A Diane-35 és a metformin együttes alkalmazása javítja az ovulációt a PCOS patkány modellben, valószínűleg a glikolízis útjának szabályozásán keresztül

Absztrakt

Háttér

A policisztás petefészek szindróma (PCOS) egy komplex endokrin és metabolikus betegség, amelynek patogenezise ismeretlen. A Diane-35 metforminnal kombinált kezelése azonban javíthatja a PCOS endokrin és ovulációját. Ebben a tanulmányban a Diane-35 és a metformin (DM) kezelés kombinációját vizsgáltuk az ovulációra és a glükóz metabolizmusra PCOS patkány modellben.

Mód

A Sprague Dawley patkányokat 3 csoportra osztottuk, kontrollcsoportra, modellcsoportra (PCOS csoport) és Diane-35-öt metforminnal kombinálva (PCOS + DM csoport). Az mRNS expressziós szintjét qRT-PCR-rel határoztuk meg. A hormonszinteket enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal határoztuk meg. Az immunfestés kimutatta a petefészek szövetekben a laktát-dehidrogenáz A (LDH-A), a piruvát kináz M2 izozim (PKM2) és a sirtuin 1 (SIRT1) fehérje szintjét. TNUEL vizsgálatot végeztünk a sejt apoptózis meghatározására a PCOS patkányokban. A petefészek szövetekben található metabolitokat folyadékkromatográfiával és tandem tömegspektrometriával elemeztük.

Eredmények

A PCOS patkányok testtömegének növekedése, a luteinizáló hormon és a tesztoszteron szintje, valamint az inzulinrezisztencia növekedését mutatta, amit a DM kezelés jelentősen gyengített. A DM kezelés javította az ösztrikus ciklust és megnövelte a petefészek granulosa sejtjeit a PCOS patkányokban. A PCOS patkányok petefészekszöveteiben a granulosa sejtek csökkent proliferációját és fokozott sejt apoptózisát a DM kezelés szignifikánsan megfordította. Az anyagcsere elemzése feltárta, hogy az ATP és a laktát szintje szignifikánsan csökkent a PCOS patkányokban, amelyeket DM kezeléssel nyertek meg. Továbbá az LDH-A, a PKM2 és a SIRT1 expressziója szignifikánsan csökkent volt a PCOS patkányok petefészke szöveteiben; míg a DM kezelés szignifikánsan növelte az LDH-A, PKM2 és SIRT1 expresszióját a PCOS patkányok petefészke szöveteiben.

Következtetés

Összefoglalva, tanulmányunk kimutatta, hogy a Diane-35 és metformin kezelés javította a PCOS patkányok kóros elváltozásait. További vizsgálatok arra utalnak, hogy a Diane-35 és a metformin a glikolízis útjának szabályozásával javíthatja a petefészek energia-anyagcseréjét. A mechanisztikus vizsgálatok azt mutatták, hogy a Diane-35 plusz metformin terápiás hatásai a PCOS patkányokban összefüggésbe hozhatók a glikolízissel kapcsolatos mediátorok, köztük a PKM2, az LDH-A és a SIRT1 szabályozásával.

Bevezetés

Egyre több bizonyíték bizonyítja, hogy a granulosa sejtek energiacseréjének rendellenessége a kóros tüszők és a termékenység csökkenésének fontos oka. A normális folliculogenezis fő energia-anyagcseréje az, hogy a granulosa sejtek a sejtmembránjukon lévő glükóztranszporter (GLUT) révén felveszik a glükózt a környező szövetekből, majd a glikolízis útján glükózt termelő piroszavat és tejsavat [6, 7]. Számos tanulmány kimutatta, hogy a pirovinsav és a tejsav fontos tényező a follikuláris növekedés és fejlődés fenntartásában [8]. Harris és mtsai. megállapította, hogy a PCOS-ban szenvedő betegek tüszőinek több piruvátra van szükségük a tüsző növekedésének fenntartásához, mint a normális nőnél [9]. Az in vitro eredmények azt mutatják, hogy a tesztoszteron és az inzulin stimuláció csökkentheti a tejsavtartalmat a granulosa sejtekben [10]. A fenti vizsgálatok azt mutatják, hogy a PCOS-ban szenvedő betegek tüszőinek több piruvátra és tejsavra van szükségük, hogy egyrészt ösztönözzék a tüsző normális fejlődését, másrészt a magas androgén és inzulin csökkenti a tejsav tartalmát. Azonban továbbra is megfoghatatlan, hogy a Diane-35 plusz metformin kezelés képes-e helyreállítani a granulosa sejtek energia-anyagcseréjének diszfunkcióját a PCOS-fejlesztés során.

