A gazdagabb környezet okozta anyai fogyás átprogramozza az anyagcsere gén expresszióját egér utódainál *

Yanchang Wei

A Kínai Tudományos Akadémia Állattani Intézetének, a Reproduktív Biológia Állami Fő Laboratóriumából, Peking 100101, Kína,

Cai-Rong Yang

A Kínai Tudományos Akadémia Állattani Intézetének, a Reproduktív Biológia Állami Fő Laboratóriumából, Peking 100101, Kína,

Yan-Ping Wei

§ Szülészeti és Nőgyógyászati Osztály, Changyi Népi Kórház, Weifang 261300, Kína,

Zhao-Jia Ge

A Kínai Tudományos Akadémia Állattani Intézetének, a Reproduktív Biológia Állami Fő Laboratóriumából, Peking 100101, Kína,

Zhen-Ao Zhao

A Kínai Tudományos Akadémia Állattani Intézetének, a Reproduktív Biológia Állami Fő Laboratóriumából, Peking 100101, Kína,

Bing Zhang

¶ Kínai Tudományos Akadémia Genomtudományok és Információk Fő Laboratóriuma, Pekingi Genomikai Intézet, Kínai Tudományos Akadémia, Peking 100029, Kína és

Yi Hou

A Kínai Tudományos Akadémia Állattani Intézetének, a Reproduktív Biológia Állami Fő Laboratóriumából, Peking 100101, Kína,

Heide Schatten

‖ Missouri Egyetem, Állatorvosi Pathobiológiai Tanszék, Columbia, Missouri 65211

Qing-Yuan Sun

A Kínai Tudományos Akadémia Állattani Intézetének, a Reproduktív Biológia Állami Fő Laboratóriumából, Peking 100101, Kína,

Absztrakt

Bevezetés

Kísérleti sematikus. A kontroll vagy EE indukálta fogyás nőstényeket hímekkel pároztuk. A testsúlycsökkentő anyák utódainak javult az általános egészségi állapota, például csökkent testtömeg és zsírfelhalmozódás, valamint fokozott glükóz tolerancia és inzulinérzékenység. A génexpressziós profilalkotás feltárja a lipid- és koleszterin-bioszintézisben részt vevő gének koherens lefelé történő szabályozását. Következetesen differenciált metilációs mintákat figyeltek meg ezeknél az állatoknál. Az anya súlycsökkenése megváltoztatta az érett petesejtek epigenetikai nyomait, amelyek nagyban hozzájárulhatnak az utódok metabolikus és epigenetikai változásaihoz.

KÍSÉRLETI ELJÁRÁSOK

Gazdagított környezet protokoll

Microarray Expression profilalkotás

A teljes RNS-t a máj középső lebenyéből extraháltuk TRIzol-reagenssel (Invitrogen). Öt kontroll és négy, független anyától származó súlycsökkentő utódból vett mintákat választottunk a mikroszkópos elemzéshez a NimbleGen Mouse Gene Expression 12 × 135K Array (Roche NimbleGen) segítségével a gyártó utasításai szerint. Az adatok elemzéséhez egy sor szoftvert (NimbleScan szoftver és Agilent GeneSpring GX szoftver) használtak. A robusztus multichip elemzési módszerrel történő kiigazítás és normalizálás után az adatokat a Microarrays (SAM) szignifikancia-analízis (SAM) szoftverével elemeztük. Az összes tömbadat, valamint a minták és elemzések további részletei a Gene Expression Omnibus (GEO)> GSE40479 csatlakozási szám alatt érhetők el. A differenciálisan expresszált géneket a> 2-szeres változás alapján határoztuk meg, hamis felfedezési arány 5% -os korrekcióval. A differenciálisan expresszált géneket funkcionálisan annotálták a gén ontológiai kifejezések vagy a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathways alapján, a DAVID (Annotation, Visualization and Integrated Discovery adatbázis) segítségével. Ezenkívül a differenciálisan expresszált géneket hierarchikusan csoportosítottuk a Cluster 3.0 segítségével.

Kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR)

A mRNS szintjét qRT-RCR-rel elemeztük reverz transzkripció után, az előzőekben leírtak szerint (26). A májszövetek esetében a teljes RNS-t TRIzol-reagens (Invitrogen) alkalmazásával extraháltuk a máj középső lebenyéből, majd 260 és 280 nm-en elnyelt abszorbanciával PerkinElmer Life Sciences spektrofotométerrel meghatároztuk. Ezt követően templátként alkalmazták a komplementer DNS (cDNS) szintéziséhez SuperScript III első szálú szintézissel (Invitrogen) véletlenszerű hexamerekkel. A petesejtek esetében a sejtek cDNS-jének kis mennyiségének amplifikációja egy korábbi protokollon alapult (27). Az mRNS mennyiségét a Roche LightCycler 480 II kvantitatív RT-PCR rendszerrel (Roche Applied Science) határoztuk meg, az S1 és SYBR Green SuperMix-UDG (Invitrogen) kiegészítő adatkészletben összefoglalt primer szekvenciák alkalmazásával. A PCR-t 25 μl végtérfogatban hígított cDNS-mintából, 1 × SYBR Green Mix-ből (Invitrogen), az egyes célgénekre optimalizált primerekből és nukleáz-mentes vízből állítottuk. A PCR-állapot 40 ciklus volt 95 ° C-on 30 másodpercig, 55 ° C-on 1 percig és 72 ° C-on 30 másodpercig. A génátiratok szintjét a háztartási β-aktin génre normalizáltuk. Az eredményeket 2 - ként fejeztük ki (célgén ciklusszám - β-aktin ciklusszám). Megjegyezzük, hogy az Lpin1 esetében a β izoformát (2. transzkriptiváltozat, GenBank TM belépési szám> NM_015763.4) használtuk az elemzéshez.

DNS-metilezési profilozás

Biszulfit szekvenálás

A biszulfit genomi szekvenálást a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (29). A biszulfit módosítását az EZ DNS Methylation kit (Zymo Research) segítségével hajtottuk végre. Az átalakított DNS-t ezután PCR-rel amplifikáltuk primerekkel, amelyeket az S1 kiegészítő adatkészlet foglal össze. A kapott PCR-termékeket a MinElute Gel Extraction kit (Invitrogen) segítségével tisztítottuk, és a pMD18-T vektorba (Takara) klónoztuk. Egyes klónokat növesztettünk, és a plazmidokat a PureLink Miniprep kit (Invitrogen) segítségével tisztítottuk. A pozitív klónokat PCR-rel igazoltuk, és nem kevesebb, mint 10 véletlenszerűen kiválasztott, minden alanyhoz tartozó klónt szekvenáltunk egy automatikus szekvenszerrel (ABI PRISM-77). A szekvenálási eredményeket a MethTools 2.0 alkalmazásával elemeztük. A biszulfit-szekvenálással vizsgált régiók a következők: Hmgcr, 13. kromoszóma: 97441152–97441498; Lss, 10. kromoszóma: 75994273–75994536; Sqle, 15. kromoszóma: 59146023–59146335; és Lpin1, 12. kromoszóma: 16596388–16596703.

