A feszültség által vezérelt Hv1 protoncsatorna elvesztése diéta okozta elhízáshoz vezet egerekben BMJ Open Diabetes

A feszültség által vezérelt Hv1 protoncsatorna a NADPH-oxidáz (NOX) funkcióját közvetíti az intracelluláris pH szabályozásával a légzési törések során.

Az adipocitákban a felesleges tápanyagok aktiválják a pentóz-foszfát útvonalat, amely a sejtes NADPH fő forrása és NOX aktivációhoz vezet.

Mik az új eredmények?

A Hv1 deléció jelentős testtömeg-növekedést és zsír felhalmozódást eredményez, ha a tápanyagok elegendőek.

A Hv1-hiányos egereknél több glükóz-intolerancia alakul ki, de nincs jelentős különbség az inzulinrezisztenciában a WT-hez képest táplálkozási kihívás szerint.

A Hv1 hiány hozzájárul a máj steatosisához és gyulladásához.

Hogyan változtathatják meg ezek az eredmények a kutatás vagy a klinikai gyakorlat fókuszát?

A Hv1, mint a zsírszövet metabolikus homeosztázisának szabályozója, in vivo antiadipogenezis szerepet játszik.

Bevezetés

Az elhízást a glükóz vagy zsírsavak energiájának feleslege okozza, amelyek trigliceridként (TG) lerakódnak az adipocitákban, és amelyet az adipocita hipertrófia és a makrofágok felhalmozódása jellemez, ami gyulladásos előfordulással és inzulinrezisztenciával társul. aktiválja a NADPH-oxidázt (NOX) és a pentóz-foszfát-utat (PPP), amely a sejtes NADPH fő forrása és NOX-aktivációhoz vezet, ahelyett, hogy az adipocitákban mitokondriális oxidációval metabolizálnák. oxigénhez szuperoxid képződéséhez.

A NOX-ek aktivitását az ön-visszacsatolási mechanizmusok szabályozzák az elektrogén aktivitásukon és az intracelluláris pH-érzékenységükön keresztül. 5–9 Henderson és mtsai5–7 arról számoltak be, hogy az intracelluláris pH-változások összefüggésben vannak a NOX-ek aktivitásával, amelyek fenntartják a szuperoxid-képződést és képesek korlátozhatja a kompenzáló töltés mozgása az emberi neutrofilekben, és H + -vezető csatornaként határozták meg őket. Ezenkívül Morgan és mtsai10 szolgáltatták az első közvetlen és legerősebb bizonyítékot arra, hogy a feszültség által vezérelt Hv1 protoncsatorna elengedhetetlen a pHi szabályozásához az egyes sejtekben, amely az első transzporter, amely a pH-t a fagocita légzési kipattanása alatt szabályozza.

A közelmúltban a reaktív oxigénfajok (ROS) fontos szerepet játszanak az elhízással összefüggő inzulinrezisztencia patogenezisében, 12 amelyek kulcsszerepet játszanak az intracelluláris inzulin szignál továbbításában és védő hatást fejtenek ki az étrend által kiváltott inzulin megjelenése ellen. rezisztencia.13 14 Az elhízás, a ROS termelés és az NOX aktivitás szoros összefüggése ellenére a Hv1 szerepe az inzulinrezisztencia kialakulásában, az adipocita gyulladásban és a makrofágok zsírszövetbe történő toborzásában az elhízás kialakulása során még nem került feltárásra.

Itt megvizsgáltuk a Hv1 genetikai ablációjával rendelkező egerek metabolikus fenotípusát és azok válaszát a magas zsírtartalmú étrend (HFD) kihívására. Adataink azt igazolták, hogy HFD-etetéskor a Hv1-hiányos egerek érzékenyebbek voltak a diéta által kiváltott elhízás és máj steatosis kialakulására, gyulladás és NOX molekuláris aláírásával. Először tapasztaltuk, hogy a Hv1-hiány táplálkozási kihívásokkal érzékenyíti az anyagcserezavarok kialakulását, és elhízáshoz vezet. Adataink szerint a Hv1 közvetítheti az NOX-t a zsírszövet működésének szabályozásában és az elhízás elleni védelemben.

