A dextrán-nátrium-szulfát által kiváltott kolitikus egerek integrált omikai profilozása Wolfberry-vel kiegészítve (Lycium barbarum)

Tárgyak

Absztrakt

Több-omikusi profilalkotási módszert alkalmaztunk a 2% -os Wolfberry (WOL) dúsított étrendek dextrán-nátrium-szulfát (DSS) által kiváltott vastagbélgyulladásra gyakorolt szuppresszív hatásainak vizsgálatára egerekben. Megfigyelték, hogy a WOL-étrendet tápláló egereknél a betegség aktivitási indexe, a vastagbél megrövidülése, a mátrix metalloproteinase-3 plazmakoncentrációja és a relatív mesenterialis zsírtömeg szignifikánsan javult a DSS csoporthoz képest. A vastagbél transzkriptóm és proteom profilok eredményei azt mutatták, hogy a WOL-kiegészítés jelentősen javította a vastagbél nyálkahártya falának integritásával és a vastagbél gyulladásával összefüggő gének és fehérjék expresszióját. A májtranszkriptóma, proteom és metabolom adatok alapján a zsírsav-anyagcserében részt vevő géneket, a gyulladásban szerepet játszó fehérjéket és a glikolízissel kapcsolatos metabolitokat a WOL-egerekben szabályozták, ami gyulladáscsökkenéshez vezetett, és ezekben a molekulákban bekövetkezett változások a testtömeg javulásához vezethettek. veszteség. Az integrált táplálkozási megközelítés tehát feltárta azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek a teljes WOL gyümölcsfogyasztás gyulladásos bélbetegségre gyakorolt enyhítő hatásán alapulnak.

Bevezetés

A gyulladásos bélbetegség (IBD) a gyengítő gyulladásos rendellenességek csoportja, amelyek befolyásolják a gyomor-bél traktust. Az IBD magában foglalja a Crohn-kórt (CD) és a fekélyes vastagbélgyulladást (UC). Az érintett betegek a bélgyulladással járó különböző tüneteket tapasztalják, kezdve a hasi fájdalomtól és hasmenéstől a végbél vérzéséig és a fogyásig. Az orvosok általában gyulladáscsökkentő szteroidok vagy immunszuppresszánsok alkalmazását javasolják a gyulladás csökkentésére 1. Étrendi beavatkozások 2 táplálékanyagok 3, probiotikumok, prebiotikumok 2 felhasználásával; életmódbeli beavatkozások és a közelmúltban a fekális mikrobiota transzplantáció 4 általában az IBD kezelésében alkalmazott orvosi terápia alternatívájaként 5,6,7 .

Noha sok jelentés található a WOL alkotórészeiről, valójában nagyon kevés olyan tanulmány készült, amely egész WOL-t használt, annak ellenére, hogy gyakran egészben, konyhában, desszertben fogyasztják vagy forró vízben fogyasztják. Ebben a tanulmányban egy nutrigenomikai alapú többdimenziós megközelítést alkalmaztunk annak meghatározására, hogy a teljes WOL táplálkozási-beavatkozási étrendi jelek milyen hatással vannak a gének, fehérjék és metabolitok állapotára. Arra törekedtünk, hogy azonosítsuk a WOL interakciók étrendi aláírását rágcsáló gazdanövényekben, és felderítsük a potenciális molekuláris mechanizmusokat egy DSS által kiváltott vastagbélgyulladásos egér modellben átfogó transzkripta-, proteom- és metabolom-értékeléseken keresztül, nemcsak vastagbél- és májszövetek felhasználásával, ami fontos metabolikus erőmű a gazdában.

Eredmények

Általános tulajdonságok

Nem figyeltünk meg szignifikáns különbségeket az étkezés során a DSS előtt (CON: 27,0 ± 2,3; DSS: 27,7 ± 4,7; DSSWOL: 24,8 ± 2,3 g) vagy DSS beadása után (CON: 40,6 ± 9,9; DSS: 37,1 ± 7,9; DSSWOL: 32,3) ± 2,3 g). A vízbevitel a DSS beadási periódus alatt a következő: CON: 26,5 ± 0,6; DSS: 24,2 ± 1,5; DSSWOL: 24,8 ± 1,2 ml. A DSS és a DSSWOL egerek DSS bevitele tehát nem különbözött szignifikánsan. A DSS-fertőzött egerek jelentős kóros elváltozásokat mutattak be, beleértve a súlyos testsúlycsökkenést, a székletben rejlő okkult vér jelenlétét és a hasmenést, ami a DAI jelentős növekedését eredményezte a CON csoporthoz képest (1a. Ábra).

