Az étrendi 2’-fukozillaktóz fokozza az operatív kondicionálást és a hosszú távú potencírozást a bél-agy kommunikáción keresztül a rágcsálók hüvelyidegén keresztül

Enrique Vazquez

1 Stratégiai K + F Osztály, Abbott Nutrition, Granada, 18004, Spanyolország

Alejandro Barranco

1 Stratégiai K + F Osztály, Abbott Nutrition, Granada, 18004, Spanyolország

Maria Ramirez

1 Stratégiai K + F Osztály, Abbott Nutrition, Granada, 18004, Spanyolország

Gruart Ágnes

3 Idegtudományi Osztály, Pablo de Olavide Egyetem, Sevilla, 41013, Spanyolország

Jose M. Delgado-Garcia

3 Idegtudományi Osztály, Pablo de Olavide Egyetem, Sevilla, 41013, Spanyolország

Maria L. Jimenez

1 Stratégiai K + F Osztály, Abbott Nutrition, Granada, 18004, Spanyolország

Rachael Buck

2 Stratégiai K + F Osztály, Abbott Nutrition, Columbus, OH, Amerikai Egyesült Államok

Ricardo Rueda

1 Stratégiai K + F Osztály, Abbott Nutrition, Granada, 18004, Spanyolország

Fogalomalkotás: EV AB MR RB RR.

Adatkezelés: JMD AG EV AB.

Hivatalos elemzés: EV AB MR AG JMD.

Finanszírozás megszerzése: EV MR RB RR.

Vizsgálat: EV AB MR MLJ JMD AG RB RR.

Módszertan: EV AB MLJ AG JMD.

Projekt adminisztráció: EV RB.

Erőforrások: EV AB MR MLJ JMD AG RB RR.

Felügyelet: EV RB MR RR.

Érvényesítés: EV MLJ JMD AG AB.

Megjelenítés: EV.

Írás - eredeti vázlat: EV AB MR MLJ JMD AG RB RR.

Írás - áttekintés és szerkesztés: EV MR JMD RB RR.

Társított adatok

Minden lényeges adat a cikkben található.

Absztrakt

A 2´-fukozillaktóz (2´-FL) az emberi tejben rengeteg biológiai hatású emberi tej oligoszacharid (HMO). Nemrégiben beszámoltunk arról, hogy a bevitt 2´-FL stimulálja a központi idegrendszer (CNS) működését, mint például a hippokampus hosszú távú potencírozása (LTP), valamint a tanulás és a memória patkányokban. Elképzelhető, hogy a 2´-FL hatása a központi idegrendszer működésére a bél-agy tengelyén (GBA) keresztül, nevezetesen a vagus idegen keresztül történhet, és szerepet játszhat az L-fukóz (Fuc). Ennek a tanulmánynak két célja volt: (1) meghatározni, hogy a bevitt 2´-FL hatása a központi idegrendszer működésének modulációjára függ-e a molekula integritásától; és (2) megerősíti, hogy orális 2´-FL módosított hippocampalis LTP és asszociatív tanulással kapcsolatos készségek patkányokon kétoldali subdiaphragmatikus vagotómiában szenvedtek-e. Az eredmények azt mutatták, hogy a 2´-FL, de nem a Fuc-fokozott LTP, és a vagotomia gátolta az orális 2´-FL hatását az LTP-re és az asszociatív tanulással kapcsolatos paradigmákra. Összességében az adatok azt mutatják, hogy az étrendi 2´-FL, de annak Fuc-része nem befolyásolja a kognitív doméneket, és javítja a patkányok tanulását és memóriáját. Ez a hatás a vagus ideg integritásától függ, ami arra utal, hogy a GBA szerepet játszik a 2´-FL által közvetített kognitív előnyökben.

Bevezetés

Az emberi tejben található HMO-k gazdagsága egyedülálló, nemcsak a teljes mennyiséget tekintve, hanem sokféleségüket és összetettségüket is figyelembe véve. A mai napig több mint 150 HMO-t azonosítottak [1, 2], amelyek a 2’-fukozillaktóz (2’-FL) a leggyakoribb HMO, legfeljebb 4,65 g/L [3]. Másrészt a szarvasmarha tejben, tehát az anyatej-helyettesítő tápszerben lévő oligoszacharidok sokkal kevésbé bőségesek és összetettek [4, 5]. A szoptatás különféle előnyöket kínál [6, 7]. Például a szoptatott gyermekeknek magasabb az intelligencia hányadosa, és jobb teljesítményük van az intelligencia tesztekben az élet későbbi szakaszaiban azokhoz képest, akiket tápszerrel tápláltak [6, 8].

