés átlagát jelentik (összehasonlítható eredménnyel), háromban, a szórással. (B) - az E. magnusii élesztő mikroképei a logaritmikus növekedési fázisban glicerin- (a) és glükóz- (b) tartalmú táptalajokban. (B), (c - h) - a különböző növekedési fázisokban felnövekedett E. magnusii sejtek potenciálfüggő festése Rh123-mal. A sejteket 0,5 µM Rh123-mal inkubáltuk, és 0, 15, 20 és 30 perc után megvizsgáltuk. Az inkubációs táptalaj 0,01 M foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS), 1% glicerint vagy 1% glükózt tartalmaz, pH 7,4. A magas mitokondriális polarizációjú régiók élénkvörösek a koncentrált festék miatt. (Ba, c, e, g) - glicerintartalmú táptalaj; (Bb, d, f, h) - glükóztartalmú közeg. (c, d) - logaritmikus fázis; (e, f) —96 óra növekedés; (g, h) - 168 óra növekedés. Az Rh123-festett készítmények vizsgálatához 02, 15 (Zeiss) szűrőket használtunk (nagyítás × 100). A fényképek AxioCam MRc kamerával készültek.

A glicerint és glükóztartalmú táptalajban termesztett élesztő túlélése (A). Az eredményeket átlagértékekként ± SEM (n = 4) mutatjuk be. * A glükóz-hasznosító és a glicerint használó sejtek közötti különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak (p B - E) - az E. magnusii élesztő mikroképei a glicerin 96 (B, C) és 168 (D, E) órás növekedésében - (C, E) és glükóz- (B, D) tartalmú táptalajok. A sejtek életképessége érdekében a különböző növekedési fázisokból származó élesztősejteket centrifugáltuk, steril vízzel mostuk. Az élesztősejteket PBS-ben szuszpendáltuk, és a sejt-szuszpenzió 200 µl-es mintáját összekevertük 100 µl metilénkékkel és 5 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Az életképességet fénymikroszkóppal vizsgáltuk Gorjajev kamrájával (× 400), legalább 1000 sejtből, egy biológiai ismétlésben. Az életképes sejtek színtelenek, az elhaltak pedig kékek voltak. (b - e) —Foltos hígítási vizsgálatok glükózt (b, d) vagy glicerint (c, e) (foltonként 2 µl) tartalmazó YPD táptalajban a 96 (b, c) és 168 (d, e) a növekedés órái.