Új résztvevő az alkoholos gasztritisz patogenezisében: Pyroptosis

A Harbin Orvostudományi Egyetem második kapcsolt kórháza,

Általános Sebészeti Osztály, Harbin, 150000 (Kína)

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

Facebook
Twitter
LinkedIn
Email

Absztrakt

Bevezetés

Az alkoholtartalmú italok fogyasztása a társas összejövetelek közös jellemzője, és mindenféle alkoholos ital fő összetevője az etanol. Az etanol fogyasztása körülbelül 60 különféle betegséghez kapcsolódik [1–4]. Köztudott, hogy az alkoholfogyasztás heveny eróziós vérzéses gasztritist okozhat, a hosszú távú ivás pedig gyomorzavarokat és krónikus atrófiás gasztritist okozhat [5-7]. Általánosságban elmondható, hogy a gyomorhurut főként a gyomornyálkahártya agresszív és védekező tényezői közötti egyensúlyhiány miatt következik be, amely különféle problémákat okoz, a helyi hibáktól kezdve az aktív gyulladásig [8-11]. Ez a fajta krónikus gyulladás egyre inkább elismeri, hogy jelentős tumor-elősegítő potenciállal rendelkezik [12, 13]. A gyulladás progressziójának pontos szabályozása döntő fontosságú a krónikus gyulladásos rendellenességek és a patogenetikai állapotok elpusztításának elnyomása szempontjából. A gyomorhurut jelenlegi terápiás ágenseit általában a gyomorsav szekréciójának gátlására és a nyálkahártya védekező mechanizmusainak stimulálására használják [14-18]. Ezek a stratégiák azonban általában túlérzékenység, gynecomastia, impotencia, arrhythmia és hematopoieticus változások miatt kudarcot vallanak [19-21]. Ezért a gastritis mechanizmusainak feltárása és új terápiás szerek megtalálása létfontosságú.

Anyagok és metódusok

Sejtkultúra és kezelés

A GES-1 sejteket az ATCC-től nyertük. A sejteket 10% magzati szarvasmarha-szérumot tartalmazó RPMI-1640-ben (HyClone, Logan, UT, USA) növesztettük (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Izrael), és 37 ° C-on, nedvesített levegőben, 5% CO2-vel inkubáltuk. A 96 lyukú lemezre történő beoltás után a sejteket etanollal kezeltük 0, 0,5%, 1%, 2%, 4%, 8% és 16% koncentrációban. MTT vizsgálatot alkalmaztunk a sejt életképességének meghatározására. Az etanol és a kaszpáz-1 inhibitor (100 μM) hatásainak feltárása érdekében a sejteket etanollal vagy mind etanollal, mind a kaszpáz-1 inhibitorral kezeltük.

MTT assay

A sejtek életképességének mérésére lyukanként 1 × 104 sejtet oltottunk egy 96 üregű lemezre, és a korábban leírtak szerint kezeltük. A kezelés után 10 μl MTT-reagenst (0,5 mg/ml) adunk az egyes mélyedésekhez, és 4 órán át 37 ° C-on inkubáljuk. A lyukakban lévő formazin szemcséket 150 μl dimetil-szulfoxiddal (DMSO) oldottuk, és az abszorbancát 570 nm-en mikroplate-olvasóval mértük.

TUNEL festés

A DNS-károsodást terminális dezoxinukleotidil-transzferáz-közvetített dUTP nick-end jelölés (TUNEL) festéssel detektáltuk apoptotikus sejtdetektáló készlettel a gyártó utasításait követve (Promega, Madison, WI, USA).

HE festés

Hematoxilin és eozin (HE) festést alkalmaztunk a szövettani változások megfigyelésére. Az egerekből vagy a gyomorrákos szövetekből származó gyomorszöveteket és az emberek szomszédos normál szöveteit 4% paraformaldehidben rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. A mintákat 5 μm vastag szakaszokra vágtuk és HE-vel festettük.

Immunfluoreszcens festés

Az immunfluoreszcens festéshez a tenyésztett sejteket 4% pufferolt paraformaldehiddel rögzítettük. A sejteket ezután PBS-ben mostuk és blokkoló oldattal (1% BSA és 0,1% Triton-X PBS-ben) inkubáltuk. Ezt követően a sejteket inkubáltuk kaszpáz-1 elleni elsődleges antitestekkel egy éjszakán át 4 ° C-on, majd inkubáltuk a szekunder antitesttel (Invitrogen) 1 órán át szobahőmérsékleten. A magokat 4 ’, 6-diamidino-2-fenil-indol (DAPI; Beyotime, Shanghai, Kína) alkalmazásával 20 percig szobahőmérsékleten festettük. A képeket fluoreszcens mikroszkóppal rögzítettük.