Az étrendi 2´-FL agyműködésre gyakorolt hatásának mechanizmusairól azonban nem áll rendelkezésre információ. Egyre több bizonyíték rávilágít a bél-agy tengely relevanciájára számos központi idegrendszeri funkció megfelelő fejlesztése szempontjából [19–21], különös tekintettel a vagus idegre, mint a bél-agy áthallás kulcsfontosságú útjára. Ennek megfelelően bebizonyosodott, hogy a vagus idegi stimuláció szabadon mozgó patkányokban potencírozza a hippocampus LTP-t [22]. Sőt, Bienenstock et al. kimutatták, hogy a fukozilezett, de nem szialilezett HMO-k modulálják a vastagbél motoros összehúzódásait, valószínűleg enterális idegsejtek kiváltásával [23]. Úttörő tanulmányok kimutatták, hogy az intrakraniálisan beadott [3 H] Fuc gyorsan beépült a neuronális glikoproteinekbe és átkerül az idegvégződésekbe, ami a fukozil konjugátumok axonális transzportjának aktív folyamatára utal [24].

Ezt a bizonyítékot figyelembe véve feltételeztük, hogy az étrendi 2’-FL moduláló hatását a központi idegrendszerre fejti ki az enterális idegsejtek kiváltásával, és ezek az ingerek a vagus idegpályán keresztül juthatnak el a központi idegrendszerbe. Ebben a munkában in vivo hippocampal LTP-t mértünk 2´-FL-vel vagy fukózzal táplált patkányokon, valamint az étrendi 2´-FL hatását a kognitív képességekre és a hippocampal LTP-re kétoldali subdiaphragmaticus vagotomiában szenvedő patkányokban.

Anyag és módszerek

Kísérleti állatok

Sprague Dawley hím felnőtt patkányokat (2,5–4 hónaposak; 250–300 g) a Charles River Laboratories szállított. A patkányokat párban tartottuk és 12 órás világos/sötét ciklusban tartottuk, szabályozott környezeti hőmérséklet mellett 21,5 ± 1 ° C, illetve 55 ± 8% környezeti páratartalommal. Étel és víz ad libitum volt elérhető. A vagotomiának, valamint az LTP-vizsgálatoknak szentelt állatokat műtéti beavatkozások után egyedileg tartottuk. Az 1B. Ábrán bemutatott kísérletekhez az állatokat (n = 10 csoportonként) három csoportba osztottuk: Kontroll, Fucose és 2’-FL. Az 1C. Ábrán bemutatott kísérleteket (n = 10 csoportonként) négy csoportra osztottuk: Control-Sham, Control-Vagotomized, 2’-FL-Sham és 2’-FL-Vagotomized. Végül a 2. ábrán bemutatott kísérleteket további állatokkal (n = 10 csoportonként) hajtottuk végre, a fent említett négy csoportba osztva.

Elektrofiziológiai vizsgálatok

Az elektrofiziológiai vizsgálatokat a műtét után 1 héttel kezdték meg. Amint azt Gureviviene és munkatársai korábban leírták [28], az elektrofiziológiai felvételeket Grass P511 differenciálerősítőkkel végeztük, 0,1 Hz-10 kHz sávszélességgel (Grass-Telefactor, West Warwick, RI, USA). A CA1 területén lévő szinaptikus térpotenciálokat egyetlen 100 μs-os, négyzet alakú, kétfázisú (negatív-pozitív) impulzus váltotta ki, amelyet Schaffer-biztosítékokra alkalmaztunk. Az inger intenzitása 50 és 350 μA között változott. Minden állat esetében az ingerintenzitást jóval a populációs csúcs kiváltásának küszöbértéke alá állították, általában a maximális fEPSP-válasz kiváltásához szükséges intenzitás 30–40% -át [28]. Az ingerintenzitás kiválasztásának további kritériuma az volt, hogy a kondicionáló impulzus után 50 ms-mal megjelenő második inger nagyobb (> 20%) szinaptikus térpotenciált váltott ki [29].

