A halolaj-programok anyai fogyasztása csökkentette a brojlercsirkék zsírosodását

Tárgyak

A cikkhez írt javítás 2018. július 27-én jelent meg

Ez a cikk frissült

Absztrakt

Bevezetés

A preadipocyták aktív szaporodása és differenciálódása röviddel a születés előtt és az élet első néhány évében érzékeny ablakot hoz létre a zsírfejlődéshez 1,2,3. Következésképpen az anyai étrend és a méhen belüli környezet befolyásolhatja a zsírlerakódást és az ebből adódó elhízási kockázatot. A zsírszövet fejlődési programozásnak van alávetve, amelynek során a méhen belüli expozíció tartós hatást gyakorol a szöveti fenotípusokra. Az anyai étrend, az életmód és a környezeti expozíció változásai a későbbi életkorban bekövetkezett fokozott zsírbetegséghez kapcsolódnak az adipocita növekedésre és az anyagcserére gyakorolt stabil hatásokon keresztül 4,5,6. A zsírszövet programozása különös figyelmet fordít a közegészségügyre, mert az elhízás, amely járványos az Egyesült Államokban és világszerte, életének elején kezdődik. Az Egyesült Államokban a gyermekek körülbelül 27% -a túlsúlyos vagy elhízott ötéves korára 7. Az elhízott gyermekek sokkal nagyobb valószínűséggel elhíznak felnőttként, összehasonlítva a normál testsúlyú gyermekekkel 8,9. Ezért a túlzott zsírfelhalmozódás korlátozása az élet első néhány évében fontos eszköz a felnőttkori elhízás megelőzésében. Az a bizonyíték, hogy a születéskor kialakuló zsírbetegség jósolja a zsírosságot később, gyermekkorban, kiemeli annak szükségességét, hogy megértsük a zsír fejlődését befolyásoló prenatális tényezőket .

A madárinfluenza egyedülálló modellt kínál, amelyben konkrétan manipulálják az embrióhoz juttatott zsírsavak készletét, és tesztelhetik a kikelés (azaz születés) után a zsírlerakódás hatásait. A sárgája biztosítja a zsírsavak nagy részét az embrióban fejlődő szövetekben, és a kikelés után egy-két napig, amíg az etetés meg nem valósul. A tojássárgája zsírsavprofilja módosítható a 22,23 tyúknak adott táplálékzsír forrásán keresztül. Például az EPA-val és DHA-val dúsított kereskedelmi tojásokat úgy állítják elő, hogy a tyúk étrendjét tengeri olajokkal egészítik ki. Ezt az összefüggést használtuk annak a hipotézisnek a tesztelésére, hogy az embrió dúsítása az EPA-ban és a DHA-ban, amelyet halolajban (FO) szállítanak, csökkenti a csibék zsírlerakódását. A kukoricaolajat (CO) referenciaként használtuk, mivel összehasonlítható mennyiségű PUFA-t (

60%), de elsősorban az n-6 családé. Valamennyi fiókát kikelés után CO-alapú étrenddel etették, hogy a kísérleti manipulációt az embrionális fejlődés időszakára korlátozzák. Bebizonyítottuk, hogy az anyai FO-táplálás jelentősen csökkentette a kikelés utáni adipozitást, a növekedésre nincs hatással. Eredményeink azt sugallják, hogy az anyai étrendben található zsírsavak hozzájárulnak a zsírszövet fejlődési programozásához.

Eredmények

Tojástermelés és csajszövet zsírsavösszetétele

A tyúktáplálék tojásminőségre gyakorolt hatásának felmérésére a keltethetőséget, a tojás súlyát és a keltetéskori csirke súlyt használták, amelyek egyikében sem különböztek szignifikánsan a CO és FO tyúkok tojásai (P > 0,05). Az agyban és a májban található foszfolipidek zsírsav-összetételeit profilizáltuk és minőségileg összehasonlítottuk, hogy megerősítsük, hogy az EPA és a DHA az FO-fiókák szöveteiben dúsul, a CO-fiókákhoz képest. Az agyat és a májat a kikeléskor mért relatív tömeg miatt használták. Az EPA-t és DHA-t tartalmazó foszfatidilkolin (PC) fajok dúsítási szintjeit az 1. táblázat mutatja. A szeres növekedés (FO/CO) a

1,2 (agyban 18: 0/22: 6) -

130,4 (PC 18: 4/22: 6 májban), több mint kétszeres dúsítással a legtöbb faj esetében. Ezek az adatok megerősítik, hogy az anyai táplálék zsírsavprofilja a keltetéskor a kapott csibék szöveti zsírsav-összetételében tükröződött.

