A Cideb a lipogenezis és a zsírsav-oxidáció szabályozásával szabályozza az étrend okozta elhízást, a máj steatosisát és az inzulinérzékenységet.

Absztrakt

CÉLKITŰZÉS-Korábbi tanulmányunk azt sugallja, hogy az elhízás kialakulásában fontos szerepet játszik a Cidea, a Cide család fehérjéinek tagja, amelyek szekvencia-homológiát mutatnak a DNS-fragmentációs faktorral és magas szinten expresszálódnak a barna zsírszövetben. A Cideb, a Cide család fehérjéjének egy másik tagja, nagyon expresszálódik a májban. Szeretnénk megérteni a Cideb fiziológiai szerepét az energiafelhasználás és a lipid anyagcsere szabályozásában.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREKColdb-null egereket állítottunk elő homológ rekombinációval, majd mind a vad, mind a Cideb-null egereket magas zsírtartalmú étrenddel (58% zsírtartalom) tápláltuk. Ezután jellemeztük az állatok adipozitási indexét, táplálékfelvételét, az egész test anyagcseréjét, a máj morfológiáját, a zsírsavszintézis és -oxidáció sebességét, az inzulinérzékenységet és a génexpressziós profilt.

EREDMÉNYEK-A Cideb-null egereknél alacsonyabb volt a plazma trigliceridek és a szabad zsírsavak szintje, ellenálltak a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízásnak és az élő steatosisnak. Ezenkívül a Cideb mutáns egerek jelentősen megnövekedett inzulinérzékenységet, az egész test metabolizmusának és a máj zsírsav oxidációjának fokozott sebességét mutatták. Ennél is fontosabb, hogy a Cideb-null egerek csökkent lipogenezist és csökkent acetil-CoA karboxiláz, zsírsav szintáz és sztearol-CoA deszaturáz expressziós szinteket mutattak. Kimutattuk továbbá, hogy az 1c szterin-válasz elemet megkötő fehérje expressziós szintje szignifikánsan csökkent Cideb-hiányos egerekben.

KÖVETKEZTETÉSEKAdataink azt mutatják, hogy a Cideb egy új fontos szabályozó a máj lipidanyagcseréjében. A Cideb új terápiás célpontot jelenthet az elhízás, a cukorbetegség és a máj steatosis kezelésében.

ACC, acetil-CoA karboxiláz
BAT, barna zsírszövet
CPT, karnitin-palmitoil-transzferáz
FAS, zsírsav-szintáz
G6P, glükóz-6-foszfatáz
GTT, glükóz tolerancia teszt
IRS, inzulinreceptor szubsztrát
ITT, inzulin tolerancia teszt
NEFA, nem észterezett zsírsav
PGC, peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor γ koaktivátor
PPAR, peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor
SCD1, sztearol-CoA deszaturáz 1
SREBP1c, szterin-válasz elem kötő fehérje 1c
TAG, triacil-glicerin
WAT, fehér zsírszövet

A máj lipid homeosztázisának változása számos tényező túlexpressziója vagy genetikai mutációja révén gyakran metabolikus rendellenességeket eredményez, mint például elhízás, cukorbetegség és máj steatosis. Például az ACC2 -/- egereknél nagyobb a zsírsav oxidáció aránya (7), és ellenállnak a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott elhízásnak és cukorbetegségnek (3). Az SCD1-hiányban szenvedő egerek, a palmitinsav telítetlen zsírsavakká válásának folyamatát katalizáló enzimek fokozott zsírsav-oxidációval, csökkent testzsírtartalommal és fokozott inzulinérzékenységgel rendelkeznek, és ellenállnak az étrend okozta elhízásnak és a máj steatosisának (8,9). Az SREBP-1c konstitutívan aktív nukleáris formájának célzott túlzott expressziója a májban a downstream célgének tömbjének aktiválódását és a zsírmáj képződését eredményezte (10).

A cid fehérjék, köztük a Cidea, a Cideb és az Fsp27 (Cidec), homológiát mutatnak a DFF40/45 DNS fragmentációs faktorral az NH2-terminális régióban (11). Korábbi adatainkból kiderült, hogy a Cidea magas szinten expresszálódik a barna zsírszövetekben (BAT), és hogy a Cidea-null egerek nagyobb energiafogyasztást és fokozott lipolízist mutatnak BAT-ban, és ellenállnak a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízásnak és cukorbetegségnek (12). Nemrégiben kimutatták, hogy a Cidea közvetíti az emberi elhízást az emberi adipocita lipolízisének szabályozásával (13), és az emberekben előforduló V115F polimorfizmus bizonyos populációkban elhízással jár (14). A Cideb mRNS-eket számos más szövetben detektálták, korábban magas a máj expressziós szintje (11); biológiai szerepe azonban nem világos. Heterológ sejtekben túlexpresszálva a Cideb fehérjék homo-dimmert képezhetnek, és kaszpázfüggetlen sejtpusztulást okozhatnak (15). Ebben a tanulmányban Cideb knockout egereket állítottunk elő, és kimutattuk, hogy a Cideb-hiányos egerek nagyobb energiafelhasználást és jobb inzulinérzékenységet mutatnak, és ellenállnak a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízásnak, hiperlipidémiának vagy máj steatosisnak. Adataink új utat tárnak fel a lipogenezis és a zsírsav oxidációjának Cideb általi szabályozásában a májban.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Cideb-null egerek generálása és állatok fenntartása.

