Példák

A következő példákban, és ha másként nem jelezzük, az arányokat tömegszázalékban adjuk meg.

A fitoszfingozin stimuláló aktivitásának bemutatása egér adipociták által a leptin termelésére tenyészetben.

1. A teszt elve

Nagyon érdekes az a koncepció, amely szerint a zsírtömeg szekretált keringési tényezőkön keresztül szabályozható.

A teszt elve a leptin adipociták általi kiválasztásának szabályozása.

2. Anyag és módszerek

A 3T3 F442A sejtek tenyésztése

Nagyobb mennyiségű triglicerid felhalmozására képes klónt izoláltunk az egér 3T3 preadipocitáinak egy megalapozott sejtvonalából. A lipolitikus szerek csökkentik ezt a felhalmozódást. Ezért fontosnak tűnt a potenciális lipolitikus szerek tesztelése ezen a 3T3 F442A egér preadipociták sejtvonalon. Ezek a preadipociták (GREEN H. és KEHINDE O. - Spontán öröklődő változások, amelyek a 3T3 sejtekben fokozott zsírkonverzióhoz vezetnek, Cell Vol. 7, 105-113, 1976) szaporodhatnak és differenciálódhatnak azáltal, hogy rendelkeznek a morfológiai és biokémiai fenotípussal, amely a az érett adipocita differenciált funkciója. Ha exponenciális növekedési fázisban vannak, fibroblasztikus megjelenésűek, hosszúkás alakúak és nagyon tapadnak a támaszhoz. Összefolyáskor, amikor a körülmények ezt lehetővé teszik, egy nagyon korai morfológiai átmenet lekerekített alakot ad nekik.

A sejtek így klónikus amplifikációs folyamaton mennek keresztül. Ezekhez a morfológiai változásokhoz hozzáadódik a lipogenetikus enzimek aktivitásának növekedése, valamint a sejtek reakciója a hormonokra/faktorokra, amelyek befolyásolják a lipogenezist és a lipolízist.

A 3T3 F442A preadipociták tehát kiváló modellt képeznek a lipolízis tanulmányozására, a sejtek fejlesztési programja során megszerzett morfológiai és metabolikus transzformációk révén. (Pairault J és Lasnier F: A 3T3 F442A sejtek adipogenetikai differenciálódásának ellenőrzése retinsavval, dexametazonnal és inzulinnal: topográfiai elemzés: J. cell Physiol. 1987, 132, 279-86).

Az irodalom szerint a leptin a táptalajban választódik ki, mivel az az adipocitákban van tárolva. (Wabitsch M és munkatársai, Diabetes, 1996, 45. kötet, Bornstein S. és mtsai, Diabetes, 2000, 49. évfolyam, Friedman J M, Nutrition Reviews, 1998, 56. évfolyam, 2. szám).

A 3T3 F442A sejtekben különösen az ob gén expresszióját tanulmányozták (Leroy P és munkatársai, J. of Biol. Chem., 1996, 271 n ° 5, 2365-2368. Oldal, Considine RV et al., - Horm. Res. 1996, 46: 249-256.

A 3T3 F442A preadipocitákat D0-on mutatjuk be 35 mm-es Petri-csészékben (Corning), és 37 ° C-os kemencébe helyezzük levegő-CO2 atmoszféra alatt (95-5). A sejteket Dulbecco (4,50 g/l) glükóz (DMEM-GIBCO BRL) szerint módosított Eagle minimum esszenciális táptalajban tenyésztjük, kiegészítve 5% borjúszérummal (CS) (BIOMEDIA®) és 5% borjúmagzati szérummal (GIBCO). ) a növekedési szakaszban. A táptalajt D2 és D4 hőmérsékleten cseréljük.

A sejt összefolyásakor (D7-nél) a táptalajt cseréljük:

Az alap tápközeg ugyanaz marad (DMEM), de kiegészül a borjúmagzati szérum (FCS) 10% -ával és az inzulinnal (5 μg/ml) (SIGMA).

A táptalajt ezután D9 és D11 hőmérsékleten cseréljük.

A D14, D16 és D18 esetében olyan kezelést végeznek, amelynek összetételével a leptinszintézis hatékonyságát ellenőrizni kívánják.