Ebben a tanulmányban a Diane-35 és a metformin kezelés kombinációját vizsgáltuk az ovulációra PCOS patkány modellben. További vizsgálatokat végeztek a kombinált kezelések hatásainak meghatározására a petefészek energia-anyagcseréjére. Ezenkívül meghatároztuk a petefészek glikolízissel kapcsolatos sebességkorlátozó enzimeket és a sirtuin 1 (SIRT1) expresszióját, hogy tisztázzuk a kombinált kezelés mechanisztikus hatásait az energiacsere diszfunkciójának helyreállításában a PCOS petefészekben. Ez a tanulmány új betekintést nyújthat a Diane-35 terápiás hatásainak mechanisztikus hatásainak megértésébe kombinálva a PCOS metformin kezelésével.

Anyagok és metódusok

Állatok és kezelések

Összesen 40 nőstény Sprague Dawley (SD) patkányt (5 hetes és 130–140 g) vásároltunk a Harmadik Katonai Orvostudományi Egyetem (Chongqing, Kína) Laboratóriumi Állatközpontjában. Az állatokat véletlenszerűen felosztottuk egy kontroll csoportba (10 állat) és egy PCOS csoportba (30 állat). A PCOS csoportot intragasztrikusan adagolták letrozollal [11] (Heng Rui Gyógyszergyár, Lianyungang, Jiangsu, Kína) 1% (w/w) CMC-ben oldva, és magas zsírtartalmú étrendben táplálták. Az SD patkányok hüvelyi kenetét 1 hét modellezés után ellenőriztük, és a modell felállítását előzetesen sikeresnek ítéltük, vagy sem az ösztrikus ciklus szerint. Két sikeres kezdeti modellt tartalmazó patkányt véletlenszerűen kiválasztottak a petefészek morfológiájához és a szérum reproduktív hormon elemzéséhez az ellenőrzés céljából. A sikeresen modellezett SD patkányokat felosztottuk PCOS csoportba (10 állat) és PCOS + Diane-35 plusz metformin (DM) csoportba (10 állat). A PCOS + DM csoportot a következőképpen kezeltük: A Diane-35-et és a metformint intragasztrikusan adtuk SD patkányoknak 21 napig. A PCOS-csoportot 1% CMC-vel öntöttük 21 napig. Az összes állatkísérletet a Guilini Orvostudományi Egyetem Első Kapcsolódó Kórházának Állatetikai Bizottsága hagyta jóvá (GLMC202003153).

Hüvelyi citológia

A hüvelykeneteket 14 napig végeztük a modellezés és a kezelés vége előtt. Röviden: a hüvelyt 2-3 alkalommal 35 μL normál sóoldattal (0,9% NaCl) öblítettük. A hüvelyi folyadékot (10–20 μL) összegyűjtöttük az üveglemezre. Miután szobahőmérsékleten levegőn szárítottuk, a tárgylemezeket metanollal rögzítettük, majd a gyártó protokollja szerint festettük a Wright’s – Gimsa-val (Solarbio, Peking, Kína). A hüvelyi hámsejtek változását fénymikroszkóppal értékeltük az ösztrikus ciklus meghatározása céljából.

Szérumgyűjtés és a hormonszint mérése

A kísérlet végén a patkányokat 10% klór-hidrát (0,2 ml/100 g) intraperitoneális injekciójával altattuk. A vért szívpunkcióval vettük össze, és a szérumot 2500 fordulat/perc sebességgel 20 percig végzett centrifugálással izoláltuk. A tesztoszteron és az LH szérumszintjét megfelelő kereskedelmi enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálati készletekkel határoztuk meg (Abcam, Cambridge, USA).

A petefészek morfológiai elemzése

A petefészek szöveteket 4% paraformaldehidben egy éjszakán át 4 ° C-on feloldottuk, paraffinba ágyazottuk, 5 μm vastag szeletekre osztottuk, deparaffinizáltuk és hematoxilinnel és eozinnal festettük. A petefészek szöveteinek morfológiáját fénymikroszkóppal értékeltük.