Kísérleti eljárások

Állatok és diéták

Azokat az egereket, amelyek a Hv1/VSOP-ban megcélzott rendellenességet szenvedtek (Hv1 -/-/VSOP, nyolcszor keresztezve), Dr. Y Okamura (Oszakai Orvostudományi Kar) szívesen látta el, a korábban leírtak szerint. 15 WT egér (Hv1 +/+/VSOP) azonos genetikai háttérrel rendelkeztek (C57BL/6J). Az állatokat kórokozóktól mentes létesítményben tartottuk 12 órás világos-sötét ciklus alatt, vízhez és standard egér-étrendhez (Lillico Biotechnology) hozzáférve állandó hőmérsékleten (23 ° C). A genotipizálást PCR-rel hajtották végre, Ramsey és munkatársai által leírtak szerint.11 A diéta okozta elhízáshoz az egereket 45% zsírkalóriát, 35% szénhidrátkalóriát és 20% fehérje kalóriát (4,73 kcal/g) tartalmazó HFD-vel táplálták (D12451; Kutatás Diéták) 5 hetes kortól 16 hétig. A testtömeget hetente mértük.

Szérum biokémia

A vércukorszintet a farokvénából 6 óra koplalás után kapott automatizált glükométerrel (One Touch, Johnson & Johnson, USA) mértük, és a szérum TG és összkoleszterin (TC) koncentrációt (BOMEI biotechnology, Kína), a gyártó utasításai szerint. A szérum inzulinszintet ELISA (Mercodia, Uppsala) alkalmazásával mértük a gyártó utasításai szerint.

Inzulin tolerancia teszt (ITT) és glükóz tolerancia teszt (GTT)

Az ITT-t és a GTT-t 6 órás böjt után végeztük el. Az egereknek intraperitoneálisan (ip) bioszintetikus humán inzulint (0,75 E/testtömeg-kg) (Novo Nordisk A/S) vagy steril 20% -os glükóz-PBS-t (2 g/testtömeg-kg) adtunk be. A plazma glükózszintjét az injekció után meghatározott időpontokban követtük nyomon (One Touch, Johnson & Johnson, USA). Eközben a vénás vért glükóz ip injekció után 0, 2, 5, 15 és 30 percen keresztül hűtött heparinizált csövekben vettük fel, azonnal centrifugáltuk, és a szérumot -80 ° C-on tároltuk.

Szövetgyűjtés és szövettan

A máj és az epididymális zsír minden állati szövetét eltávolítottuk és azonnal lemértük. Az olajvörös O (ORO) elemzéshez az egyes máj körülbelül egyötödét tartalmazó részt az optimális vágási hőmérsékletű vegyületbe (Tissue-Tek, Sakura Finetek, USA) ágyazzák, szárazjégre fagyasztják és -80 ° C-on tárolják a jövőben szakaszolás. Ezt követően soros 7 μm vastag metszeteket gyűjtöttünk poli-D-lizinnel bevont tárgylemezekre. A szakaszokat ORO-val és hematoxilinnel (BASO) festették a gyártó utasításai szerint. A szövettanhoz a máj és az epididymális zsírszövet mintáit 4% -os pufferelt formalinban rögzítettük, paraffinba ágyazottuk és 5 µm-es metszetekre vágtuk a H&E számára. Az adipocita méretét ImageJ szoftverrel mértük. Az RNS kivonására szolgáló epididymális zsírszöveteket a gyűjtéskor folyékony nitrogénben gyorsan lefagyasztották, majd később finom porra őrölték steril mozsárral és mozsárral folyékony nitrogénen.

Immunhisztokémia

A formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott szövet metszeteit egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on CD68 nyúl poliklonális antitesttel (1: 500 hígítás; Proteintech). A metszeteket háromszor PBS-ben mostuk, biotinilezett kecske nyúl antiszekunder antitesttel (Sigma-Aldrich) inkubáltuk 1 órán át, majd peroxid és peroxidáz szubsztrátot adtunk hozzá. A makrofágokat a CD68-pozitív terület megszámlálásával számszerűsítettük. A foltos szeleteket fordított mikroszkóp alatt (Eclipse Ti, Nikon) néztük meg, digitális képalkotó rendszer (NIS-Elements, Nikon) segítségével.

Kvantitatív valós idejű PCR

A teljes RNS-t izoláltuk epididimális zsírszövetből RNeasy Mini oszlopok (Qiagen) alkalmazásával. 600 ng RNS-ből komplett DNS-t állítottunk elő egylépéses gDNS eltávolítással és cDNS szintézis szuper keverékkel (Transgen) 20 ul reakcióelegyben. A reakciókat minden mintában két példányban futtattuk, és egy ViiA 7 valós idejű PCR rendszerben (Applied Biosystems) számszerűsítettük. A Ct értékeket normalizáltuk a GAPDH referenciagénhez, és a relatív génexpressziót a 2 - △△ Ct módszerrel számoltuk ki. 16 génspecifikus egér-primert használtunk az 1. táblázatban leírtak szerint.