Az anyai zsírsavforrás hatását a fejlődő zsírszövet zsírsavösszetételére GC-FID alkalmazásával számszerűsítettük. A hasi zsírszövet teljes lipidfrakciójának zsírsavösszetételét 7 és 14 napos korban elemeztük (2. táblázat). Öt zsírsav (palmitoleinsav, γ-linolén-, eikozén-, eikozadién- és dokozadiénsav) szöveti bősége az életkor előrehaladtával nőtt (PKor 2. táblázat CO vagy FO tartalmú étrendből 28 napig táplált tyúkokból előállított brojlercsirkék hasi zsírszövet zsírsavtartalma.

Testtömeg és zsírlerakódás

A csirkék szubkután zsírszövete az embrióban fejlődik ki, és kikeléskor látható, míg a hasi depó a kikelés utáni első napokban alakul ki. Mindkét raktár súlyát mértük, hogy értékeljük az anyai étrendben lévő FO hatását az utódok zsírlerakódására. A testtömeg nem különbözött szignifikánsan a CO és FO csirkék között sem 7, sem 14 nap alatt (3. táblázat). A táplálékfelvétel nem különbözött a CO és FO csibék között (az adatokat nem közöljük). Az anyai zsírsavforrás életkor-specifikus módon szabályozta mindkét depó zsírtartalmát. 7 napnál a szubkután és a hasi zsírosság nem különbözött szignifikánsan az FO és a CO csibék között (P > 0,05). Mindkét raktár relatív súlya azonban szignifikánsan csökkent a FO és a CO csibéknél (P 3. táblázat Az étrend-dúsítás hatása a CO vagy FO tartalmú étrendből 28 napig táplált tyúkokból előállított brojlercsirkék teljesítményére és szérum metabolitjaira.

A zsírsav-különbség lehetséges mechanizmusait a zsírsav-anyagcserét és az adipogenezist közvetítő gének expressziója alapján értékeltük. Amint a 3A. Ábra mutatja, az FO-fiókák zsírszövete lényegesen alacsonyabb peroxiszóma-proliferátor-aktivált gamma receptor-szintet expresszált (PPARG) és koaktivátora, a PPARGC1B (PPARG koaktivátor 1 β), mint a CO-fiókák szövete (P 0,05). A máj a madarakon a de novo lipogenezis elsődleges helye (mint az embereknél) 24, és fontos szerepet játszik a brojlercsirkék zsírlerakódásában 25. A diéta nem befolyásolta szignifikánsan a CPT1, ACOX1 és FASN májban (3C. ábra), összhangban az összehasonlítható máj triglicerid tartalommal FO és CO csirkékben (az adatokat nem közöljük).

A zsír proteomikája

Az FO és a CO csirkékből származó zsírszövet proteomjait LC-MS/MS módszerrel elemeztük, és összehasonlítottuk további útvonalak azonosításához, amelyeket az anyai FO etetés megváltozott. Összesen 95 ismert fehérje különbözött szignifikánsan (P 4. táblázat Differenciálisan expresszált fehérjék a hasi zsírszövetben FO és CO csibéknél 14 napnál.

Vita

A gyermekek elhízásának nagyon korai megjelenése kiemeli annak szükségességét, hogy megértsük, hogyan befolyásolja az anyai étrend és életmód a zsír felhalmozódását a születés után. Ez a tanulmány hiánypótolja az ismereteket, megmutatva, hogy a születés előtt a fejlődő embrióhoz szállított zsírsavak befolyásolják a zsírfejlődést. Pontosabban, az anyai étrend gazdagítása FO-ban csökkentette a csirke zsírosodását, összehasonlítva a CO-n alapuló anyai étrenddel. Minden fiókát CO-alapú étrenddel tápláltak kikelés után, korlátozva az étrendi manipulációt a kikelés előtti időszakra. Az általunk használt takarmányozási protokollt a tojások dúsítására fejlesztették ki a DHA és az EPA fogyasztói piaca számára. Noha nem mértük meg a tojássárgája zsírsavakat, az EPA és a DHA jelentős dúsulását találtuk a májban és az agy foszfolipidjeiben kikeléskor, jelezve, hogy az étrend a várt módon gazdagította a fejlődő embriót.