A protokollt az alábbi táblázat foglalja össze:

A szekretált leptint egy szendvics típusú Elisa technikával határozzuk meg, amelyet Quantikine M egér Leptin immunvizsgálati készlettel folytatunk.

Az ELISA meghatározás során rekombinált egér leptint használunk, kifejezve E. coli és rekombináns egér leptin elleni antitestek.

A teszt „szendvicses” immunenzimatikus technikát alkalmaz. A mikrotányér lyukakat egér leptin poliklonális antitesttel béleljük.

A standardokat, a kontrollokat és a mintákat a lyukakba rakják le, és ugyanabban a pillanatban az összes jelenlévő leptin kötődik az immobilizált antitesthez.

A megkötött leptint ezután egy egér anti-leptin antitesttel detektáljuk, amely egy enzim peroxidázhoz kapcsolódik. Ezután egy szubsztrátoldatot adunk a mélyedésekbe. Az enzimatikus reakció kék oldathoz vezet, amely a kioltó oldat hozzáadása után sárgává válik.

A mért szín intenzitása arányos a jelenlévő leptin mennyiségével. Az optikai sűrűség leolvasását 450 nm-en végezzük a spektrofotométeren.

A meghatározást a dózis-válasz görbék után kapják meg a természetes leptin méréséhez viszonyítva, párhuzamosan a „rekombináns” Quantikine M standardokkal kapott standard görbékkel. A Quantikine M kit így lehetővé teszi a természetes egér leptin relatív tömegértékeinek meghatározását.

A 450 nm-en mért optikai sűrűség arányos a rögzített antitest mennyiségével, amely maga is arányos az eredetileg jelen lévő leptin mennyiségével. Az eredményeket pg/ml leptinben fejezzük ki, amely a sejt felülúszójában van.

A mintákat három példányban teszteltük.

Három 0,25, 1, illetve 2 μg/ml fitoszfingozint vagy annak hidrokloridját tartalmazó készítményt teszteltünk.

A 3T3-F442A adipociták esetében, amelyeket kezelés nélkül tartanak a kultúrában, a tenyészet felülúszójában jelen lévő leptin mennyisége az idő múlásával erősen növekszik (16,4 pg/ml D4-nél, 802 pg/ml D11-nél és 2623 pg/ml D20-nál) . Ez az eredmény összhangban van a biológiai adatokkal (Leroy P. 1996, Considine R V. 1996): bazális körülmények között az egér adipocitái növekvő mennyiségű leptint választanak ki érésük során. Megerősítjük tehát, hogy egy érett adipocita nagyobb mennyiségű leptint választ ki, mint egy preadipocita.

A felülúszóban jelen lévő leptin mennyiségét az alábbi 1. táblázat tartalmazza. A PS rövidítés fitoszfingozint jelöl.

7 napos kezelés után, azaz a D21 napon a fitoszfingozin fokozza a kezelt adipociták által a leptin szekrécióját, ez a hatás 0,25 μg/ml koncentrációnál maximális. A növekedés ennél a koncentrációnál valamivel több, mint 18%.

A fitoszfingozin-hidroklorid ugyanazon körülmények között végzett vizsgálatakor szintén felelős a leptin-szekréció stimulálásáért: + 52% 1 μg/ml-nél és + 26% 2 μg/ml-nél és + 18% 0,25 μg/ml-nél. A hidroklorid eredményeit az alábbi 2. táblázat tartalmazza.

Így a fitoszfingozin képes a leptin bazális adipocita szekréciójának növekedését kiváltani a 3T3-F442A zsírsejtben, amely modell nagyon közel áll az emberi adipocitához. A fitoszfingozin tehát fontos szerepet játszhat a zsírtömeg stabilitásának szabályozásában.

A fitoszfingozin és egy adenilát-cikláz aktivátor, például a Coleus forskohlii, elősegítve a lipogenezis csökkenését az egér adipocitáiban a tenyészetben.

1. A vizsgálat elve

Ez a tanulmány a két hatóanyag kombinációjának hatásaira vonatkozik, Coleus forskohlii (más néven: Plectranthus barbatus) (PB) és fitoszfingozin (PS) új adipociták toborzásánál.