A szaporodó sejtmag antigénje (PCNA), a laktát-dehidrogenáz a (LDH-A), a piruvát-kináz M2 izozim (PKM2) és a SIRT1 immunhisztokémiai elemzése

A petefészkeket 4% formaldehidben rögzítettük és paraffinba ágyazottuk; 5 μm vastag szeleteket metszünk. A metszeteket 1% Triton X-100 foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) 30 percig szobahőmérsékleten permeabilizáltuk, 100 mM nátrium-citrátban (pH 6,0) háromszor 6 percig forralva, mindegyik 5 percenként, az antigén visszakereséséhez majd inkubáljuk 3% hidrogén-peroxiddal 30 percig az endogén peroxidáz eltávolítása érdekében, majd 5% szarvasmarha-szérum albuminban blokkoljuk szobahőmérsékleten 1 órán át. Ezután a metszeteket egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk a blokkoló oldat primer kecske poliklonális PCNA, LDH-A, PKM2 és SIRT1 antitestjeivel. Három 0,1% Tween-20 PBS-ben végzett mosás után a mintákat nyúl anti-kecske biotin-SP-konjugált antitesttel (1: 100; SA00004–4, Protein Tech Group Inc.) inkubáltuk blokkoló oldatban szobahőmérsékleten. 45 perc A festett PCNA, LDH-A, PKM2 és SIRT1 fehérjéket a 3,3-diaminobenzidin kromogén alkalmazásával tettük láthatóvá. A normál kecske IgG-vel helyettesített primer antitestet negatív kontrollként szolgáltuk. A festett szakaszokat fénymikroszkóppal értékeltük.

A terminális dezoxinukleotidil-transzferáz által közvetített dUTP Nick end-labeling (TUNEL) elemzés

Az apoptotikus sejtek detektálását a petefészek szemcsés sejtjeiben TUNEL assay-vel (Roche Diagnostic Systems, Branchburg, USA) határoztuk meg, a gyártó módosított módosításokkal követve [12]. Röviden, a metszeteket viaszmentesítettük és vízben rehidratáltuk, majd proteináz K-val és 3% -os hidrogén-peroxiddal kezeltük, majd inkubáltuk a TUNEL reakcióeleggyel párásított kamrában 37 ° C-on. Ezt követően a metszeteket peroxidázzal konjugált anti-biotin antitesttel inkubáltuk. Az apoptotikus sejteket a 3,3-diaminobenzidin kromogén alkalmazásával tettük láthatóvá. Haematoxylint használtunk ellenfestésként.

Kvantitatív valós idejű PCR (qPCR)

Az RNS extrakciót a szövetekből TRIzol reagenssel (Takara, Dalian, Kína) végeztük. A cDNS szintézisét a TransScript II egylépéses gDNS eltávolítás és a cDNS Synthesis SuperMix kit (Transgen Biotech, Peking, Kína) felhasználásával végeztük a gyártó protokollja szerint. A génexpressziós szint valós idejű PCR elemzése az Applied Biosystems 7500 valós idejű PCR rendszeren (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) történt. GAPDH-t alkalmaztunk referencia kontrollként, és a génexpressziós szinteket összehasonlító Ct módszerrel számoltuk. A primer szekvenciákat az 1. táblázatban mutatjuk be.

Folyadékkromatográfia petefészek metabolitok tandem tömegspektrometriás (LC-MS/MS) analízisével

Statisztikai analízis

Az adatokat SPSS 18.0 szoftver (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) segítségével elemeztük. A kísérleti adatokat átlag ± szórásként mutatjuk be. A párosítatlan Student t-tesztjét használták a két csoport összehasonlításának elemzésére. Az egyirányú ANOVA-t, majd Bonferroni többszörös összehasonlító tesztjét alkalmazták az összehasonlításhoz több csoport között. A P A 0,05 alatti értéket statisztikailag szignifikáns eredménynek tekintettük.

Eredmények

A DM kezelés hatása a testtömegre, a hormonszintre, az ösztrikus ciklusra és a petefészek morfológiájára PCOS patkányokban

A PCOS indukciója előtt nem volt szignifikáns különbség a testsúlyban (1a. Ábra). Patkányokban a PCOS indukciója után a testtömeg a PCOS csoportban figyelemre méltóan megnőtt (1b. Ábra). A DM kezelés szignifikánsan csökkentette a PCOS által kiváltott súlygyarapodást (1c. Ábra). Ezenkívül a luteinizáló hormon és a tesztoszteron, valamint a HOMA-IR szintje szignifikánsan megemelkedett a PCOS patkányokban, amit a DM-vel végzett kezelés jelentősen gyengített (1d-f. Ábra).