A WOL-kiegészítés elnyomta ezeket az IBD kóros állapotokat, ami a DAI-értékek csökkenését eredményezte a 7. naptól a 9. napig (1a. Ábra). A DSS csoportba tartozó egerek szignifikánsan rövidebb vastagbélhosszúsággal (1b. Ábra) és alacsonyabb mesenterialis zsírtömeggel (1c. Ábra) hasonlítottak össze a kontroll csoporthoz képest, és a WOL szignifikánsan enyhítette ezeket a csökkenéseket. A plazma Mmp3 (1d. Ábra) szintje szignifikánsan megnőtt a DSS alkalmazásával, és a WOL beavatkozás jelentősen enyhítette ezeket a növekedéseket. Az Il6 koncentrációja a plazmában (1e. Ábra) általában javult a WOL-kiegészítéssel.

Vastagbél mikroarray elemzése

A 2189 gén Messenger RNS-ét a DSS egerekben differenciáltan expresszálták a kontrollokkal összehasonlítva. Ezen gének közül 271 gént szabályoztak felül a DSSWOL-ban, és 207 gént szabályoztak alacsonyabban a DSS-hez képest (1. kiegészítő táblázat). A WOL csökkentette a metalloproteinase 1 szöveti inhibitor génexpressziós szintjét (Timp1) és a kemokin (C – C motívum) ligandumhoz (Ccl) tartozó kemokinek: Ccl1 és Ccl5. Ezenkívül az 1. típusú interleukin 1 receptor proinflammatorikus citokinjének alacsonyabb expressziós szintje (Il1r1) megfigyelték. Egyéb, nem szabályozott gének között volt a szekretált foszfoprotein 1 (Spp1), haptoglobin (Hp) és a prosztaglandin-endoperoxid-szintáz 2 (Ptgs2). A leszabályozott gének egy része az extracelluláris mátrix és az átalakító mátrix metalloproteináz (MMP) lebomlásához kapcsolódott, azaz., Mmp3, Mmp13 és Mmp10; a differenciálási klaszter (Cd163) és Il6, valós idejű RT-PCR-rel validáltuk. A DSS jelentősen szabályozta a Mmp10, Hp, Il6, Mmp3, és Timp1. A WOL-kiegészítés jelentősen csillapította ezeket a növekedéseket Hp, Timp1, és Mmp10 és hajlamos volt javítani ezeket a szabályozásokat Il6, Cd163, és Mmp3 (2. ábra).

Máj mikroarray elemzés

A májban 12 838 gént különböztek meg DSS-ben a kontrollokhoz képest. A DSSWOL csoportban 1630 gént szabályoztak felül, és 1793 gént szabályoztak alacsonyabban a DSS egerekhez képest (2. kiegészítő táblázat). A WOL-kiegészítés csökkentette a gének expresszióját a rákos markerek, például a szérum amiloid A1 (Saa1), c-jún (Június) és az S100 kalcium-kötő fehérje A8 (S100a8). Ezenkívül a zsírsavszintézisben részt vevő gének, azaz a sztearoil-CoA-deszaturáz-1 (Scd1), Az ELOVL család 6. tagja, a hosszú láncú zsírsavak megnyúlása (Elovl6), zsírsav-szintáz (Fas), valamint a NADP-függő almaenzim (Me1) felemelkedtek. A metionin-adenozil-transzferáz II, alfa (Mat2a), amely részt vesz a metionin-újrafeldolgozási folyamatban, csökkent. A génexpresszió valós idejű RT-PCR-rel történő validálásának eredményei alapján (3. ábra) a DSS szignifikánsan szabályozta a Elovl6, Fas, Június, Mat2, Me1, Saa1, Scd1, és S100A8, és a WOL-kiegészítés jelentősen befolyásolta ezen gének expresszióját - kivéve Június és a Saa1, amelyre a WOL általában elnyomó hatást fejt ki.