Az LTP kiváltására nagyfrekvenciás (HFS) protokollt alkalmaztak: minden állatnak öt 200 Hz-es, 100 ms-os impulzussorozatot mutattunk be 1/s sebességgel. Ezeket a vonatokat összesen 6 alkalommal, 1 perces időközönként mutatták be. Az LTP kiváltására használt 100 μs, négyzet alakú, kétfázisú impulzusokat ugyanolyan intenzitással alkalmaztuk, mint az alapállapotú rekordok felidézésére (ennek a krónikus készítménynek a további részleteit lásd [15]). A kiindulási rekordokat 15 percig gyűjtöttük, a párosított ingereket 20 másodpercenként bemutattuk. A HFS protokoll után az fEPSP-ket ismét 30 percig rögzítettük. Az 1B. Ábrán bemutatott kísérlet esetében további felvételeket végeztünk 15 percig a következő 2 nap alatt. Az 1C. Ábrán bemutatott kísérlet esetében egy nappal az első HFS-protokoll után egy második (15 perc) felvételt készítettünk, és egy második HFS-t mutattunk be a kísérleti állatoknak. A második HFS után az fEPSP-ket ismét 30 percig rögzítettük. További felvételeket végeztek 15 percig a következő 3 nap alatt [17].

Szövettan az elektróda helyének vizsgálatához

Amint azt korábban említettük [17], a kísérletek befejezése után a patkányokat mélyen altattuk (nátrium-pentobarbitál, 50 mg/kg) és transzkardiálisan perfundáltuk sóoldattal és 4% foszfáttal pufferolt paraformaldehiddel. A kiválasztott 50 μm-es szakaszokat, beleértve a hátsó hippocampust is, zselatinizált üveglemezekre helyeztük, és a Nissl 0,1% toluolidin kék festésével festettük a stimuláló és rögzítő elektródák helyes helyének megerősítése érdekében.

Patkányok operatív kondicionálása

Statisztikai analízis

Eredmények

A 2’-FL krónikus orális beadása, de a fukóz nem, javítja az LTP-t

A vagotómia gátolja a 2’-FL hatását az LTP-re

A vagotómia megakadályozza a 2’-FL potensító hatását az operáns kondicionálásra

Vita

A GBA perifériás komponensei több csatornán, például az enterális, autonóm és szimpatikus idegrendszeren keresztül kapcsolódnak a központi idegrendszerhez [33, 40]. Egyre több bizonyíték állítja, hogy a bélmikrobák az enterális idegrendszeren (ENS) keresztül modulálhatják az agy fejlődését és működését [41, 42]. Az ENS a bélfalban található, és az ENS rendellenességei mind a felnőtteknél [43], mind a csecsemőknél [33] a gasztrointesztinális rendellenességek széles spektrumával társulnak. Az ENS az agyval a vagus idegen és a háti gyökéren, valamint a nodózus ganglionokon keresztül kapcsolódik össze [40], és az afferens vagus ideg a fő retrográd jelzőrendszer bélből agyba [44]. Ez utóbbira bizonyítékot szolgáltatott egy Lactobacillus törzs bevitele, amelyről kiderült, hogy szabályozza az érzelmi viselkedést és a vagus ideg integritása miatti központi GABA receptor expressziót [26]. Ezenkívül a vagus idegstimuláció potencírozza a hippocampus LTP-t szabadon mozgó patkányokban [22].

