A harmadik bázispárt tartalmazó DNS hatékony és szekvenciától független replikációja funkcionális hatbetűs genetikai ábécét hoz létre

Szerkesztette *: Jack W. Szostak, a Howard Hughes Orvostudományi Intézet és a Massachusettsi Általános Kórház, Boston, MA, és jóváhagyta 2012. június 6-án (2012. március 27-én kapott felülvizsgálatra)

tartalmazó

Absztrakt

A mindössze négy bázispárból (dA-dT és dG-dC) álló természetes négybetűs genetikai ábécé egész életen át konzerválódik, és a harmadik, természetellenes bázispár kifejlesztésével a terjeszkedés központi célja kémiai és szintetikus biológia. Nemrégiben kifejlesztettünk egy természetellenes bázispárjelölt osztályt, amelyet a d5SICS és a dNaM között kialakult pár példáz. Itt megvizsgáljuk az egy vagy több d5SICS-dNaM párot tartalmazó DNS PCR-amplifikációját a szekvencia sokféle összefüggésében. Normál körülmények között megmutatjuk, hogy ez a DNS nagy hatékonysággal és 99,9% -nál nagyobb hűséggel amplifikálható. A lehetséges szekvenciahatások szigorúbb feltárása érdekében mély szekvenálást alkalmaztunk a természetellenes bázispárt tartalmazó amplifikáció függvényében tartalmazó sablonok könyvtárának jellemzésére. Megállapítottuk, hogy a természetellenes bázispár gyakorlatilag minden szekvenciakörnyezetben hatékonyan, nagy hűséggel replikálódik. Az eredmények azt mutatják, hogy PCR és PCR alapú alkalmazásokhoz a d5SICS-dNaM funkcionálisan egyenértékű egy természetes bázispárral, és dA-dT-vel és dG-dC-vel kombinálva teljesen funkcionális hatbetűs genetikai ábécét biztosít.

A genetikai ábécé kiterjesztése egy természetellenes bázispárra a vegyi és szintetikus biológia központi céljává vált. A siker az ortogonális szintetikus komponensek figyelemre méltó integrációját jelentené egy alapvető biológiai rendszerben, és megalapozná a félszintetikus organizmusokat, amelyek megnövelt információ-tárolási és -keresési lehetőségekkel bírnak (1). Ezenkívül az alkotó nem természetes nukleotidok felhasználhatók a különböző érdekes funkciójú (2 or –4) DNS-ek vagy RNS helyspecifikus jelölésére, és potenciálisan forradalmasíthatják a nukleinsavak amúgy is mindenütt jelen lévő in vitro alkalmazásait, például az aptamert és a DNS/RNS-enzim szelekciókat ( 5., 6.), PCR-alapú diagnosztika (7., 8.), valamint DNS-alapú nanoanyagok és eszközök (9.).

Bár számos nem természetes bázispárról számoltak be (10 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –21), csak néhányat képesek valóban replikálni DNS-polimerázok (10, 11, 13, 16). Ezenkívül nyilvánvaló, hogy a legtöbb alkalmazás megköveteli, hogy a nem természetes bázispár ne csak nagy hatékonysággal és hűséggel replikálódjon, hanem az is, hogy a replikáció legalább megközelítőleg független legyen a szekvencia kontextustól. A szekvenciafüggőségek elfogult amplifikációt okoznának, és gyakorlatilag kizárnák a természetellenes alappár sok felhasználását. Semmilyen jelölt nem természetes bázispárról nem sikerült kimutatni, hogy szekvencia torzítás nélkül replikálódna, és így még egyik sem igényelhet funkcionális egyenértékűséget egy természetes bázispárral.

