A Gilbert-szindróma molekuláris genetikai alapjai

Molekuláris és sejtes patológia és

Gyermekegészségügy, Ninewells Medical School, The University, Dundee, Skócia

Molekuláris és sejtes patológia és

Gyermekegészségügy, Ninewells Medical School, The University, Dundee, Skócia

Absztrakt

BEVEZETÉS

A Gilbert-szindróma (GS) enyhe, konjugálatlan hyperbilirubinaemia, amely májbetegség vagy nyilvánvaló haemolysis hiányában jelentkezik, és enyhe, időszakos sárgaság epizódjai jellemzik; 1 szérum teljes bilirubin (STB)> 18 μmol/L emelkedik 25-50 μmol/L-re 24-órás 1680 kJ-os étrendet követve. 2

A máj mikroszomális bilirubin-uridin-difoszfát-glükuronoszil-transzferáz (B-UGT) katalizálja a bilirubin és a glükuronsav konjugációját, így képződik a vízben jobban oldódó bilirubin-diglukuronid, amely az ATP-függő transzporteren, az MRP2-n keresztül távozik az epe epeüregébe. 3 A bilirubin uridin-difoszfát-glükuronozil-transzferáz a sebességet korlátozó enzim a bilirubin 4 eliminációjában, és a nem konjugált hyperbilirubinaemiát a B ‐ UGT gén hibái okozhatják (UGT ‐ 1A1).

Itt áttekintjük azokat az adatokat, amelyek arra utalnak, hogy a UGT ‐ 1A1 gén felelős a Gilbert-szindrómáért és az elhúzódó újszülöttes sárgaság sok esetben.

AZ ELEMZÉS UGT ‐ 1A1 GÉN

A. Kódoló régióinak polimeráz láncreakció szekvencia elemzése UGT ‐ 1A1 (B ‐ UGT) gén (1. ábra) legalább 30 különböző mutációt tárt fel, amelyek súlyos hiperbilirubinaemiához vezetnek, amelyeket a Crigler – Najjar (CN) I. és II. Szindróma ír le. 4 A hipobilirubinaemia csökkenésének felismerése a fenobarbitál hatására a CN ‐ II-ben azt mutatta, hogy a máj bilirubin UGT-t gyógyszerek indukálhatják, és korrelálhat a szérum bilirubin csökkenésével. 4 Valójában a potenciális kábítószer-szabályozási helyek az 5'-es régióban közvetlenül a UGT ‐ 1 gén. Nyilvánvaló, hogy az intronon vagy a szabályozó régión belüli mutáció a bilirubin UGT aktivitásának és a hyperbilirubinaemia csökkenéséhez is vezethet. 5.

Az uridin-difoszfát-glükuronozil-transzferáz intron/exon szerkezete (UGT ‐ 1A1) gén. A diagram az UGT-1 gén komplex UGT-1A1 komponensét és a TATA box promoter régiót mutatja.

UGT ‐ 1A1 PROMOTER ÉS GILBERT SZINDRÓMA

Az 1. És 2. Specifikus exon közötti genetikai távolság UGT ‐ 1 gén komplex körülbelül 13 kb 6, és leírható, mint UGT ‐ 1A1 promóter. Az 500 bp azonnal 5 ′ UGT ‐ 1A1 a transzkripció kezdőpontja számos lehetséges szabályozó elemet tartalmaz, beleértve a „Barbie Box”, az aktivátor fehérje-1 (AP1) és a C-E kötő fehérje (C-EBP) konszenzus szekvenciát ezen transzkripciós faktorok megkötésére. 7 Valóban, a C-EBPα egérrel történő kiütése sárgás fenotípust eredményez, ami arra utal, hogy ez a transzkripciós faktor kulcsfontosságú lehet a bilirubin UGT expressziójának szabályozásában. Ez az 500 bp szekvencia szokatlan promoter régiót (TA) is tartalmaz. Bosma és munkatársai az előzetes munkában 9 azt javasolták, hogy a TA 6 inszertálása ebben a régióban a (TA) 7TAA kialakulásához társulhat Gilbert-szindrómával. Ezt követően a Bosma 10 és a Dundee 11 csoport aktívan tovább vizsgálta ezt a javaslatot. A genetikai variáció, a TA inszerció ((TA) 7TAA allél) az UGT ‐ 1A1 promóter TATA dobozában szorosan összefügg a hyperbilirubinaemiával Gilbert pácienseiben. A máj UDP-glükuronoziltranszferáz aktivitása a normál szint körülbelül 30% -ára csökkent Gilbert-szindrómás betegeknél. 10.

