A fokozott lipolízis mechanizmusa a rákos cachexiában

Absztrakt

Klinikai vizsgálat. A betegek egy éjszakai böjt után jöttek a laboratóriumba. A Bodystat Quad Scand 4000 (Bodystat Ltd.) segítségével meghatároztuk a magasságot, a súlyt, a derék-csípő arányt és a testösszetételt bioimpedanciával. Vénás vérmintát nyertünk lipidek, glicerin, zsírsavak, albumin, C-reaktív fehérje, inzulinszerű növekedési faktor I (IGF-I), leptin, noradrenalin, adrenalin és inzulin meghatározására a kórház akkreditált rutin kémiai módszerével laboratóriumok és a pitvari natriuretikus peptidet RIA kit (Phoenix Peptides) segítségével mértük. A táplálkozási állapotot az onkológiára vonatkozó standardizált kérdőív segítségével értékeltük, amelyet szubjektív globális értékelésnek (SGA; ref. 12) nevezünk. A daganat stádiumát a műtét után a Nemzetközi Rákellenes Unió által kiadott rosszindulatú daganatok TNM osztályozása, 6. kiadás (13) szerint osztályozták.

Kövér biopsziák. A klinikai vizsgálat után hasi szk. zsírbiopsziát (0,5–1 g) tűbiopsziával állítottak elő a leírtak szerint (14). A szövetdarabokat (egyenként ~ 5 mg) sóoldattal gyorsan leöblítették és lipolízis vizsgálatoknak vetették alá. Az összegyűjtött zsírszövet egy 300 mg-os részét folyékony nitrogénben lefagyasztották, és későbbi génexpressziós vizsgálatok céljából -70 ° C-on tartották. Ez minden alany esetében megtörtént, három súlycsökkentő kontroll kivételével. Egy további 300 mg-os adagot ugyanúgy tartottunk a későbbi Western blot elemzéshez. Ezt hat cachexiás beteg, nyolc súlystabil kontroll és két súlycsökkentő kontroll esetében végezték el. Korábban kimutattuk, hogy az így eltávolított és lefagyasztott szövetdarabok mentesek a sérült sejtektől és a vértől (15).

Lipolízis. A tűbiopsziából megmaradt szövetet (500–600 mg) azonnal tovább dolgozták. Elszigetelt zsírsejteket állítottunk elő zsírszövet kollagenáz-kezelésével; meghatároztuk a zsírsejtek méretét; és lipolízis kísérleteket végeztek izolált zsírsejteken a leírás szerint (16). Röviden, a hígított zsírsejt-szuszpenziókat (2%, térfogat/térfogat) inkubáltuk egy albumin pufferben (pH 7,4), amelyet glükózzal, aszkorbinsavval és az inzulin kísérletekhez adenozin-deaminázzal és 10-3 mol/l 8 -bróm-ciklikus AMP (8-Br-cAMP). A sejteket 2 órán át 37 ° C-on inkubáltuk (bazális) vagy növekvő koncentrációban (10-16 -10-5 mol/l, az alkalmazott hormontól függően) noradrenalin, pitvari natriuretikus peptid, inzulin és 10-2 mol/L 8-Br-cAMP, 8-Br-cAMP (10-2 mol/L) önmagában vagy 10-2 mol/L 8-bróm-cGMP (8-Br-cGMP). Ezt követően meghatároztuk a glicerin felszabadulását az inkubációs közegbe (lipolízis index). További lipolíziskísérletek során a 8-Br-cAMP-t és az adenozin-deaminázt tartalmazó puffert a hormon-érzékeny lipáz-4-izopropil-3-metil- 2- [1- (3- (S) -metil-piperidin-1-il) -metanoil] -2H-izoxazol-5-on, BAY néven (17).

Öt rákos cachexiás beteg és nyolc súlystabil kontroll esetében elegendő mennyiségű zsírszövet stroma-frakciót nyertek a preadipocita izoláláshoz. Ezeket a sejteket pontosan megkülönböztettük a leírtak szerint (17) 2 hétig, és lipolízis kísérleteket (alap) vagy 10-5 mol/l noradrenalin nélkül végeztünk a leírtak szerint (16).

