A citrus héj etanol kivonata gátolja a magas zsírtartalmú DIO modell okozta adipogenezist

2015. december 1-én kapott; 2016. január 17-én elfogadott; megjelent 2016. január 20

Az elhízás szoros kapcsolatban áll az alacsony fokú szisztémás gyulladással, amelyet hajlamosnak tekintenek az inzulinrezisztencia, a hiperglikémia és a kapcsolódó anyagcserezavarok előrehaladására [1] [2]. Ezenkívül az elmúlt évtizedek bizonyítékai alapján a zsírszövet kulcsfontosságú helyzetbe került a lipid- és glükóz-anyagcsere szabályozásában. Az adipocitákról kimutatták, hogy számos bioaktív molekulát választanak ki, elsősorban fehérjéket, például gyulladásgátló és pro-gyulladásos adipokinek, amelyek döntő szerepet játszanak a gyulladásos válaszokban [3] [4]. Felvetődött, hogy elhízás esetén az adipocyták és a makrofágok diszfunkciója, valamint az adipokinek romlott szekréciója krónikus gyulladásos választ eredményez [3]. A gyulladásgátló adipokinek, mint például az interleukin-6 (IL-6) és a tumor nekrózis-faktor alfa (TNF-a) megemelkedett szintje elsősorban az elhízásban az adipozitás növekedésével és az adipociták hibás működésével jár [5]. Feltételezték, hogy az elhízáshoz kapcsolódó gyulladás és a sejtkárosodás szorosan összefügg az adipocita lipolízissel. A TNF-alfa szignálútban az AMPK fontos célpont, a TNF-α pedig szuppresszívan hat az AMPK jelátviteli útjára, amely szabályozza a lipolízist és a zsír oxidációját az adipocitákban [6]. .

2.1. Citrus héj (CP) etanol kivonatának elkészítése

A friss C. unshiu gyümölcsöket 2012 novemberében vásárolták meg a The Village Green-től (Jeju, Dél-Korea) és hámozták meg. A C. unshiu héját 56 ° C-on szárítottuk 8 órán át, majd 1,823 kg mintához 7 liter 70% -os etanolt (Daehan Ethanol Life Co., Szöul, Dél-Korea) adtunk. 3 órán át 75 ° C-on végzett extrakció után a mintát lehűtjük, szűrjük és bepároljuk (EYELA N1100, Tokyo Rikakikai Co., Tokió, Japán). A végső összegyűjtött koncentrátum 445,7 g kivonat volt, 16,13% nedvességtartalommal. Ezután nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC, HP 1100, Agilent Technologies, Kalifornia, USA) elemzést végeztünk a mintán annak flavonoid összetételének kimutatására. A CP mintát feloldottuk metanolban, és egy 5 μm-es Supercosil LC-18 oszlopba injektáltuk. (250 × 4,6 mm Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, USA). 0,1 M NaOH-ban oldott hesperidint (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, USA) és standardként vízben oldott narirutint (Exstrasynthese, Lyon, Franciaország) használtunk. Acetonitrilt és 0,5% ecetsavat használtunk mozgófázisú oldószerként két oldószert pumpáló HPLC rendszerben. A mintákat a 0 időpontban injektáltuk, és a gradiens profil 0% -nál kezdődött az A oldószerelegynél, és 35 perc alatt 85% A-ra változott. Az áramlási sebességet 1,0 ml/perc értékre állítottuk be, és az oszlop hőmérsékletét az összes futtatás során 30 ° C-on tartottuk.

2.2. Állatkísérlet

2.3. Plazma biokémia

A vérplazmában lévő teljes koleszterint (TC), triglicerideket (TG) és nagy sűrűségű lipoprotein koleszterint (HDL-c) enzimes kolorimetriás módszerrel elemeztük vizsgálati készletekkel (Human 10028, 10724, 10084, Wiesbaden, Németország). Ugyanígy a májszövetek TG- és TC-koncentrációit is elemeztük ugyanezzel a módszerrel, miután a lipideket a szövetekben Folch-módszerrel extraháltuk [14]. Az alacsony sűrűségű lipoprotein-koleszterint (LDL-c) a Friedewald-képlettel, az aterogén indexet (AI) pedig a Rosenfeld-képlettel számoltuk [15]. Az aszpartát-aminotranszferázt (AST) és az alanin-aminotranszferázt (ALT) tesztkészlettel (Bio Vision K753-100, K752-100, CA, USA) mértük a szöveti toxicitás kimutatására, és az összes értéket az optikai abszorbancia mikrolemez-leolvasóval történő mérésével ( Thermo, MA, USA).