A kelet-skót lakosok 11 és a kanadai inuit populációk felmérései a teszteltek 12–17% -ában mutatták ki a (TA) 7TAA allél homozigóta genotípusát. 12 A 2. ábra mutatja a mutáns allél variációját egy adag mintában. A. Régió promóciós régiói UGT ‐ 1A1 a páciens DNS-ben lévő gént polimeráz láncreakcióval amplifikáltuk, és az előállított DNS-fragmenseket Applied Biosystems 310 Analyzer (Applied Biosystems, Warrington, Egyesült Királyság) alkalmazásával elemeztük. A családi vizsgálatok kimutatták a (TA) 7TAA allél öröklődését és a szoros összefüggést a szérum teljes bilirubin szintjével (3. ábra).

Az uridin-difoszfát-glükuronozil-transzferáz (UGT-1A1) promoter polimeráz láncreakciójának (PCR) –DNS-fragmensének elemzése. Az ábra öt DNS-minta elemzését mutatja be, és feltünteti a TATA mezőben található genetikai variációt az azonosított fragmensek nagysága szerint. Az allél (TA) 6TAA-t 94 bp-os fragmensként, az allél (TA) 7TAA-t pedig egy 96 kb-os fragmentum képviseli. A heterozigóták mindkét fragmentumot előállítják.

A (TA) 7TAA allél öröklődése egy családi vizsgálatban, amely kimutatta a (TA) 7TAA genotípus szegregációját a megnövekedett szérum bilirubin koncentráció mellett egy családban. A férfiak és a nők négyzetekkel, illetve körökkel vannak ábrázolva. A kitöltött és félig kitöltött körök/négyzetek a 7/7 és a 6/7 genotípust jelzik. A törzskönyv egyes tagjai alatti számok a szérum bilirubin koncentrációt mutatják. A családtagok életkora zárójelben található.

FENOTÍPUS ÉS GENOTÍPUS KORRELÁCIÓ A NÉPESSÉGTANULMÁNYOKBAN

A szérum bilirubin és a (TA) 7TAA allél közötti összefüggés nem feltétlenül nyilvánvaló a véletlenszerű populáció tanulmányozása során, környezeti tényezők miatt. A szérum bilirubin szintje közvetlenül összefügg a máj bilirubin UGT aktivitásának expressziójával. Ez a tanulmány azt is közvetlenül bizonyította, hogy az etanol indukálhatja a máj bilirubin UGT aktivitását, 13 jelezve, hogy a környezeti tényezők hogyan befolyásolhatják a szérum bilirubin szintjét. Számos olyan tényező befolyásolhatja a mért fenotípust, mint a kábítószer, az alkohol, a dohányzás, az életkor és a nem. 7 Amikor az önkéntes populációk tartózkodnak a drogoktól, az alkoholfogyasztás és a dohányzás, és a szérum bilirubint egy éjszakán át tartó gyors mérés után, reálisabb fenotípusos szérum bilirubin értékeket mértek. 11 Az ilyen típusú adatokból kiderül, hogy a fenotípus és a genotípus jobban korrelálhat, mint egy véletlenszerű, nem tanácsos populációval (1. táblázat).

A szérum bilirubin szintén szignifikánsan korrelált az életkorral a 7/7 férfi genotípusokban (homozigóta a (TA) 7TAA allélra) egy önkéntes testület részéről, és egy másik tényezőt szolgáltat, amely befolyásolja a genotípus és a fenotípus asszociáció értékelését (G Monaghan, J Smith és B Burchell, publikálatlan munka, 1998). Korábban nem diagnosztizált GS-betegeket genotípus szerint azonosítottak, és a populáció 10–13% -ánál mutatkozott meg a 7/7 genotípus. A drogoktól, a dohányzástól és az alkoholtól való tartózkodás klinikai környezetben gyakran feltárja a Gilbert-szindrómával járó váratlan hiperbilirubinaemiát. 12 Számos nagyon nemrégiben készült tanulmány vizsgálta a TA dinukleotid polimorfizmusainak világpopulációit UGT ‐ 1A1 promóter. Ezeket az eredményeket a 2. táblázat foglalja össze. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a GS-hez kapcsolódó 7/7 allél az afrikaiak legfeljebb 23% -ában van jelen, japánokban és ázsiaiakban azonban nagyon ritkán fordul elő (14 Egy friss olasz tanulmány kimutatta, hogy a a GS-be sorolt egyének 7/7-es genotípust mutatnak

A HYPERBILIRUBINAEMIÁHOZ TÁRGYALT EGYÉB TATA PROMOTER GENOTÍPUSOK

Három új genotípus-variációt azonosítottak, amelyek a TATA box promoterhez és a hyperbilirubinaemiához kapcsolódnak. A heterozigóta genotípusok 5/6, 5/7 és 7/8 (például (TA) 8TAA). Más kódoló mutációt nem azonosítottak a UGT ‐ 1A1 gén (G. Monaghan et al., közzététel visszavonása adat).