A máj és a vastagbél proteomikai összehasonlító elemzése az iTRAQ segítségével

Meghatároztuk a globális fehérje expressziót a három csoportban iTRAQ címkézés kvantitatív proteomikai technológiával. A fehérjék erősen felfelé vagy lefelé szabályozottként történő besorolásakor 1,2 vagy 0,8-szoros elválasztást alkalmaztunk az egyedi fehérjékből, amelyeket> 95% konfidenciaszint mellett számszerűsítettünk.

A májban 222 fehérjét azonosítottunk, amelyek közül 58 fehérjét szabályoztak alul, és 75 fehérjét szabályoztak felül a DSSWOL-ban a DSS csoporthoz képest (3. kiegészítő táblázat). A WOL-kiegészítés csökkentette azoknak a fehérjéknek a szintjét, amelyekről ismert, hogy az IBD-s betegeknél általában szabályozva vannak: kalretikulin (Calr) 33, szerotranszferrin (Trfe) 34, annekdin A5 (Anxa5) 35, béta-enoláz (Enob) 36, transztiretin (Tthy) 37, szelénkötő fehérje 1 (Sbp1) 38 és fehérje-glutamin gamma-glutamiltranszferáz 2 (Tgm2) 39; a fibrózisban szerepet játszó fehérjék: fibrinogén béta lánc (Fibb) és fibrinogén gamma lánc (Fibg) 40; és gyulladással kapcsolatos fehérjék: hiszton H4 (H4), szuperoxid-diszmutáz [Cu-Zn] (Sodc) 41, cystatin-B (Cytb) 42, 10-kDa hősokk-fehérje, mitokondriális (Ch10) 43, tioredoxin (Thio) 44 és alfa-enoláz (Enoa) 45 .

A vastagbélben összesen 2111 fehérjét detektáltunk, amelyek közül 271-et utólag szabályoztak, 217-et pedig a DSSWOL csoportban alacsonyabban szabályoztak a DSS-csoporthoz képest (4. kiegészítő táblázat). A WOL-kiegészítés számos fehérje szintjét növelte, beleértve a trefoil 3-as faktort (Tff3), amely egy olyan fehérje, amely részt vesz a bél szűk kereszteződésének integritásában és a nyákvédelemben 46; elülső gradiens protein 2 homológ (Agr2) 47; a gyulladásgátlóval összefüggő fehérje karboxipeptidáz E (Cbpe) 48; és a DNS-javítással kapcsolatos fehérje, 40S riboszomális fehérje S3 (Rs3) 49,50 .

A DSS-csoporthoz képest a DSSWOL-csoportban a szabályozatlan fehérjék a következők voltak: a leukocita gyulladásos válaszok negatív modulátora, tirozin-fehérje-foszfatáz nem-receptor típusú 1-es szubsztrát (Shps1) 51; marker fehérje IBD-ben szenvedő betegeknél, a sejtfelszíni glikoprotein MUC18 (Muc18) 52 izoform S-gicerin 52; egy IBD kockázati faktor fehérje, az apolipoprotein E (Apoe) 53; idegi sejtadhéziós molekula L1 (L1cam) 54; gyulladással és szöveti sérülési rezisztenciával kapcsolatos fehérje, ceruloplazmin (Ceru) 55; két, a tumor progressziójában szerepet játszó fehérje, az aneksin a3 (Anxa3) 56,57 és a C3 (Co3) 58 komplement; és a neutrofil zselatinázzal társított lipokalin (Ngal) 59 .

A plazma és a máj metaboloma értékelése

Az anyagcsere-változás WOL-fogyasztás általi értékeléséhez a CON, DSS és DSSWOL csoportok máj- és plazma-metabolomanalízisét végeztük azok alapján. m/z értékek és migrációs idők. A májszövetben és a plazmában kimutatott metabolitok száma 131, illetve 117 volt. A normalizált metabolomikai adatokat hierarchikus klaszterezéshez használtuk a hőtérkép ábrázolásához, majd tovább elemeztük egy főkomponens-elemzéssel (PCA) MeV szoftver segítségével.