A megnövekedett kis zsírsejtek irányába történő elmozdulás, párosulva a csökkent szabályozott expresszióval PPARG és annak koaktivátorát PPARGC1B azt sugallják, hogy az anyai FO részben csökkentette az adipozitást azáltal, hogy gátolta a progressziót az adipogenezis révén. Az EPA és a DHA ligandumként működhet a PPARG aktiválásában, amely várhatóan elősegíti az adipogenezist ezen nukleáris receptor szerepe révén az adipocita differenciálódás orchestrációjában. azonban, in vitro tanulmányok kimutatták az EPA és a DHA pro- és anti-adipogén hatásait, amelyek oka lehet a sejtvonalak, a differenciálódási protokollok, a referenciakezelések és a zsírsavkoncentrációk 30,31,32 variációja. Érdekes módon elmozdulás a kis zsírsejtek fokozott gyakorisága és a fokozott expresszió felé PPARG zsír-1 egerekben írták le, amelyek endogén módon szintetizálják az n-3 PUFA-t egy új zsírsav-deszaturáz transzgenikus expressziója miatt. C. elegans 33. A mikroszkópos adatok azt mutatták, hogy a zsír-1 egerek adipocytáiban az n-3 PUFA-k konstitutív szintézise jelentősen elnyomta a GATA-kötő fehérje 3 expresszióját, amely általában gátolja a preadipocyták differenciálódását a PPARG 34 közvetlen elnyomásával. .

Meg kell határozni azokat a mechanizmusokat, amelyek révén az LC n-3 PUFA anyai fogyasztása csökkentheti az adipozitást az utódokban. Az EPA, DHA és metabolitjaik PPAR-okon keresztül történő transzkripciójának szükségessé válna ezen zsírsavak tartós dúsítása a zsírszövetben. A zsírsavprofil kimutatta, hogy az FO-fiókák teljes lipidkészlete 14 d-ig dúsult mind EPA-ban, mind DHA-ban, bár a CO-csoporthoz viszonyított hajtásgazdagodás az első és a második hét között csökkent. Hogy ez a dúsulás meddig tart fenn, különösen akkor, ha a kikelés utáni étrendet nem egészítik ki FO-val, azt még meg kell határozni. A zsírlerakódásban részt vevő gének epigenetikai módosulásai szintén a FO csibék csökkent adipozitásának alapját képezhetik. Egy nemrégiben végzett randomizált, kontrollált klinikai vizsgálatban kimutatták, hogy a terhesség alatti halolaj-kiegészítés a születéskor 21 kromoszóma-régiót differenciálisan metilez, egyes különbségek ötéves korig tartanak 44-ig. A keringő DHA-szintek, mind a terhesség korai szakaszában, mind a születéskor szignifikánsan korreláltak a PPAR-α metilációjával a 45-ös csecsemőknél, jelezve a lipid metabolizmus epigenetikai programozásának lehetőségét. Érdekes módon az Apolipoprotein B mRNS szerkesztő enzim 2-es katalitikus alegység (APOBEC2) mennyisége jelentősen csökkent (

Proteomikai adataink szerint 16-szoros) FO és CO zsírszövetben. Ez az enzim egy koordinált DNS-demetiláz-rendszer része, amely epigenetikus módosítással szabályozza a fejlődő embrióban a sejtek sorsát 46. Az APOBEC2 expressziója elsősorban a vázizomhoz kapcsolódik, amelyben a myoblast differenciálódásához kapcsolódik, de a csirkék zsírszövetében is kifejeződik 47. Ha az anyai FO-táplálás epigenetikus mechanizmusok révén csökkenti az adipozitást, amelyek gyakran stabilak, akkor fontos következményei vannak a gyermekkori (és potenciálisan felnőtt) elhízás ellenőrzésének új eszközeivel. Ennek a lehetőségnek a feltárásához további vizsgálatokra van szükség a metilációs minták és az anyai FO-táplálás egyéb epigenomikus jegyeinek jellemzésére.