mRNS-szekvencia

Az mRNS-Seq esetében három állat (mindegyik állatból egyformán) összesített mRNS-jét használtuk az elemzéshez, és értékeltük az egyes csoportok átlagos expressziós szintjét. Röviden: a természetes peteérésű érett petesejteket (a második meiózis metafázisa (MII stádium)) három kontroll és három EE nőstény F0 alapítótól gyűjtöttük össze (egérenként három petesejt, minden csoportnál kilenc petesejt). A kumulusz sejteket hialuronidáz-kezeléssel távolítottuk el a petesejtekből. A sejtek cDNS-jének kis mennyiségének amplifikációja egy korábbi protokollon alapult (27). A cDNS-eket 20 ciklusig egyenletesen amplifikálták PCR-rel. A könyvtárakat megtisztítottuk és szekvenáltuk Applied Biosystems SOLiD szekvenáló rendszeren. A szekvenálási adatokat az egér genomjához térképeztük, hogy kivonjuk a petesejtek teljes transzkriptóm információit. A leképezett olvasási adatokat a DEGseq csomag elemezte a korábban leírtak szerint (30). A detektált géneket 200-nál nagyobb megfelelő olvasási számmal választottuk a további elemzéshez. A differenciálisan expresszált génválasztáshoz a -szeres változás szelekciós módszert alkalmaztuk. Azokat a géneket, amelyek log2 értéke 0,584-nél nagyobb vagy −0,584 (-szeres változás> 1,5) alatt van, felfelé vagy lefelé szabályozottnak tekintettük.

Embrió transzfer

Az észt nőstény F0-alapítókat hímekkel pározták. A sikeres párzást a hüvelyi dugó jelenléte határozta meg, és a hüvelyi dugó jelenlétének reggelét 0,5 napnak jelöltük. Az egysejtű stádiumú embriókat a 0,5. Napon kontroll vagy EE nőstényekből nyertük, majd a 0,5 napos pszeudopregnáns nőstények petevezetékébe helyeztük át. A vemhes nőstényeket normál körülmények között egyedül hagyták, amíg almaik 3 hetesek voltak. Csak a 8–12 alom méretű anyákat vonták be, és az almokat 10 kölyökre standardizálták az 1. napon az anyacsoportokon belül, hogy elkerüljék a táplálkozási egyensúlyhiányt. Anyánként véletlenszerűen kiválasztott egy utódot alkalmaztak metabolikus és molekuláris vizsgálatokhoz, a természetes megtermékenyített állatok esetében leírtak szerint. A biszulfit-szekvenáláshoz használt blasztociszták esetében az embrionális (E) nap (3,5 nap) 3,5 blasztocisztát gyűjtöttük össze a petesejtek M2-táptalajjal történő öblítésével. Mindegyik biszulfit-kezelést 18 állatból összegyűjtött blasztocisztával végeztük, három állatból (mindegyik állatból véletlenszerűen kiválasztva hat blasztocisztát) minden csoport esetében.

Oocita in vitro érés

A petefészkeket három hónapos nőstény egerekből izoláltuk 46–48 órával a vemhes kanca szérum gonadotropin 10 nemzetközi egység (NE) intraperitoneális injekciója után. A petefészkeket ezután Petri-csészébe helyeztük előmelegített M2-táptalajjal, amelyet 2,5 μm milrinonnal egészítettünk ki, hogy megakadályozzuk a petesejteket a csíra vezikulumának lebomlásában. A kumuláris petesejt-komplexeket a petefészkekből úgy nyertük ki, hogy egy boncoló mikroszkóp látómezejében finom acél tűvel többször szúrta az antrális tüszőket. Háromszor M2-es tápközegben végzett mosás után a kumulus oocita-komplexeket M16-alapú tápközegben (10% FBS-t) tenyésztettük, kiegészítve 5 mm glükózzal, inzulinnal (5 μg/ml) vagy leptinnel (10 ng/ml). Az összes petesejt-tenyésztési kísérletet ásványi olaj alatt, 37 ° C-on, 5% CO2-tartalmú, nedvesített atmoszférában végeztük 16 órán át. A kumulusz sejteket hialuronidáz kezeléssel távolítottuk el a petesejtekből, és az első poláris testű petesejteket további vizsgálatokhoz használtuk fel.