Az 5/6 allélvariáció enyhén emelkedett STB-vel rendelkezik (22 vs. 15,6 μmol/L 6/7 hím esetében). Az 5/7 genotípus elhúzódó újszülöttkori sárgaságot mutatott (STB 127 μmol/L a posztnatális 57. napon), a 7/8 genotípus nem éhező STB értéke 54–68 μmol/L volt, ami valamivel súlyosabb, mint a legtöbb GS-s beteg esetében 2 ( G Monaghan et al., közzététel visszavonása adatok, 1999).

Így most négy van UGT ‐ 1A1 A GS-hez kapcsolódó TATA genotípusok. A TA ismétlések beillesztése vagy törlése a TATA promóterben (a leggyakoribb allélhoz viszonyítva, hat ismétlés) hyperbilirubinaemiával jár. A jelen jelentésben leírt 7/8 alany szemlélteti az átfedő STB koncentrációkat a GS és a Crigler – Najjar heterozigóták között (kódoló szekvencia hibákkal).

Egy friss jelentés szerint ezek a ritkább genotípusok csak az afrikai populációhoz kapcsolódnak, ami faji változékonyságra utal. 14 A laboratóriumunkban az 5. és 7. alléllal azonosított öt személy azonban skót (európai) kaukázusi származású, nem afrikai. Ezért a faji változatosságra vonatkozó javaslat, amelyet Beutler tett et al. 15-öt munkánk nem erősítette meg (G Monaghan et al., közzététel visszavonása adatok, 1999).

HETEROZIGOS MUTÁCIÓK A UGT ‐ 1A1 A GENE EXONS GILBERT SZINDRÓMÁJÁNAK GENETIKAI OKA

A TATA box mutációk gyakorisága csak 3% az ázsiaiaknál 14 és japánoknál. 16 Ezért jelentős különbségek vannak a japán/ázsiai populációk és az európai és afrikai populációk között a TATA box mutációkban. 14 A legújabb munkák azt mutatták, hogy azoknak a családoknak az enyhén érintett tagjai, amelyekben a II-es típusú CN fordul elő, heterozigóta mutatókkal rendelkeznek az UDP-glükuronoszil-transzferázban UGT ‐ 1A1 (G71R és Y486D), klinikailag a Gilbert-szindrómás betegek közé sorolhatók. 17, 18 Egy japán és ázsiai népességi tanulmány kimutatta a G71R allél magas gyakoriságát, különösen sárgás japán újszülötteknél 19 (3. táblázat).

A G71R allélt nem találták egy elemzett európai populációban. A heterozigóta és homozigóta G71R mutáció a bilirubin UGT expressziójának hozzávetőleges 40 és 70% -os csökkenését okozza. 20 Nyilvánvaló, hogy mindkét genotípus klinikailag meghatározott fenotípushoz vezethet a különböző populációkban. A súlyosabb hiperbilirubinaemiához vezető összetett genetikai rendellenességeket egyes japánoknál Crigler-Najjar II-nek nevezhetjük, mivel az egyes polimorf genotípusok meglehetősen gyakoriak a japán populációban. 21