2.4. Adipocita morfológia

Az epididymális zsírszövet morfológiai változásait vizsgáltuk. Röviden, az összegyűjtött epididymális zsírszövetet 12% semleges formalin oldatban rögzítettük. 12 órás fixálás után a mintákat etanollal dehidratáltuk és xilollal mostuk, hogy paraffinba ágyazzuk. Végül a minták 0,4 μm-es szakaszait készítettük el a hematoxilin-eozin festésre (H&E, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, USA). A festett minták esetleges morfológiai változásait mikroszkóposan, inverz mikroszkóppal (Nikon Eclipse, Tokió, Japán) határoztuk meg, és képelemző szoftverrel (ImageJ, NIH, MD, USA) számoltuk ki.

2.5. Western Blotting

Az összegyűjtött egerek mesenterialis szövetét jéghideg RIPA pufferben lizáltuk az extrakcióhoz és a fehérje mennyiségét

Asztal 1 . Kísérleti étrendek összetétele magas zsírtartalmú étrendben indukált DIO modell.

C: Chow-étrend, HF: magas zsírtartalmú étrend, CP: magas zsírtartalmú étrend + citrushéj kivonat (300 mg/kg), O: magas zsírtartalmú étrend + orlisztát (30 mg/kg).

az összegyűjtött értékeket Bradford módszerrel mértük. Azonos mennyiségű fehérjét nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) választottuk el, nitrocellulóz membránra (ELPIS, Daejon, Dél-Korea) vittük át és 5% (w/v) sovány tejben blokkoltuk. A membránt ezután 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk monocita kemoattraktáns protein-1 (MCP-1), TNF-a, FAS, foszforilezett AMP-aktivált protein-kináz (P-AMPK), AMP- aktivált protein-kináz (AMPK), foszforilezett hormonérzékeny lipáz (P-HSL), hormonérzékeny lipáz (HSL) és α-tubulin. A membránhoz kötött jelölt fehérje sávokat ECL western blot oldattal vizualizáltuk, és kemilumineszcenciával detektáltuk röntgen filmekkel. Végül a Western blot sávsűrűségét képelemző szoftver segítségével határoztuk meg (ImageJ, NIH, MD, USA).

2.7. Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SD-ként fejeztük ki. Az egyes csoportok átlaga közötti különbségeket egyirányú ANOVA-val értékelték Duncan több tartományú tesztjeivel. A különbségek jelentőségét az 1. ábrán fejeztük ki. A narirutin (a) és a hesperidin (b) standardjának HPLC-kromatogramja, és mindkettőt kimutattuk a CP-kivonatokban (c). A HP 1100 (Agilent Technologies, USA) használatával az állapotuk az adott oszlop volt; LichroCART (LC-18, 5 μm, 250 × 4,6), detektor; DAD (530 nm), inj. vol .; 20 μL, áramlási sebesség; 1 ml/perc, oldószer-I; víz (0,1% AcOH), oldószer-II; Az AcCN (0,5% AcOH) és a gradiens állapotát 0-35 percig változtattuk.

jelentősen magasabb, mint a CP csoporté. Az orlisztát kezelő csoport volt az egyetlen csoport, amelynél a testtömeg csökkent.

3.3. Vérbiokémia és májtoxicitás

3.4. Adipociták morfológiája az epididymális szövetben

Az epididymális szövetben megfigyelt morfológiai változásokból H&E festéssel és az azt követő számításokkal

2. táblázat A citrus héj etanol kivonatai megváltoztatják a test és a zsír tömegét, a FER, valamint a vér és a máj lipid profilját.

Ez a tanulmány összehasonlította a CP-kezelést egy kezeletlen HF-csoporttal és az orlistat-kezeléssel. Eredményeink azt mutatják, hogy a CP kezelés összehasonlítható az orlistat kezelésével, nem olyan jó, mint az orlistat hatása a zsír felhalmozódásának csökkentésére, és kellő hitelességet biztosítanak arról, hogy a CP természetes forrása az új elhízás elleni jelöltnek. A flavonoidok aromás másodlagos növényi metabolitok, amelyek tápértékük miatt fontosak. Számos bioaktivitást mutatnak, például anti-adipogén, vírusellenes, antimikrobiális és gyulladáscsökkentő aktivitást [16] - [20]. A citrusfélék fontos forrása a bioaktív flavonoidoknak, amelyekre számos tanulmány foglalkozott, amelyek olyan természetes egészséget elősegítő anyagokat kutattak, amelyek különböző rendellenességekre, például zsírosodásra és elhízásra képesek hatni [21] [22]. Számos klinikai vizsgálat kimutatta, hogy a citrus-flavonoidok pozitív hatással vannak az elhízásra, például csökkentik az LDL-c és a TG értékét, és a májenzim-aktivitás szabályozásával negatívan hatnak a gyulladásgátló citokinekre [23] - [25]. .