Statisztikai elemzések

EREDMÉNYEK

Az EE által kiváltott anyai súlycsökkenés fiziológiai és anyagcsere-változásokhoz vezet az utódokban

A nőstény F0-alapítókat először elválasztástól 12 hetes korukig normál laboratóriumi körülmények között nevelték fel, ekkor véletlenszerűen EE-ketrecekbe helyezték őket, vagy 4 hétig normál ketrecekben tartották őket. Mind a kontroll, mind az EE egerek szabadon hozzáférhettek a normál étrendhez és a vízhez. 4 hetes EE után a női F0-alapítók testtömeg -17% -kal csökkentek a kontrollokhoz képest (2. ábra, A – D és az S2 kiegészítő adatkészlet). Ennek megfelelően a női EE F0-alapítók csökkent WAT-tömeg- és plazma-glükóz-, inzulin-, leptin-, koleszterin- és trigliceridszinteket mutattak (2. ábra, D és E, valamint az S2 kiegészítő adatsor). Az EE egerek és a kontrollok közötti energiafogyasztásban nem észleltek változásokat (2. ábra F), ami azt jelzi, hogy az EE egereknél tapasztalt csökkent zsírtartalom oka a megnövekedett energiafelhasználás volt. Ezenkívül a GTT-k és az ITT-k esetében az EE egerek javított glükóz toleranciát és fokozott inzulinérzékenységet mutattak a kontrollokhoz képest (2. ábra, G – I).

A máj génexpressziója és fiziológiája közötti összefüggés további feltárása érdekében megvizsgáltuk a máj koleszterin- és trigliceridszintjét, hogy megállapítsuk, hogy a lipid anyagcseréhez kapcsolódó gének differenciális expressziós szintjei összefüggenek-e a lipidszint változásával. A máj lipidanalízise drámai koleszterin- és trigliceridszint-csökkenést mutatott a testsúlycsökkentő utódok májában (5. ábra E és az S2 kiegészítő adatsor). Összességében ezek a molekuláris eredmények összhangban vannak a fiziológiai és metabolikus változásokkal.

Az anyai fogyás megváltoztatja a lipid anyagcsere gének metilációs mintáit utódokban

A rövid távú EE-nek nincs hasonló hatása, mint a standard EE-nek

Az embriótranszferből származó utódok metabolikus és génexpressziós változásai. A, testsúly és WAT súly (kontroll és EE, n = 8, illetve 8). Az egyszerűség kedvéért az A – C esetében itt csak nőstény utódokat mutatunk be, de a hímekkel kapcsolatos adatok az S2 kiegészítő adatkészletben állnak rendelkezésre. B, szérum biomarkerek (n = 8, illetve 8). C, a máj triglicerid és koleszterin szintje (n = 8, illetve 8). D, vércukorszint a GTT alatt (n = 6 és 8, ill. E, vércukorszint az ITT alatt (n = 8, illetve 7, ill. F, a koleszterin bioszintézisében részt vevő gének expressziója az utódok májában 3 hetes korban (n = 6, illetve 6). G, lipidanyagcserében részt vevő gének expressziója az utódok májában 3 hetes korban (n = 6, illetve 6). Az adatokat átlag ± S.E. (hibasávok). Az egypontos méréseknél a csillagok szignifikáns különbséget jeleznek a csoportok között: *, p. 9 A és 10 10 A) kimutatták, hogy hipermetilezettek a fogyó utódok májában. A súlycsökkentő anyák petesejtjeiben az Lpin1 promoter régiójában a metiláció jelentős csökkenését is megállapítottuk (9. ábra B). Ezzel szemben a Sqle metilációja nem változott a kontroll és a fogyás petesejtjei között (10. ábra B), ami azt jelzi, hogy a májban megfigyelt differenciális metiláció ezen a lokuszon a fejlődés egy pontján létrejön. Annak tesztelésére, hogy a differenciáltan metilált gének de novo-metilálódnak-e, vagy potenciálisan öröklik-e a DNS-metilációt az oocitákból, biszulfit-szekvenálást végeztünk E3.5 blastocystákon a megtermékenyített petesejtek embriótranszferje után. Mind a Hmgcr, mind a Lss magasabb metilációs szintet mutatott a testsúlycsökkentő mintákban a kontrollokhoz képest (9. A és 10.10 A ábrák), az Lpin1 pedig alacsonyabb metilációs szintet mutatott a testsúlycsökkentő mintákban a kontrollokhoz képest (9. B ábra), ami arra utal, hogy ezek a gének részben öröklik a metilezett allélokat a petesejtektől. Ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy bizonyos gének vagy régiók esetében a petesejtekben a citozin metilációs állapota erősen hajlamos a blasztocisztákban a metilációra, talán a metilezett citozinok hiányos posztfertilizációs demetilezésével.