GILBERT SZINDRÓMA ÉS HOSSZÚSÁGOS SZÜLETETT SÁRGA

Az újszülöttek sárgasága az újszülöttek körülbelül 50% -ában fordul elő az élet első 5 napjában (főleg nem konjugált bilirubinból származik), és fiziológiai sárgaságnak nevezik. 22 Az újszülöttek késleltették a bilirubin UDP-glükuronosziltranszferáz (UGT-1A1) expressziójának érését, normál aktivitással 3 hónapos korukig. Normál, teljes idejű emberi újszülötteknél az STB az első 72 órán belül megközelítőleg 100 μmol/L-re emelkedik (normális felnőtt STB ≤ 17 μmol/L) és 7-10 napon belül csökken. A plazma bilirubinok magasabbak a szoptatott csecsemőknél, az élet első 10–19 napján elérik a 256–410 μmol/l értéket, az anyatej sárgasága (BMJ) a szoptatott újszülöttek 0,5–34% -ában fordul elő. 24-26. A patológiás sárgaság diagnosztikai vizsgálatait általában teljes időtartamú újszülötteken végzik, akiknek STB-értéke> 200 μmol/L. 27 Maisels et al. nem tudták megtalálni a patológiás okokat a teljes időtartamú csecsemők 56% -ában, STB> 200 μmol/l. 28 A GS (általában felnőtt állapotnak tekintett) magas előfordulása arra késztetett bennünket, hogy vizsgáljuk meg, vajon a teljes időtartamú újszülötteknél a megmagyarázhatatlan sárgaság korai-e a GS kifejeződését. Bancroft et al. azt javasolta, hogy a GS felgyorsítsa az újszülöttek sárgaságának kialakulását az élet első 2 napján. 29.

85 megmagyarázhatatlan sárgaságú újszülöttet vizsgáltunk, és szignifikáns összefüggést találtunk a nagyon elhúzódó sárgaság kialakulása és a 7/7 genotípus között a szoptatott csecsemőknél. Megállapítottuk, hogy a GS a nagyon elhúzódó sárgaságcsoport 31% -ában magyarázhatja a sárgaságot. 30 Az esetek 31% -ában kizártuk a kódoló szekvenciamutációk heterozigozitását (CN hordozó státusz), mint az elhúzódó hiperbilirubinaemia okát, bár ezek a szövődmények hozzájárulhatnak az esetek másik 69% -ához. Az anyatejben lévő tényezőkről úgy gondolják, hogy vagy gátolják a máj UDP-glükuronosziltranszferáz aktivitását az újszülöttben, vagy stimulálják a bilirubin újbóli felszívódását a bélből, ezáltal hozzájárulva a hiperbilirubinaemiához. 24 Ezért a 7/7 csecsemő alacsonyabb UGT ‐ 1A1 expressziós szintje (az anyatej faktorok mellett) a szoptatott csecsemőket sebezhetőbbé teheti, mint a palackban táplált csecsemőket a hosszan tartó hiperbilirubinaemia miatt.

Az amerikai indiánok 31 és az alaszkai eszkimók 32 megnövekedett érzékenysége az anyatej sárgaságára annak köszönhető, hogy ezekben a populációkban magasabb a GS előfordulása. Nemrégiben kimutattuk, hogy egy kanadai eszkimó népesség 17–19% 7/7 genotípusú, szemben a skót lakosság 12% -ával. A 10, 11 amerikai indiánok 31 és az alaszkai eszkimók 32 hasonló gyakoriságúak lehetnek a 7/7 mutációban, bár ezt még nem vizsgálták. Meg kell azonban jegyezni, hogy a navajo csecsemőknél a hem katabolizmus fokozódik a nem navajo kontrollokhoz képest. 33 Ezért az újszülöttek GS-jének (7/7 genotípus) azonosítása összefüggésbe hozható a tartósan nem konjugált hyperbilirubinaemia-ként megnyilvánuló tünetekkel a teljes idejű szoptatott újszülötteknél. Kívánatos egyértelműbben azonosítani a valódi kóros okokat és elkerülni a felesleges vizsgálatokat. Javasoljuk a GS (7/7) genetikai szűrését, mint egyszerű, hasznos kiegészítő tesztet az észak-amerikai, afrikai és európai populációk nagyon hosszan tartó újszülöttkori sárgaságának vizsgálatában. A Gly 71 Arg mutáció szűrővizsgálata szintén hasznos lehet japán és ázsiai populációkban.

GILBERT SZINDRÓMA ÉS SÁRGA MÁS GENETIKAI BETEGSÉGEKBEN

A 7/7 genotípus önmagában nem képes kiváltani az újszülöttek sárgáját más környezeti tényezők, például az anyatejben kifejezett tényezők nélkül. Ennek a közös genotípusnak a kombinációja más genetikai hibákkal azonban sárgaság kialakulásához vezethet, mivel a haem anyagcsere-rendszere további stressz alatt áll. Kaplan et al. kimutatták, hogy a Gilbert-szindrómával és a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz hiányával járó összetett genetikai kölcsönhatás újszülöttkori hyperbilirubinaemiát okoz. 34 Hasonlóképpen a hiperbilirubinaemia örökletes szferocitózisban 35 és a heterozigóta β ‐ thalassemiaban összefügg az coinherited Gilbert-szindróma 7/7 genotípusával.