A lipolízis adatait kétféleképpen fejeztük ki: az első a glicerin felszabadulása egy gramm lipidre az érett zsírsejtek vagy egy gramm fehérje a preadipocita vizsgálatok során. A második a bazális (nem hormon által stimulált) glicerin felszabadulás függvényében zajlott. Ez utóbbit úgy határoztuk meg, hogy az antilipolitikus kísérletekben az inzulin által indukált értékeket elosztva a 8-Br-cAMP által indukált értékekkel, a lipolitikus kísérletekben pedig a noradrenalin- vagy pitvari natriuretikus peptid által indukált értékekkel osztva az alapértékekkel. A maximális hatást a maximális effektív hormonkoncentráció mellett kapott értékként határoztuk meg. Elsőbbséget kapott a lipolízis expressziója az alapsebesség függvényében, mivel szoros kapcsolat van a lipolízis expressziójának ez a módja és a HSL gén vagy fehérje expressziója között az emberi s.c. zsírsejtek (18).

Fehérje expresszió. Körülbelül 300 mg fehér zsírszövetet összetörtek és lizáltak fehérje lízis pufferben [1% Triton-X 100, Tris-HCl (pH 7,6) és 150 mmol/l NaCl, 4 ° C], kiegészítve proteáz inhibitorokkal [1 mmol/L fenil-metil-szulfonil-fluorid és teljes (Boehringer Mannheim)], és homogenizáltuk. A homogenizátumot centrifugáltuk, az infranatánt összegyűjtöttük és mentettük. A fehérjetartalmat BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce) segítségével határoztuk meg. Száz mikrogramm teljes sejtfehérjét töltöttünk poliakrilamid gélekre, és standard 12% SDS-PAGE-vel választottuk el őket. A géleket polivinilidin-fluorid membránokra vittük át (Amersham Pharmacia). A blotokat 1 órán át szobahőmérsékleten blokkoltuk Tris-pufferolt sóoldatban, 0,1% Tween 20 és 5% zsírmentes szárított tejjel. Ezt egy éjszakán át tartó inkubálás követte 4 ° C-on HSL (19) vagy a kontroll-fehérje β-aktin (Sigma) elleni antitestek jelenlétében. A torma-peroxidázhoz konjugált szekunder α-nyúl antitestek a Sigma-tól származnak. Az antigén-antitest komplexeket kemilumineszcenciával detektáltuk a Pierce detektáló készletével (SuperSignal), a specifikus sávokat detektáltuk és mennyiségileg meghatároztuk Chemidoc XRS rendszer és a Bio-Rad Quantity One szoftver segítségével, és HSL/β-aktin arányban fejeztük ki.

Statisztikai analízis. A jelentett értékek átlag ± SD vagy medián és tartomány. A zsírszövetes értékeket normális eloszlásúnak tekintettük, mivel a korábban vizsgált nagy kohorszok retrospektív elemzése ugyanazon lipolízis és gén vagy fehérje expressziós módszerek alkalmazásával az adatok normális eloszlását mutatta (18, 20, 21). Az eredményeket ANOVA és megfelelő post hoc tesztek, Student páros vagy páros t teszt, vagy lineáris regresszió alkalmazásával hasonlítottuk össze a legkisebb négyzetek módszerével. Kruskal-Wallis és Mann-Whitney teszteket használtunk az SGA és a tumor pontszámok összehasonlításához. A páciensek gyűjtése előtt egy teljesítményszámítást végeztek, amely a maximálisan noradrenalin által kiváltott glicerin felszabadulás korábban ismert eloszlásán és a bazális glicerin felszabadulásán osztva volt (22). Arra számítottunk, hogy a súlystabil betegek toborzása könnyebb lesz, és a három csoport relatív arányát 2: 3: 2-re számítottuk. Ezen becslések, valamint a noradrenalin/bazális lipolízis átlagának és SD-je alapján kiszámítottuk, hogy 7 cachexiás, 11 súlystabil kontroll és 7 súlyvesztő kontroll beteget kellett toborozni ahhoz, hogy 70% -os különbséget észleljünk a cachexia és a két között. kontrollcsoportok a P-n A táblázat megtekintése:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

A vizsgálati csoportok jellemzői

Lipolízis in vitro. Az inzulin hasonló koncentrációfüggő módon gátolta a lipolízist a három csoportban (1. ábra). A lipolízis maximális gátlása 55% és 60% között változott ezekben a csoportokban (1. ábra).