Ismeretes, hogy a fehér zsírszövet fejlődése az egész életen át tartó folyamatot képvisel (AILHAUD G., GRIMALDI P., NEGREL R., Trends in Endocrinology and Metabolism, (1994) 5 (3) 132-6). . Az adipocita a zsírszöveten belül bőséges extracelluláris mátrixhoz kapcsolódik, amely magában foglalja az endothel sejteket, a kapillárisokat, az idegrostokat és a fibroadipoblast prekurzorokat is. Az érett adipocita egy sejt fenotípusát képviseli, amely egy adipocita prekurzor differenciálódásából származik. A preadipociták ugyanabban a zsírszövetben vannak, és bármelyik életszakaszban toborozhatók új zsírsejtek létrehozása érdekében: súlygyarapodás esetén a kezdeti fázisban az adipocita térfogatának növekedése áll fenn egy kritikus pont eléréséig, ami új sejtek toborzásához vezet (Bjorntorp P., Int. J. Obesity, 15 67-81 (1991)). A preadipocyták szaporodási és differenciálódási képessége meghatározó szerepet játszik a zsírtömegek kialakulásában. Ezeknek a sejteknek a fibroblasztokkal kapcsolatos hiperpláziája a zsírszövet növekedéséhez vezet.

Így az érett adipocitákat először PB + PS-vel kezeljük

Másodszor, az ezekkel az adipocitákkal kondicionált táptalajt érintkezésbe hozzuk olyan preadipocitákkal, amelyeknek az adipocitákba történő érlelését követjük.

A kontroll sejtek a kezelés kezdetén megkezdik a differenciálódást és bizonyos számú változáson mennek keresztül: a lipidcseppek térfogatának növekedése, számának és méretének növekedése, a lipogenetikus enzimek aktivitásának növekedése stb.

A trigliceridek szintézisének kulcsfontosságú enzime a glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz (G3PDH): fajlagos aktivitása az érés során jelentősen megnő, és így felhasználható az adipocita-konverzió pontos és érzékeny mérésére (Pairault J., Green H. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76, 5138-42 (1979); Koekemoer TC és munkatársai: Int. J. Biochem. Cell Biol. 27, 625-32 (1995)].

Ezt az enzim aktivitásának alakulását követték az adipociták differenciálódásának mérésére.

Mivel a G3PDH egy vízben oldódó enzim, aktivitását a sejt őrlésének felülúszójában, megfelelő szubsztrátok (NADH, TEA (trietanol-amin) - EDTA, 50 mM, 1 mM) jelenlétében mérjük.

A fajlagos aktivitást ezekből a meghatározásokból számítják ki. A kezelt sejteket összehasonlítjuk a kontroll sejtekkel. Mivel a G3PDH a sejtek differenciálódásának állapotát tükrözi, annál nagyobb a fajlagos aktivitása, annál jobban differenciálódnak a sejtek, és fordítva: minél korlátozottabb a zsírtartalék a vizsgált szer hatására, annál nagyobb a G3PDH aktivitása alacsonyabb lesz.

Három mérés átlaga a szóráshoz viszonyítva átlagos fajlagos aktivitást ad. Ezután a százalékos gátlást kiszámítjuk az anyagok által termelt G3PDH aktivitásának gátlásához a kontrollokhoz képest.

A jó anti-lipogenetikus szerek minőségének biztosítását lehetővé tevő kritériumok egyrészt az enzim 50% -ot meghaladó százalékos gátlása, másrészt a nyers adatok, amelyek jelentősen eltérnek a kontrolloktól.

2. Anyag és módszerek

a) Kultúra és kezelések

Az differenciálódáson átesett adipocitákat, nem túl érett adipocitákat, más néven preadipocitákat, amelyeket az 1. példában megadott protokoll D7-nél kapunk, olyan táptalajjal kezeljük, amelyet érett differenciált adipocitákkal kondicionálunk, amelyeket nem kezeltek vagy kezeltek PB-vel vagy PS-vel, és a kombinációval. PB + PS 8 napig, tápközegcserével a D9 és D11 napon, az alábbi protokoll szerint.

A fitoszfingozint 0,25, 0,50 és 1 μg/ml végkoncentrációban teszteltük.