A GILBERT FENOTÍPUSÁHOZ KAPCSOLÓDÓ VÁLTOZATOK A KÁBEN GLUCURONIDÁLÁSBAN

Ez a betegség változást okozhat a gyógyszer glükuronidációjában és a gyógyszer lehetséges mellékhatásaiban a családi rendellenesség népességen belüli előfordulása miatt. Nincs nyilvánvaló jel a gyógyszer oxidációjának, acetilezésének vagy szulfatálásának károsodására. Számos gyógyszer, például tolbutamid, aminopirin és paracetamol csökkent clearance-ét figyelték meg, 38 bár a csökkent clearance nem volt nyilvánvalóan összefüggésben az egyéjszakás vizeletmintákban mért csökkent glukuronidációs sebességgel. 37

De Morais et al. beszámoltak arról, hogy a paracetamol-glükuronid képződése hat GS-ben szenvedő betegnél mérve a plazmától való eltávolítással 2 órán belül, 31% -kal alacsonyabb volt a normál kontrollnál. A mintavétel időzítése kritikus lehet e jelentős különbségek meghatározásában, és az éjszakai vizelet szintje jobb mérés lehet 37, mivel az UGT ‐ 1A1 nem tekinthető kulcsfontosságú enzimnek a paracetamol-glükuronidációban. 40 Mindezeket a vizsgálatokat a Gilbert-kór genotipizálásának előnye nélkül végezték el.

Ma már felismerték, hogy az UGT ‐ 1A1, a fő bilirubin-metabolizáló forma, a bilirubin kivételével számos xenobiotikus szubsztrátja van, többek között az oktil-gallát, az emodin és a buprenorfin (41, 42), amelyek sárgaságot okozhatnak az UGT ‐ 1A1, különösen olyan GS-betegeknél, akiknek májaktivitása a normál szint 35% -ára csökken. 10.

Fontos, hogy a GS-ben szenvedő betegek polimorf variációja összefüggésbe hozható a rákellenes gyógyszer, az irrinotekán (CPT-11) csökkent glükuronidációjával. Wasserman et al. megfigyelt toxicitást ezzel a gyógyszerrel két GS-ben szenvedő betegnél. Egy 40 betegből álló vizsgálat azt mutatta, hogy a toxicitás előfordulása és súlyossága között nem volt különbség faj és nem alapján. A betegek közötti variabilitás farmakogenetikai variációra utal. A topoizomeráz 1 gátló késleltetett hasmenést váltott ki vastagbélrákban szenvedő betegeknél. 45 A bilirubin UGT-1A1 kimutatták, hogy glükuronidálja a CPT-11 metabolit 7-etil-10-hidroxi-kamptotecint (SN-38). A metabolikus arányok (SN ‐ 38/SN ‐ 38 glükuronid) a 7/7 genotípusú betegeknél jellemzően magasabbak voltak, mint más genotípusú betegeknél (6/6 és 6/7). Az epeindex 6980, szemben a 2180 ± 1110 (840–3730 tartomány) volt 7/7 genotípusú, illetve 6/6 genotípusú páciensben. 47

Így a Gilbert-szindróma a glükuronidációt és a terápiás gyógyszerek toxicitását befolyásoló farmakogenetikai variációként is leírható.

Absztrakt

A Gilbert-szindróma vitathatatlanul az emberekben ismert leggyakoribb szindróma. A legújabb molekuláris genetikai vizsgálatok megállapították, hogy a klinikai fenotípust dinukleotid polimorfizmus jellemzi az UGT ‐ 1A1 gén TATA box promóterében, leggyakrabban (TA) 7TAA, amely az afrikaiak 36% -át, de az ázsiaiaknak csak 3% -át érinti . Az UGT ‐ 1A1 gén (G71R) kódoló exonjának második gyakori heterozigóta mutációja azonban a japán és ázsiai Gilbert fenotípust is okozhatja.

A Gilbert-kór hozzájárul az elhúzódó újszülöttkori sárgasághoz a szoptatott csecsemőknél, és sárgaságot válthat ki, ha a haem anyagcseréjének egyéb rendellenességeivel együtt öröklik, és a Gilbert-szindrómának leírt genetikai variáció a gyógyszer glükuronidációjának farmakológiai eltéréseihez és a terápiás szerek váratlan toxicitásához vezethet.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönjük a skót Bel- és Egészségügyi Minisztériumnak és a Wellcome Trust-nak a munkát támogató alapokat.