Összefoglalva, adataink azt mutatják, hogy az anyai halolaj-fogyasztás csökkenti az utódok zsírlerakódását. Vizsgálatunk az élet első két hetére korlátozódott, és további kísérletek szükségesek annak megállapításához, hogy ez a hatás meddig fennmarad a csibék érésével. Ezek az eredmények kiegészítik a legutóbbi emberen végzett vizsgálatokat, amelyek összekapcsolják az LC n-3 PUFA-t az anyai étrendben a gyermekek csökkent zsírtartalmával. Ennek megfelelően kiemelik a zsír felhalmozódásának csillapításának lehetőségét és a gyermekkori elhízás kockázatát a születés előtti étrendi beavatkozás révén.

Mód

Fogyókúrák és tartás

Vér- és szövetgyűjtés

A fiókákat CO2 elfojtásával eutanizálták. Mindkét csoportból két fiókát eutanizáltak kikeléskor a máj és az agy gyűjtésére a lipidelemzésekhez. Az egyes szövetek mintáit fagyasztva lefagyasztottuk és -80 ° C-on tároltuk. A fennmaradó fiókákat 7 és 14 napos korukban eutanizálták. Az eutanázia idején a vért szív vénapunktúrával gyűjtötték és 10 ml szérum elválasztó csövekbe vitték (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). A szérumot centrifugálással elválasztottuk és -80 ° C-on tároltuk a keringő metabolitok elemzéséig. A hasi és femorális (szubkután) zsírraktárakat boncoltuk, és adipozitási indexként lemértük őket. Az egyes raktárakból és májból származó mintákat ezt követően folyékony nitrogénben lefagyasztották és -80 ° C-on tárolták. A hasi zsírszövet mintáit 24 órán át 4 ° C-on paraformaldehidben (4%) rögzítettük az adipocita méretének hisztológiai meghatározásához.

A szérum metabolitjai

Kereskedelemben kapható kolorimetriás vizsgálati készleteket használtak a szérum glükóz (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) és a nem észterezett zsírsav (NEFA) szintjének (Wako Chemicals, Neuss, Németország) mérésére.

Zsírsav-elemzés

Foszfolipid elemzés

A foszfatidilkolin fajok zsírsav-összetételét az agyban és a májban kikelt állapotban (n = 2/diéta) és a hasi zsírszövetben 7 napos korban (n = 5/diéta) összegyűjtöttük UltraHigh Performance Liquid Chromatograph (UHPLC) -MS alkalmazásával. (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA). A szövetmintákat (100 mg) habarcs és mozsár segítségével folyékony nitrogén alatt porítottuk fel. A foszfolipideket egy módosított Bligh és Dyer 65 protokoll alkalmazásával extraháltuk. A szárított extraktumokat 300 µl metanol/kloroform (9: 1) elegyben szuszpendáljuk az UHPLC-MS analízishez a 66. leírás szerint. A lipid fajokat pontos módszerrel azonosítottuk m/z és a retenciós idők. Az egyes foszfolipidosztályok lipid standardjait (Avanti Polar Lipids, Alabaster AL) futtattuk a retenciós idők igazolása céljából. Minden iondarabot használtunk annak igazolására, hogy a foszfatidilkolinok DHA-t és EPA-t tartalmaznak acil-láncként. Valamennyi ionfragmentálási vizsgálat esetében a felbontás 140 000 volt, 100-1500 szkennelési tartományban m/z. A normalizált ütközési energia 30 eV volt, 50% -os lépcsős ütközési energiával. A lipideket fragmenseik alapján azonosítottuk Xcalibur szoftverrel (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Az adatok elemzését a Maven szoftver 67 segítségével végeztük .

Adipocita mérete

Étrendenként három madár hasi zsírmintáját mindkét életkorban beágyazottuk, metszettük és hematoxilinnal és eozinnal (H&E; két tárgylemez/madár) festettük az adipocita méretének meghatározását, ahogyan azt korábban 53 leírta. Az egyes diétákat/étrendeket/korcsoportokat a három olyan madárral alkalmaztuk, amelynek adipozitási értéke a legközelebb volt a medián zsírossághoz. Röviden, az egyes tárgylemezeken három független mező képét rögzítettük 20x nagyítással, az Advanced Microscopy Group EVOS XL Core mikroszkóppal (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). A konzisztencia érdekében ugyanaz a személy végzett minden mérést. A J képet (1.48. Verzió, National Institutes of Health) használtuk az adipocita terület (μm 2) meghatározására, 2,8 μm/pixel mikroszkóp beállításokkal, és arra a korlátozásra, hogy a méréseknek meghaladják az 500 μm 2 értéket. A frekvenciaeloszlásokat úgy állítottuk elő, hogy az adipocitákat a terület alapján szemétkosarakba csoportosítottuk, és megszámoltuk az egyes tartályokban lévő sejtek gyakoriságát. Az adipocita térfogatának és a 68. számának kiszámításához standard módszert alkalmaztunk .