A kivonat de Plectranthus barbatus (PB) (tételszám: 0B2, INDENA) a forskolin 80% -át titráljuk, egy olyan molekulát, amelyet az adenilát-cikláz effektoraként ismerünk fel (Seamon K. és munkatársai, PNAS USA, (1981) 78 3363-67). . A vizsgálatban alkalmazott PB-koncentráció 25 μg/ml anyaoldatból 20 mg/ml etanolban.

b) A sejtkivonatok elkészítése

A sejtdugót kétszer mossuk PBS-pufferrel, és a sejteket karcolással nyerjük ki 25 mM TRIS-HCl-pufferben (pH 7,5), amely 1 mM EDTA-t tartalmaz 4 ° C-on. A sejteket őrléssel és 10 000 g-os centrifugálással homogenizáljuk. 10 perc 4 ° C-on.

A követett protokollt az alábbi táblázat foglalja össze.

c) A glicero-3-foszfát-dehidrogenáz (G3PDH) aktivitás meghatározása.

A G3PDH aktivitás meghatározása Kozak és Jensen módszerével történik: Kozak és Jensen, 1974, J. Biol. Chem., 249, 7775-7781.

A G3PDH a következő reakciót katalizálja:

A NADH fogyasztását az idő függvényében spektrofotometriával (KONTRON) mérjük 340 nm-en. Így kiszámítható egy abszorbanciaváltozás/perc (A Abs/perc), amely megfelel az enzimatikus reakció kezdeti sebességének. Az eredményeket specifikus aktivitásban (SA) fejezzük ki, vagyis nmol transzformált NADH-ban/perc/mg fehérje. A teljes fehérjetartalmat BCA módszerrel értékelik (Protein Assay Reagent-PIERCE LTD)

SA = 81,25 × Δ ⁢ ⁢ Abs ⁢/⁢ perc × 1 mg ⁢ ⁢ fehérje
3. Eredmények

A glicero-3-foszfát-dehidrogenáz (G3PDH) aktivitásának mérése.

A NAD + mennyiségét 8 nap elteltével a tenyészetek kezelésének függvényében az alábbi 3. táblázat tartalmazza.

A fenti 3. táblázat eredményeit a 3. ábra is bemutatja. 1.

8 napos érintkezés után az érett adipocitákkal kondicionált táptalajjal megfigyelhető a preadipociták PB-tartalmú táptalajjal való érlelődésének lassulása (a G3PDH aktivitás gátlása), és ez megfelel a sejtek toborzásának gátlásának. preadipociták, amelyeknek az érési marker enzim aktivitását 75% -ban gátolja.

A fitoszfingozin nem módosítja ezt az anti-lipogenetikus profilt: a PS + PB kombináció a G3PDH aktivitás 74 és 79% közötti gátlását okozza, az 1 μg/ml PS + 25 μg/ml PB kombináció a lipogenezis lelassulásához is vezet. ezeknek a preadipocitáknak az érése során, amely valamivel nagyobb, mint önmagában a PB-vel.

b) Az adipociták morfológiájának elemzése

Ezzel párhuzamosan az adipociták morfológiáját a Petri-csészék sejtjeinek közvetlen megfigyelésével elemeztük fordított fázisú mikroszkóp alatt (Olympus BH2). A sejteket morfológiai elemzéssel differenciáltnak tekintjük, amikor kerek körzetet kapnak, és hogy citoplazmájuk lipidcseppekkel van megtöltve. Ezzel ellentétben a lipid vakuolák mennyiségének csökkenése, amely egy megnyúltabb formához kapcsolódik, bizonyítja ennek az érésnek a lelassulását.

A PS + PB kombináció jelenlétében a sejteket az adipociták nagyon markáns delipidációja jellemzi, ami összhangban van a G3PDH enzim korábban mért aktivitásának csökkenésével.

Ábrák. 2, 3 és 4 show, ill.

ÁBRA. 2. ábra: kontrollkultúra sejtjei D7-nél. Ebben a kultúrában a sejtek nem nagyon differenciálódnak, nincs sok lipid vakuol. Ez a kezelés kezdete.

ÁBRA. 3. ábra: kontroll tenyészet sejtjei a D21-nél. A sejteket lipid vakuolokkal töltjük fel.

ÁBRA. 4. ábra: 25 μg/ml PB + 1 μg/ml PS kombinációval kezelt tenyészet sejtjei.