A genomi klónok izolálásának, a Cideb-hiányos egerek előállításának és az egér törzsének rutinszerű fenntartásának eljárásai lényegében megegyeztek a korábban leírtakkal (12). Az állatokat normál chow-étrenddel (5053, PicoLab Rodent Diet 20) vagy magas zsírtartalmú étrendet (D12331, a kilokalóriák 58% -a zsírból; Research Diets) etették. A magas zsírtartalmú diétás kezelés során a 3 hetes egereket 19 héten át magas zsírtartalmú étrendnek vetették alá. A koplalási és újratáplálási kísérletekhez az éhezési csoport egereit 24 órán át éheztettük, az etető csoportban pedig 24 órán át éheztettünk, majd az elemzés előtt 12 órán keresztül hozzáférést biztosítottunk élelemhez és vízhez (16). Minden egérkutatási tevékenységet felülvizsgált és jóváhagyott a Hongkongi Tudományos és Technológiai Egyetem és a Tsinghua Egyetem állatkutatási bizottsága.

Southern-blot, genotipizálás PCR-analízissel, RNS-extrakció és valós idejű kvantitatív RT-PCR-analízis.

A genomi DNS-t izoláltuk az egérfarkakból, és Southern blot elemzésnek vetettük alá, amint azt korábban leírtuk (17). Próbaként a Cideb genomiális DNS AvrII és NcoI helyei (1C. Ábra) közötti DNS-fragmenst használtuk. A genotipizálás rutin módszereként PCR analízist alkalmaztak. A teljes RNS-t TRIzol-reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA) izoláltuk. Az első szálú cDNS-t 1 μg teljes RNS-ből szintetizáltuk oligo- (dT) 20 primerekkel, Superscript III RT kit (Invitrogen) alkalmazásával, a gyártó protokollja szerint. A valós idejű PCR-eket ABI SYBR GREEN PCR Master Mix-szel végeztük az MX3000P valós idejű PCR rendszerben (Stratagene) a gyártó utasításainak megfelelően. Az eredményeket minden mintában β-aktin szintre normalizáltuk. Kérésre alapozó szekvenciák állnak rendelkezésre.

Teljes test oxigénfogyasztása, táplálékfelvétel, glükóz/inzulin tolerancia teszt, zsírszint index és vérkémia.

A teljes test oxigénfogyasztását, a légzéscsere arányát, a napi táplálékfelvételt, a glükóz- és inzulin-tolerancia teszteket (GTT és az ITT), valamint az adipozitási indexet a korábban leírtak szerint végeztük (12 A vérkémia szempontjából a trigliceridek (TAG), a nem észterezett zsírsavak (NEFA), az inzulin, a leptin és a glükóz szérumszintjét mértük a korábban leírtak szerint (12). Kereskedelmi készletet használtunk a ketontestek (Wako Chemical), az adiponektin és az ellenállás szérumszintjének meghatározására (Linco Research).

Western blot elemzés, ACC aktivitás és inzulin infúzió.

Az egér Cideb elleni nyúl poliklonális antitestjét úgy állítottuk elő, hogy His-jelölt csonka Cideb fehérjét (1–176. Aminosavak) injektáltunk nyulaknak a korábban leírtak szerint (18). Western-blot-analízist lényegében a korábban leírtakkal hajtottak végre (12). Májmag- és membránkivonatokat készítettünk a korábban leírtak szerint (19). A Western blot elemzéséhez használt antitestek részletes információit egy online függelék mutatja, amely a http://dx.doi.org/10.2337/db07–0040 címen érhető el. A Western blot jelet az AlphaEase szoftverrel (Alpha Innotech, San Leandro, CA) számszerűsítettük. Az ACC aktivitást a [14C] -hidrogén-karbonát-rögzítési vizsgálattal (20) határoztuk meg. Az inzulin infúziós kísérletet olyan egerek alkalmazásával végeztük, amelyek 4 órán át éheztek a portális vénán keresztül 3 percig, az előzőekben leírtak szerint (21).

Statisztikai analízis.

Az összes adat átlag ± SE értékként jelenik meg. A csoportok közötti különbségeket kétfarkú, nem párosított vagy párosított Student-teszt segítségével értékeltük a Graphpad Prism statisztikai szoftver (Graphpad Software) segítségével.

EREDMÉNYEK

A Cideb mRNS nagyon gazdag a májban.