Bár a hőtérképen nem figyeltek meg nyilvánvaló eltéréseket a csoportok között (4a. Ábra, b), a CON, DSS és DSSWOL csoportok között különálló klaszterek alakultak ki (4c. Ábra, d). Tíz metabolitot a májban (kiegészítő 5a. Táblázat) és négy metabolitot (5b. Kiegészítő táblázat) a plazmában szignifikánsan szabályozott a DSS beadása, majd a WOL-kiegészítés javította őket. Ezek a metabolitok magukban foglalják a máj metabolitjait, amelyek részt vesznek a pentóz-foszfát útvonalában, azaz a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (G6P) és a fruktóz-6-foszfát (F6P); és a purin metabolizmusában, azaz az adenozin-monofoszfát (AMP), az inozin-monofoszfát (IMP) és a guanozin-monofoszfát (GMP). A többi metabolit a metionin-újrafeldolgozási útvonalhoz kapcsolódó két molekula, a glutation és az S-laktoil-glutation, valamint a kollagén lebomlásának terméke, azaz a hidroxiprolin. A 2-hidroxi-izobutirát, dodekanoát és arginin szabályozását figyelték meg a plazma metabolomprofilokban.

A hőtérképen nem figyeltek meg egyértelmű különbséget a három csoport között (a, b), de a PCA adatelemzésében külön klaszterek alakultak ki a CON, a DSS és a DSSWOL között (c, d) mind a plazma, mind a máj metabolitjai.

Vita

Átfogóan megvizsgáltuk a WOL-kiegészítés hatását a gyulladt vastagbél- és májtranszkriptómra és proteomra, valamint a plazma és a máj metabolomprofiljaira. Eredményeinkből kiderült, hogy a WOL étrend-kiegészítő enyhítheti a DSS által kiváltott vastagbél sérülést és gyulladást, és fokozhatja a bélgát védekezését a nyálkahártya integritásának fenntartásával, az alábbiakban leírtak szerint. Eredményeink modulált metabolikus utakat és potenciális kulcs gén/fehérje szabályozó központokat is feltártak, amelyek szabályozhatják ezeket a folyamatokat. A DSS-fertőzés előtti WOL-etetés kísérleti megközelítése hasonlónak tekinthető az IBD-betegek különböző élelmiszer-ipari termékek fogyasztásának szokásaihoz a fluktuáló betegségaktivitás 60 alatt. Tudomásunk szerint ez egy példátlan jelentés a tiszta teljes WOL IBD-ben történő alkalmazásáról, átfogó nutrigenomikai megközelítést alkalmazva, különösen az UC-ben.

A vastagbél génexpressziós adatai azt mutatták, hogy a WOL beavatkozás elnyomja a vastagbél gyulladását. Az IBD gyulladásos válaszai általában a neutrofilek és a makrofágok 61 beszivárgásával kezdődnek, majd gyulladásos citokinek keverékével, beleértve IL6, IL1 és TNF 62, titkos. Ennek eredményeként proteázok, szabad gyökök és metalloproteinázok képződnek, amelyek felelősek a vastagbél megrövidüléséért, a szövetek lebomlásáért és az elváltozások kialakulásáért 63. Ebben a tanulmányban a vastagbél gén globális expressziója és az RT-PCR validáció feltárta a Il6, és annak downstream tényezői, Mmp10 és Hp, a WOL beavatkozása jelentősen csökkent. A kifejezés Hp gyulladással társult, gyulladásos állapotokban is jelentősen csökken 64. A gyulladással és szöveti sérülésekkel kapcsolatos fehérjék (Ceru és Shps1) és a gének csökkentése Hp, Mmp10, Timp1 DSS csoportunkbanWOL azt sugallja, hogy a WOL beavatkozás csökkentette a DSS által kiváltott vastagbél gyulladásának mértékét.

A WOL-bevitel megőrizte a nyálkahártya-gát integritását, amely az egészséges bél fontos alkotóeleme, mivel ez képviseli az első védelmi vonalat a luminális tartalom és a gazdaszövetek között. A sérült nyálkahártya-gát lehetővé teszi a mikrobiális kölcsönhatásokat a vastagbél nyálkahártyájával, amely stimulálhatja a gazdaszervezet veleszületett és gyulladásos immunreakcióit. A fibrózissal összefüggő fehérjék, azaz a Fibb és a Fibg 65, valamint a metalloproteinázok génjeinek szabályozását figyelték meg DSSWOL egerekben a DSS-hez képest. A szignifikánsan alulszabályozott expressziós szint Mmp10 és a plazma Mmp3 WOL-beavatkozással segíthet megakadályozni az extracelluláris komponensek széles skálájának lebomlását, beleértve a proteoglikánokat, a II-es típusú, a IV-es, a IX-es és a XI-es típusú kollagéneket, a laminint és a fibronektint 63, ezáltal gátolva a nyálkahártya falának lebomlását. IBD-s betegeknél nyilvánul meg 66 .