Ez a tanulmány azt mutatja, hogy az érett adipociták PB + PS kombinációjával végzett kezelés olyan információkat ad, amelyek mindezek alapján képesek lassítani a trigliceridek preadipocytákban történő felhalmozódását. A G3PDH lipogenetikai enzim aktivitásának csökkenése jelentős intracelluláris lipidcseppek kimerüléséhez vezet.

A leptin szekréciójának stimulálására alkalmas fitoszfingozin hozzáadása nem gátolta a PB masszív hatását a lipidek csökkenésére.

A leptin fenntartása az adipocitákhoz közeli környezetben tehát a jelmolekula szerepét töltheti be a zsírtömeg növekedése ellen. Kísértésnek tartjuk azt hinni, hogy a sejtek olyan sejtgyűjteménye, amelyek lipolízissel a trigliceridtartalom egy részéből kiürülnek, miközben továbbra is retrocontrol leptin üzenetet bocsátanak ki, hozzájárulhat a panniculus adiposus általi zsírraktározás csökkentéséhez.

A fitoszfingozin aktivitásának és a fitoszfingozin és a Coleus forskohlii, a leptin termeléséről és a lipolízisről.

A ZEN-BIO (USA) által forgalmazott, 41 éves nő plasztikájából származó emberi zsírsejteket az adipocita érésének előrehaladott szakaszában alkalmazták. Ezeknek a sejteknek a tenyészetbe történő befogadása 16 nappal a vetés után történt. Egy meghatározott táptalajban tenyésztik, biztosítva a differenciálódást az egész kezelés során.

D-16: vetés
D0: a kezelés megkezdése a Coleus (PB) és/vagy fitoszfingozin (PS)
D6 - D18: a különböző paraméterek meghatározása.

A tulajdonságai Coleus A 3T3F442A egér adipocitáinak fent leírtakat először ezeken az emberi sejteken ellenőriztük: lipolitikus aktivitás a glicerin és nem észterezett zsírsavak felszabadulásának mérésével.

Az alábbi 4. táblázat mutatja a glicerin felszabadulás értékeit a kontroll kultúrákban és a PS-vel kezelt tenyészetekben.

Nagyon világosan látszik, hogy a Coleus nagyon erősen stimulálja az adipocita lipolízist (+ 128% -os növekedés a glicerin felszabadulásában 18 nap alatt a kontrollhoz képest).

A nem észterezett zsírsavak felszabadulásának mérésével megfigyelhető továbbá, hogy a Coleus az adipocita trigliceridek erős hidrolízisét okozza, a glicerinnel párhuzamosan nagy mennyiségű nem észterezett zsírsavat szabadítva fel 25 μg/ml dózisban.

Más vizsgálatok azt mutatják, hogy a fitoszfingozin fokozza a leptin szekrécióját az emberi adipocitákban, mint az egér adipocytákban, a leghatékonyabb dózis alacsonyabb.

A leptin felszabadulásával párhuzamosan a fitoszfingozin 6 ng/ml dózisban felelős a glicerin időbeli felszabadulásáért, a nem észterezett zsírsavak egyidejű felszabadulása nélkül. Ez a megfigyelés megfelelhet a lipolízis új formájának, amely megfelelő a leptinnek, és amelyet már publikációk is leírtak.

Ábrák. Az 5. és 6. ábra a sejtek morfológiájának alakulását mutatja be az imént meghatározott körülmények között.

ÁBRA. Az 5. ábra az emberi adipociták kontroll kultúráját mutatja be a D18 napon.

Jelentős mennyiségű zsír vakuola egyértelműen látható.

ÁBRA. A 6. ábra humán adipociták tenyészetét mutatja be a D18 napon, a kezelés kombinációjával Coleus (25 μg/ml) fitoszfingozinnal (6 ng/ml). Világosan látszik, hogy a fitoszfingozin-Coleus kombináció hatalmas és látható csökkenéshez vezet, kevesebb lipidcseppkel és kisebb méretű lipidcseppekkel. Ezzel párhuzamosan nagyobb számú sejt veszi fel a nem túl érett sejtek megjelenését (hosszúkás forma és a lipid vakuolák hiánya).

Így e két hatóanyag kombinációja a zsírraktár erőteljes csökkenéséhez vezet, a leptin modulációja az emberi adipocitához közeli környezetben kulcsfontosságú lépés ebben a cselekvésben.