A citrusfélékben a leggyakoribb flavonoidok a hesperidin, a narirutin és a neohesperidin; és főleg vizes alapú etanol vagy metanol oldatokkal extrahálják [26]. A legtöbb faj esetében a citrusfélék héjában lévő hesperidin mennyiségét magasabbnak tartják, mint a narirutinét [27], de egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a hesperidin kissé magasabb oldékonyságú metanolban és vízben, mint a narirutinban [28]. Figyelembe véve, hogy a C. unshiu héjból történő extrakciót 70% -os etanolban hajtották végre, a narirutin-tartalom várhatóan magasabb volt, mint a hesperidin.

Ismert, hogy összefüggés van a lipoprotein-koleszterin-változások és az elhízás között. Elhízási esetekben gyakran csökken a HDL-c szint, és az elhízás elleni kezelés egyik célpontja a HDL-c szintjének emelkedése [33]. Ezenkívül a HDL részt vesz egy olyan specifikus jelátviteli útvonal aktiválásában, amely lefelé szabályozza a gyulladásos citokinek, például a TNF-α expresszióját [34] [35]. Eredményeink azt mutatják, hogy a CP kezelés jelentősen növeli a HDL-c szintet, és ennek megfelelően jelentősen csökkenti az LDL-c szintet. Az eredmények azt is mutatják, hogy a CP hatékonyabb, mint az orlisztát a HDL-c emelkedésében.

A legtöbb esetben a HF csoporttal való összehasonlítás azt mutatja, hogy a CP csoport enyhítette a magas zsírtartalmú étrend hatásait; az O csoport azonban erősen szabályozta a zsírszövet változását, vagy olyan változásokat okozva, amelyek nagyobbak vagy alacsonyabbak voltak, mint a C csoport szintje, míg a CP csoport általi szabályozás csak olyan változásokat okozott, amelyek hasonló szinteket produkáltak, mint a C csoportban. Ezt a különbséget az epididymális, a mesenterialis és a szubkután zsírtömeg mérésekor is megfigyelték. Ezenkívül a zsírszövet H&E festése a zsírszövetben a lipid felhalmozódásának ugyanazokat a hatékony változásait tárta fel. Ezeket az eredményeket figyelembe véve azt javasoljuk, hogy a citrusfélék héjának kezelése az orlistat kezelésétől eltérő módon hatékony legyen.

A CP hatásmechanizmusának megalapozása és betekintés céljából Western-blot- és RT-PCR-kísérleteket végeztünk. A magas zsírtartalmú étrend csökkentette a p-AMPK/AMPK arányt a normál étrendhez képest, míg a CP-kivonattal és az orlisztáttal végzett kezelés a p-AMPK/AMPK arány jelentős növekedését eredményezte a C-csoporthoz képest. A TG- és TC-tartalom csökkenése, valamint a megemelkedett p-AMPK szint azt jelzi, hogy mind a CP, mind az O csoportok emelkedett sejtenergia-anyagcserére irányultak, ami elhízás elleni hatást okozhat, és enyhítheti a magas zsír okozta májstresszt is.

Ezt a munkát a Mezőgazdasági Tudományos és Technológiai Fejlesztési Együttműködési Kutatási Program (PJ907089) és az Élelmezési, Mezőgazdasági, Erdészeti és Halászati Minisztérium (811003031SU000), Koreai Köztársaság, Technológiai Kereskedelmi Támogatási Program támogatja.

・ A Citrus unshiu peel etanol kivonat blokkolja a lipid felhalmozódását.

・ A citrus héj etanol kivonata csökkenti a TNF-α expressziót az elhízás okozta egerekben.

・ A citrus héja ígéretes jelölt a természetes elhízás elleni gyógyszer kifejlesztésében.

Ezt a munkát a Mezőgazdasági Tudományos és Technológiai Fejlesztési Együttműködési Kutatási Program (PJ907089) és az Élelmezési, Mezőgazdasági, Erdészeti és Halászati Minisztérium (811003031SU000) Technológiai Kereskedelmi Támogatási Program támogatja.