A viszonylag rövid DSS beadási időszak ellenére a WOL beavatkozás javította a vastagbélben a rákkal kapcsolatos fehérjék (Anxa3 és Co3), valamint az onkogén májgének (Saa1, Június és S100a8), amint azt a DSSWOL egereknél megfigyeltük, összehasonlítva a DSS csoporthoz. Beszámoltak arról, hogy az IBD esetek 2% -a kolorektális rákká (CRC) fejlődik, és a CRC-vel összefüggő halálozások 15% -át teszi ki. Axelrad és mtsai. és Pedersen és mtsai. beszámolt arról is, hogy IBD-s betegeknél a krónikus gyulladás hosszú távú kitettsége az elsődleges kockázati tényező a CRC kialakulásában, valamint más típusú rákos megbetegedésekben 72,73. Az IBD-ben szenvedő betegeknél (Muc18, Apoe, L1cam) a rákkal kapcsolatos markerek és fehérjék expressziójának csökkentésével a WOL-beavatkozás késleltetheti az IBD-vel kapcsolatos CRC megjelenését.

A WOL bevitele javította a glikolízisben szerepet játszó anyagcsere útvonalakat is. A gyulladás során számos immunsejt aktiválódik és vándorol gyulladásos elváltozásokba. A fagocitózis, a baktériumok elpusztítása és a stimulált sejtproliferáció magas energiaigényű 74. A neutrofilek, a makrofágok és a dendritikus sejtek elsősorban glikolitikus útvonalakat használnak az energia megszerzéséhez, míg a B és T sejtek főleg aminosavakat, glükózt és lipideket használnak az energia előállításához az oxidatív foszforiláció során. A magas gyulladásos elváltozású és kiváltott immunaktivitású szövetekben a táplálkozás és az oxigén gyorsan korlátozódik vagy kimerül 75. A glikolízisben részt vevő májmetabolitokat, azaz a G6P-t és az F6P-t a WOL-kiegészítés jelentősen felülszabályozta, jelezve, hogy a WOL aktív szerepet játszik a glikolitikus helyreállításban. A zsírsav-anyagcserében részt vevő gének jelentős mértékű szabályozása (Fas, Me1, Scd1, és Elovl6) a WOL-kiegészítéssel, valamint a glikolízis metabolikus eltolódásai hozzájárulhattak a DSS-kezeléssel előidézett jobb testsúlycsökkenéshez a DSSWOL-egerekben. Ez a megfigyelés összhangban volt a májban a gyulladásos fehérjék, például a H4, a Sodc és a Cytb alacsonyabb expressziójával.

Amint azt a fentiekben bemutattuk, táplálkozási megközelítést alkalmaztunk, hogy bizonyítékokon alapuló betekintést nyerjünk a teljes WOL-kiegészítés IBD-re gyakorolt hatásáról (5. ábra). Az integrált vastagbél transzkriptóm- és proteomprofilok azt is jelezték, hogy a DSS-szel fertőzött egerek 2% -os WOL-kiegészítése jelentősen enyhítette a vastagbél gyulladását, ami fenntartotta a vastagbél nyálkahártyájának falának integritását, és megakadályozhatta a CRC kialakulásához vezető rizikófaktorokat. A máj transzkriptóm, proteom és metabolom adatok azt mutatták, hogy a WOL táplált egerekben a zsírsav anyagcserében részt vevő gének, a gyulladásban szerepet játszó fehérjék és a glikolízissel kapcsolatos metabolitok enyhültek, ami gyulladáscsökkenéshez vezetett, és hozzájárulhatott a test fejlődéséhez súly. Összegezve, eredményeink integrált táplálkozási információkat nyújtanak a WOL, a hagyományos kínai gyümölcs kolitikus modellre gyakorolt hatásáról. Eredményeink várhatóan hatásosak lesznek, mivel a WOL napi étrendbe történő felvétele diétás stratégia lehet a bél egészségének megőrzésére és a betegség súlyosságának csökkentésére a nyálkahártya károsodásával összefüggő patológiákban.

A WOL-beavatkozás integrált omikai profiljának vázlatos összefoglalása a DSS-colitic egér modellben.