A legújabb áttekintések kiemelik a mikrobiom és az ENS-szabályozás közötti kapcsolat fontosságát [19, 41]. A HMO-k prebiotikus jellege és feltételezett szerepük az újszülött bél megfelelő mikrobiális közösségének fenntartásában a HMO-k egyik leginkább hivatkozott tulajdonsága [45]. A HMO-k ellenállnak az emésztési folyamatoknak, és előnyös metabolikus szubsztrátként szolgálnak a kiválasztott mikrobák számára, hozzájárulva a csecsemő bél mikrobiomjához [46]. A közönséges bél mikroorganizmusok egyensúlyának változásai módosíthatják a rövid láncú zsírsavak termelését, amelyek a bélbaktériumok fermentációjának termékei, amelyek kulcsszerepet játszanak a központi idegrendszer működésében [47, 48]. A HMO-król szintén beszámoltak a bél érését kiváltó tényezőkről [49], valamint megakadályozzák a bélnyálkahártya patológiás rendellenességeit, olyan súlyos, mint a nekrotizáló enterocolitis [50]. Így a HMO-k szabályozó szerepet játszanak a mikroba-bél nyálkahártya interfészén. A HMO-k aktiválhatják a bélfalban elhelyezkedő ENS-alkotóelemeket is. Ebben az értelemben beszámoltak arról, hogy a fukozilezett HMO-k (például a 2´-FL) ex vivo modellben csökkentik a vastagbél motoros összehúzódásait [23], felfedve a fukozilezett HMO-k által az enterális idegek közvetlen ingerét, bár a szerzők azt is javasolják, hogy a vagus idegen keresztül stimulálja az agyat.

A bizonyítékok alapján feltételeztük, hogy az afferens vagus ideg szerepet játszhat a bevitt 2´-FL modulációs hatásában az agy működésére. Ebben a tanulmányban megerősítettük ezt a hipotézist, amely szerint a bilaterális vagotomia megakadályozta a 2´-FL LTP-re gyakorolt könnyítő hatását (1C. Ábra). Hasonlóképpen, a 2´-FL kiegészített táplálékkal etetett álműtött állatok potencírozott LTP-t (1C. Ábra), valamint az asszociatív tanulással kapcsolatos tesztekben jobb teljesítményt mutattak (2C és 2D ábra), a korábban közölt adatoknak megfelelően [17]. A vagális út megszakadása a 2´-FL állatokon táplált vagotomizált patkányok eredményeit vezette a kontroll patkányokéhoz. Bár az LTP-vel kapcsolatos kutatásaink a hippocampusra összpontosítottak, a bevitt 2’-FL szintén befolyásolta az operáns kondicionálást, ami arra utal, hogy a hippocampuson kívüli egyéb neuronális áramkörök is érintettek lehetnek [51]. Ezért nagyon lehetséges, hogy a 2´-FL az agyi neuronok kiváltásával modulálja a különböző agyterületeket, és gerjesztő jelek juthatnak az agyba a GBA vagális útján keresztül.

Következtetés és záró megjegyzések

Összefoglalva, a szájon át alkalmazott 2’FL fokozza az agy működését és a kogníciót a vagus idegen keresztül patkányokban. A bevitt Fuc nem fejtette ki ezeket a hatásokat, bár a Fuc-rész intraventrikuláris vagy intraperitoneális injekcióval javíthatja az LTP-t és a tanulási/memória-képességeket. A bevitt Fuc nem gyakorolt hatást a szinapszis szabályozására, ami arra utal, hogy a 2’FL molekuláris integritása a belekben szükséges a központi idegrendszer működésére gyakorolt jótékony hatások kiváltásához. Továbbá az afferens vagus idegpálya a fő út az enterális jelek továbbítására, amelyet a 2´-FL jelenléte generál a bélből az agyba.

Annak ellenére, hogy a 2'-FL a szoptatott csecsemők vizeletében [57, 58] és plazmájában [56] található, és módosítás nélkül felszívódik és a véráramban szállítja, nincs publikált jelentés, amely megerősítené a 2'-FL jelenlétét sem az agy-gáton való áthaladás mechanizmusa. Ezt követően tisztáztuk a GBA-t, pontosabban a vagus idegkapcsolatok vesznek részt abban a hatásmechanizmusban, amelynek révén az étrendi 2’-FL fokozza a kognitív képességeket rágcsáló modellekben.

Finanszírozási nyilatkozat

A tanulmányt kizárólag az Abbott Nutrition finanszírozta. A finanszírozó támogatást nyújtott a szerzők fizetése formájában [EV, AB, MR, MLJ, RB, RR], valamint a kísérleti munkával kapcsolatos kiadások költségvetését. A finanszírozónak nem volt további szerepe a tanulmány tervezésében, adatgyűjtésében és elemzésében, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében. Ezeknek a szerzőknek a konkrét szerepei a „szerzői hozzájárulások” részben vannak megfogalmazva.