Az anyai fogyás megváltoztatja az érett petesejtek általános transzkripciós mintáit

Az anya súlycsökkenése megváltoztatja az érett petesejtek általános transzkripciós mintázatát. A, a jelzett gének expressziójának számszerűsítése és validálása. qRT-PCR-t hajtottunk végre a jelzett gének esetében, és a súlycsökkenés/kontroll arányokat log2-ben mutatjuk be. Az mRNS-Seq-hez használt mintákat használtuk a qRT-PCR vizsgálat során. Mindegyik elemzést három példányban megismételtük, és a S.E. hibasávként jelenik meg. B – E, Apoe (B), Mapk3 (C), Hdac4 (D) és Carm1 (E) expressziója további hat standard EE, hat rövid távú EE és öt kontrollállat petesejtjeiben, amelyek nem szerepeltek a mRNS-Seq vizsgálat. Minden sáv egy független egeret képvisel. Minden egér esetében három-öt egyesített érett petesejtet használtunk a qRT-PCR elemzéshez. Minden mintát három példányban elemeztünk, és a S.E. hibasávként jelenik meg. A szaggatott vonal a -szeres változás gén expressziójának küszöbértékét képviseli, a normális szint több mint kétszerese.

Az anyai fogyás hatása az F2 generáció metabolikus és molekuláris változásaira

A súlycsökkenés okozta epigenomikus változások potenciális mechanizmusa a petesejtekben. A fejlődő petesejtek a follikuláris folyadékban szuszpendálódnak, ami egyedülálló táplálkozási mikrokörnyezetet biztosít, amely képviseli az anyai anyagcsere-állapotokat, például a lipideket és a biomarkereket. A petesejtek érése során epigenetikus nyomait az ovuláció előtti érés utolsó szakaszáig állapítják meg. Az anyai anyagcsere-körülményektől függően változó környezeti jelek bejuthatnak a petesejtbe, és epigenomikus változásokat eredményezhetnek a petesejtekben.

Különböző kiegészítések hatása a petesejtek in vitro érése során a Dnmt3a és Dnmt3l expressziójára. A, az RNS-Seq adatok validálásához Dnmt3a és Dnmt3l kvantitatív RT-PCR-t hajtottunk végre a háztartási β-aktin génhez viszonyítva, amely hasonló expressziós különbséget mutatott a csoportok között az RNS-Seq adatokkal összehasonlítva. B, a glükózpótlás hatása a Dnmt3a és Dnmt3l expressziójára. C, az inzulinpótlás hatása a Dnmt3a és Dnmt3l expressziójára. D, a leptin-kiegészítés hatása a Dnmt3a és Dnmt3l expressziójára. Mindegyik kísérletet három példányban megismételtük. Az adatokat átlag ± S.E. (hibasávok). A szaggatott vonal (1-ként állítva) az egyes gének expressziós szintjének átlagát mutatja a kontrollokból. *, p * Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány 3147055 számú támogatása és a 2012-es kínai ösztöndíjak nemzeti alapkutatási programja támogatta. 2012CB944404 és 2011CB944501.

Ez a cikk az S1 – S7 kiegészítő adatkészleteket tartalmazza.