Valós idejű PCR-vizsgálat

Körülbelül 200 mg hasi zsírszövetből és májból öt csirkéből izoláltuk a teljes RNS-t 14 d-nél minden étrendcsoportban Invitrogen TM TRIzol TM (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával. Az öt olyan madarat alkalmaztuk, amelyeknél az adipozitás értéke a legközelebbi volt a medián zsírossághoz az egyes étrendeken belül. A CDNA-t 500 ng teljes RNS-ből szintetizáltuk 20 μl-es reakciókban iScript cDNS Synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) alkalmazásával. A kvantitatív valós idejű PCR-hez (QPCR) előre tervezett és validált primereket a Qiagen-től (Quantitect; Germantown, MD) szereztünk be. A QPCR-t három példányban hajtottuk végre minden mintán, az iQ SYBR Green Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) alkalmazásával, a korábban leírtak szerint 53. Az érdekes gének expressziós szintjét normalizáltuk a TBC1 doméncsalád 8. tagjának expressziójához (TBC1D8) házvezetőként használják.

Proteomika

Étrendenként három csibéből megközelítőleg egy g hasi zsírszövetet porlasztunk folyékony nitrogénben, amelyből kb. 60 mg-ot használtak fel a fehérje extrakciójához. A fehérjéket detergensmentes metanol/kloroform (2: 1) fehérjekivonási protokoll 69 alkalmazásával extraháltuk, amely lipidekben gazdag szövetek számára készült és Bligh and Dyer 70 módszer alapján készült. A vizes frakcióból a fehérjéket triklór-ecetsavval kicsapjuk, és szekvenáló minőségű tripszinnel emésztjük. Tisztítás után mindegyik mintából hozzávetőlegesen két mg proteolitikus peptidet nyertünk. Ezen peptidek ötven ug alikvot részét használtuk fel 2D-LC-MS/MS proteom mérésekhez LTQ Orbitrap tömegspektrométeren (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), a korábban leírtak szerint 71. A MyriMatch v2.1.111 72 felhasználásával a nyers tömegspektrumokat kerestük meg az előre jelzett fehérje adatbázisban, hogy azonosítsák a teljesen triptikus peptideket, amelyeket azután a megfelelő fehérjékbe csoportosítottak az IDPicker v.3 73-mal. Kizárólag legalább két azonosított peptidspektrummal és legfeljebb 0,02 q-értékkel rendelkező fehérje-azonosításokat vettek figyelembe a további elemzéshez. A peptid fragmenseket a fehérjékhez térképeztük fel a Gallus gallus genom (V3.0) az Uniprot segítségével.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzéseket SAS (V 9.4) alkalmazásával végeztük. Az adatokat a statisztikai vizsgálat előtt Shapiro-Wilks alkalmazásával ellenőriztük. A test- és zsírtömegeket, a szérum metabolitokat, a szöveti zsírsavösszetételt, az átlagos adipocita méretet és az adipocita számot ANOVA vegyes modell alkalmazásával elemeztük az étrend, az életkor és kölcsönhatásuk (diéta X életkor) fogalmaival. Jelentős F-tesztek (P 74 az adatok eloszlásának normalizálására. Különböző bőségű fehérjék funkcionális elemzését az Annotation, Visualization and Integrated Discovery adatbázisban található Functional Annotation and Pathway Mapping opciókkal végeztük (DAVID, V 6.8) 75. Minden statisztikai teszt segítségével végeztük P-≤ 0,05 értékek a statisztikai szignifikancia kritériumaként.

Az adatok elérhetősége

A jelenlegi vizsgálat során létrehozott adatkészletek ésszerű kérésre a megfelelő szerzőtől elérhetőek