A Cideb pontos szöveteloszlási mintázatának jellemzésére vad típusú egerek különböző szöveteiből izoláltunk RNS-t, és szemikvantitatív PCR-analízist végeztünk. Megfigyeltük, hogy a Cideb magasan expresszálódik a májban és kisebb mértékben a vesében (1A. Ábra). A vékonybélben és a vastagbélben a Cideb alacsonyabb expressziós szintjét (legalább 50-szer alacsonyabb, mint a májban). Nem találtunk Cideb mRNS-t BAT-ban, fehér zsírszövetben (WAT) vagy vázizomban. Western blot-analízis az egér Cideb ellen termelt antitest alkalmazásával tovább megerősítette, hogy a Cideb fehérje magas szinten van jelen a májban és mérsékelten a vesében (1B ábra).

Cideb-hiányos egerek generálása.

A Cideb fiziológiai szerepének tisztázása érdekében Cideb genomi DNS-t izoláltunk, és homológ rekombinációval Cideb-null egereket generáltunk. A Cideb kiütés géncélzási stratégiáját az 1C. Ábra mutatja, hogy a három COOH-terminális exont pozitív szelekciós markerként a neomicin-rezisztens génnel helyettesítették (1C. Ábra). A genomi lokusz 5'-végén lévő 1,6 kb-os fragmenst (NcoI-PstI) rövid karként, a genomi lokusz 3'-végének pedig 7,2 kb méretű fragmenst (BamHI-HindIII) használtuk hosszú karként. . Southern blot-analízis AvrII és NcoI fragmensnek megfelelő próbával 5,2 kb méretű fragmenst mutatott ki Cideb mutáns egerekben a vad típusú egerek 3,2 kb méretű fragmense helyett, megerősítve, hogy a Cideb lókuszt a tervek szerint megbontották (1D ábra). Amint az az 1E. Ábrán látható, a Cideb-null egerekben nem detektáltunk Cideb fehérjét. A Cideb-null egerek rutin genotipizálását PCR analízissel végeztük (kutatási tervezés és módszerek). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a Cideb gént sikeresen megbontották, és a Cideb funkcionálisan null mutációját kapták.

A Cideb-hiányos egerek sovány fenotípusúak.

Mivel korábbi tanulmányunk a Cidea-null egerekről kimutatta, hogy döntő szerepet játszik az energia homeosztázisban, megvizsgáltuk a Cideb potenciális szerepét a testtömeg és az adipozitási index szabályozásában. Normál chow étrenddel etetve a Cideb-null egerek testtömege hasonló a vad típusú egerek testtömegéhez (1. táblázat). 19 hetes, magas zsírtartalmú étrendes etetés után azonban a Cideb-null egerek testtömege lényegesen alacsonyabb volt, mint a vad típusú egereké (2A. Ábra; P -/- egerek sovány fenotípusúak és ellenállnak az étrend- elhízást váltott ki.

A cidebhiányos egerek ellenállnak az étrend által kiváltott máj steatosisnak.

A Cideb mutáns egerekben a megnövekedett zsírsav-oxidációs sebesség mögött álló mechanizmus további feltárásához kvantitatív valós idejű PCR-analízissel elemeztük az ACC2 expressziós szintjét vad típusú és Cideb-null egerek májszövetében. Az ACC2 mRNS-szintje 80, illetve 60% -kal alacsonyabb volt Cideb-null egerekben normál etetési vagy újratáplálási körülmények között (4E. Ábra). A csökkent ACC2 mRNS-szinttel kötött megállapodásban az ACC2 fehérjék mennyisége alacsonyabb volt a Cideb mutáns egerekben (4F. Ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az ACC2, a CPT1 aktivitás és a zsírsav oxidáció negatív szabályozója expressziós szintje szignifikánsan csökkent Cideb-null egerekben, ami molekuláris magyarázatot ad a fokozott zsírsav oxidációra Cideb-null egerekben.

A Cideb-hiányos egereknél fokozott az inzulinérzékenység.

Cideb megcélzott megzavarása. V: A Cideb mRNS szöveti eloszlása. A valós idejű kvantitatív analízis eredménye a máj magas Cideb mRNS-szintjét mutatja. A többi a más szövetekben található Cideb mRNS szintjének összehasonlítása a májéval. SM, vázizom; SI, vékonybél. B: A Western blot elemzés eredménye. A Cideb fehérje magas szinten expresszálódik a májban és a vesében. C: A Cideb által megcélzott megszakítási stratégia sematikus ábrázolása: a Cideb-lokusz részleges restrikciós térképe (fent), géncélzási vektor (középső) és a mutált lókusz várható szerkezete (alul). Az aláhúzott régiót használtuk próbaként a Southern blot elemzéshez. A P1, P2 és P3 a PCR genotipizálásához használt primereket képviseli. D: Southern-blot elemzés. A 3,2 és 5,0 kb méretű fragmensek a vad típusú (+/+) és a mutáns (-/-) alléloknak felelnek meg. E: Western-blot elemzés vad típusú és mutáns májból előállított májlizátum felhasználásával; 100 μg májlizátumot töltöttünk be. A β-Tubulin töltésszabályozóként szolgált.