Immunhisztokémiai festés

Az immunhisztokémiai elemzéshez a fagyasztott gyomorszelvény mintákat 4% -os pufferolt paraformaldehiddel rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. A mintákat egy növekvő etanol-sorozattal dehidratáltuk és xilollal megtisztítottuk. Valamennyi metszetet egy éjszakán át 4 ° C-on kaszpáz-1, IL-1β és IL-18 elleni primer antitestekkel festettük. Szekunder antitestekkel végzett inkubálás után a metszeteket diaminobenzidinnel festettük.

Enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat

A táptalajt az IL-1β és az IL-18 mérésére gyűjtöttük egy ELISA kit segítségével (uscn-SEA064R és uscn-SEA563Ra), a gyártó utasításainak megfelelően [35].

Az alkoholos gyomorhurut egérmodellje

Hím Kungming egereket (25-30 g) a Harbin Orvostudományi Egyetem Kísérleti Állatközpontjából szereztünk be. Ezeket az egereket három csoportra osztottuk, mindegyik csoportban öt egér volt. A kontroll és az etanol csoportokban az egereket külön kezeltük sóoldattal vagy 2% etanollal (20 ml/kg/nap). A kaszpáz-1 inhibitor és etanol csoportban az egereknek intraperitoneálisan 2% etanolt vagy 2% etanolt adtak kaszpáz-1 inhibitorral (20 mg/kg/nap). A kezelés után 15 nappal az egereket érzéstelenítjük és méhnyak diszlokációval eutanizáljuk. A gyomrokat összegyűjtöttük és sóoldattal öblítettük, és a következő kimutatásra használtuk. Az összes kísérleti protokollt a kínai Harbin Orvostudományi Egyetem Kísérleti Állatetikai Bizottsága előzetesen jóváhagyta. Az állatok felhasználását az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézete kiadta a Laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatóval (NIH, 85–23. Kiadvány, felülvizsgált 1996).

qRT-PCR

A sejtekből vagy szövetekből származó összes RNS-t Trizol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extraháltuk. Az extrahált RNS-t reverz transzkripcióval kettős szálú cDNS-be fordítottuk egy reverz transzkripciós készlet segítségével (Toyobo, Osaka, Japán). Ezt követően a SYBR Green PCR Master Mix Kit-t (Applied Biosystems, Calif, USA) alkalmaztuk a kaszpáz-1 és IL-1β mRNS-expressziójának mennyiségi meghatározására. Valós idejű PCR-t a 7500 FAST valós idejű PCR rendszerrel (Applied Biosystems, CA, USA) végeztünk, kontrollként a GAPDH-t használva. A kaszpáz-1 előre és hátra láncindító szekvenciája 5’-TTTCCGCAAGGTTCGATTTTCA-3 ’, illetve 5’-GGCATCTGCGCTCTACCATC-3’. Az IL-1β esetében az előremutató primer 5’-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA-3 ’, a reverz primer pedig 5’-GTCGGAGATTCGTAGCTGGA-3’ volt. Az IL-18 esetében az elsődleges primer 5’-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3 ’, a fordított primer pedig 5’-CAGCCGCTTTAGCAGCCA-3’ volt.

Western blot elemzés

A teljes fehérjét RIPA pufferrel (Thermo, Shanghai, Kína) extraháltuk, amely fenil-metánszulfonil-fluoridot (PMSF) tartalmaz (Beyotime, Kína). Az összes fehérjekoncentrációt Bradford assay-vel és Protein Assay Kit-rel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) mértük. Harminc μg fehérje-lizátumot nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézisnek vetünk alá (SDS-PAGE), és PVDF membránokra visszük (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA). A PVDF membránokat 5% BSA-val blokkoltuk 0,05% Tween 20-TBS-ben 1 órán át, és a megfelelő primer antitesttel inkubáltuk. Ezután az elegyeket blokkoló pufferban hevítettük egy éjszakán át 4 ° C-on. Az elsődleges antitestek hígításai a következők voltak: anti-kaszpáz-1 (1: 1, 000, Cell Signaling, 2225), anti-IL-1β és anti-IL-18 (1: 400, Santa Cruz Biotech). TBST-vel végzett alapos mosás után anti-nyúl IgG-HRP szekunder antitestet (1: 5 000, Santa Cruz Biotech) adtunk hozzá. A fehérjetsávokat a továbbfejlesztett kemilumineszcencia technikával, SuperSignal West Pico kemilumineszcens szubsztráttal (Thermo Fisher Scientific, USA) tettük láthatóvá.

Statisztikai analízis

Az összes statisztikai elemzést az SPSS 17.0 szoftver (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) segítségével végeztük. Egyirányú ANOVA-t végeztek a normálisan elosztott adatokhoz. Az összes adatot átlag ± SD-ként fejeztük ki. Statisztikai szignifikanciát P