A DM-kezelés hatása a PCNA-expresszióra és az apoptózissal kapcsolatos mediátorok expressziójára a PCOS patkányok petefészkében

A DM hatása a petefészkek energia-anyagcseréjére

A petefészek energia-metabolitjait többválaszos monitorozással mértük. A laktát szintje, a purin metabolizmusának termelése és az oxidatív foszforiláció termelődése a PCOS + DM csoport petefészkében szignifikánsan nőtt a PCOS és a kontroll csoporthoz képest, amint azt a hőtérkép mutatja (3a. Ábra), ami arra utal, hogy a kombinált terápia javíthat follikuláris energiaellátás PCOS patkányokban. Az ATP szint a PCOS csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontroll és a PCOS + DM csoportban (3b. Ábra). Ezenkívül a DM kezelés jelentősen növelheti az ATP tartalmát a PCOS patkányok petefészkeiben (3b. Ábra). A laktát a PCOS csoportban magasabb volt, mint a kontroll csoportban, és a DM kezelés szignifikánsan csökkentette a laktát szintjét a PCOS patkányokban (3b. Ábra). Ami a NAD +/NADH változásait illeti, három csoport között nem volt szignifikáns különbség (3b. Ábra).

A DM kezelés hatása a PCOS patkányok petefészekszövetének metabolikus mediátoraira. a A DM kezelés hatása a PCOS patkányok petefészekszövetének metabolikus mediátoraira a célzott metabolomikai elemzés alkalmazásával. b A DM kezelés hatása az ATP, a laktát és a NAD +/NADH szintre a PCOS patkányok petefészke szöveteiben különböző kezelések után. N = 6

A DM-kezelés hatása a petefészek glikolízissel kapcsolatos sebességkorlátozó enzimekre és a SIRT1 expressziójára

Vita

A Diane-35 2 mg ciproteron-acetátból és 35 μg etinil-ösztradiolból áll, amelyeket széles körben alkalmaznak hiperandrogenizáló PCOS-betegek kezelésében [15]. Úgy működik, hogy blokkolja az androgének, például a tesztoszteron hatásait, és aktiválja a progeszteron receptorokat. A metformin funkcióját általában leírják az inzulinérzékenység és a glükóz-anyagcsere modulálására PCOS-nőknél [16]. A Diane-35 és a metformin kombinációja csökkentheti a BMI és LU szintet, javíthatja a hiperandrogenémia állapotát és az inzulinrezisztenciát a PCOS betegeknél [5]. A dihidrotesztoszteron által kiváltott PCOS patkányokban a Diane-35-ről kiderült, hogy hatékony a reproduktív funkciók helyreállításában [17]. Következetesen ebben a tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy a Diane-35 és a metformin kezelés kombinációja csökkentette a testtömeget, csökkentette a tesztoszteron és a luteinizáló hormon szintjét és az inzulinrezisztenciát, valamint helyreállította az ösztrikus ciklust és az ovulációt a PCOS patkányokban, jelezve, hogy a kombinált kezelés javította a PCOS szövődményeit.

Jelen tanulmány először mutatta be a Diane-35 plusz metformin kezelés jótékony hatásait PCOS patkányokban, és ami még fontosabb, a mechanisztikus vizsgálatok azt mutatták, hogy a Diane-35 plusz metformin számos kulcsfontosságú mediátort képes modulálni, amelyek a glikolízissel és az energia anyagcserével függenek össze. kezelés. A vizsgálat azonban még mindig az előzetes szakaszra korlátozódik, és a jövőbeni vizsgálatok során meg kell vizsgálni ezen mediátorok további funkcionális tanulmányait. Mivel Diane-35-et és metformint javasoltak a PCOS kezelésére, további klinikai vizsgálatokat lehet végezni ezen kulcsmediátorok expressziójának meghatározására a PCOS-betegeknél a kezelés után, és ezen mediátorok klinikai jelentőségének értékelésére.

Következtetések

Összefoglalva, tanulmányunk kimutatta, hogy a Diane-35 plusz metformin kezelés javította a PCOS patkányok kóros elváltozásait. További vizsgálatok arra utalnak, hogy a Diane-35 és a metformin a glikolízis útjának szabályozásával javíthatja a petefészek energia-anyagcseréjét. A mechanisztikus vizsgálatok azt mutatták, hogy a Diane-35 és a metformin kezelés terápiás hatása PCOS patkányokban összefüggésbe hozható a glikolízissel kapcsolatos mediátorok (PKM2 és LDH-A) és a SIRT1 szabályozásával. Jövőbeli vizsgálatokra volt szükség a glikolízissel kapcsolatos mediátorok biológiai funkciójának meghatározásához PCOS-betegeknél.