A túlnyomórészt hidrofób természetellenes bázispárok kifejlesztésére tett erőfeszítéseink a d között létrejött párok5SICS és vagy dMMO2 (28) vagy dNaM (11, 29) (Az 1. ábra d összehasonlítását mutatja5SICS-dNaM természetes dG-dC-vel). Valóban, ezeket a nukleotidokat helyspecifikusan több különböző funkcionális csoporttal rendelkező DNS és RNS jelölésére használtuk (2). Bár mindkettő dMMO2 és dNaM jó partnerek d-hez5SICS, kinetika és az előzetes PCR kísérletek azt mutatták, hogy d5SICS-dNaM a d-nél jobban replikálódik (11, 29, 30) és átíródik (12)5SICS-dMMO2. Sőt, a legfrissebb strukturális vizsgálatok azt mutatták, hogy a d5SICS-dNaM annak eredménye, hogy a polimerázok képesek arra, hogy a H-kötések hiánya nélkül átvegyék a Watson – Crick pár szerkezetét (31, 32).

Természetellenes (d5SICS-dNaM) és a természetes Watson – Crick (dC-dG) bázispárok.

Itt feltárjuk a d használatát5SICS-dNaM a replikáció szekvenciafüggőségének szigorú jellemzésével. Megállapítottuk, hogy a OneTaq, a Taq és a Deep Vent polimerázok kereskedelmi forgalomban kapható keveréke, egyszerre optimalizálja a d5SICS-dNaM replikáció. Ezután megmutatjuk, hogy a természetellenes bázispárt tartalmazó DNS hatékonyan amplifikálható számos különböző szekvenciakörnyezetben, beleértve a GC- és AT-gazdag szekvenciákat, randomizált szekvenciákat és több d5SICS-dNaM pár, több mint 99,9% hűséggel duplázva. Végül egy PCR-szelekció és mély szekvenálási elemzés segítségével megállapíthatjuk, hogy a természetellenes bázispár replikációja gyakorlatilag szekvencia-torzítás nélkül megy végbe. Összességében az eredmények azt mutatják, hogy legalábbis in vitro alkalmazások esetén d5SICS-dNaM funkcionálisan egyenértékű egy természetes bázispárral, és a természetes bázispárokkal együtt d5SICS-dNaM egy teljesen működőképes kibővített genetikai ábécét képvisel.

Eredmények és vita

A PCR hatókörének vizsgálata d5SICS-dNaM-et tartalmazó DNS-sel.

Először egy d-t tartalmazó DNS-templát amplifikációját jellemeztük5SICS-dNaM mindkét oldalán három randomizált szekvenciájú nukleotid áll a Taq, Vent (exo-) vagy a Deep Vent (exo-) exonukleáz-negatív polimerázokkal vagy a KOD, Phusion, Vent vagy Deep Vent exonukleáz-negatív polimerázokkal (SI függelék, S1. táblázat) és S1 ábra). Az exonukleáz-hiányos polimerázokkal végzett PCR-amplifikáció általában nagy hatékonysággal zajlott, lehetővé téve az egyes dNTP-k standard koncentrációjának (200 μM) használatát, de csak szerény hűséggel, ami arra utalt, hogy a természetes bázispárokhoz hasonlóan jelentős mennyiségű hűség korrektúrával járult hozzá. Ennek megfelelően az exonukleáz-járt polimerázokkal végzett amplifikáció nagyobb hűséggel ment végbe, de a természetes trifoszfátok magas koncentrációjának használatára is szükség volt (700 μM; valószínűleg a nem természetes bázispáron túl nem hatékony primer meghosszabbítás miatt), ami a hibára hajlamos a természetes DNS amplifikációja (33).

Azon feltételek feltárása érdekében, amelyek egyszerre optimalizálhatják mind a hatékonyságot, mind a hűséget, teszteltük a Taq és az exonukleázban jártas polimeráz különböző kombinációit (SI függelék, S2 táblázat és S2 ábra). Az amplifikáció általában olyan hatékonysággal folyt, amely összehasonlítható volt önmagában a Taq hatékonyságával, de olyan hűségekkel, amelyek jellemzőek voltak az exonukleázban jártas polimerázokra. Ez a megállapítás azt sugallja, hogy a természetes exonukleázban jártas polimerázok excíziós és extenziós aktivitásának arányát optimalizálták az evolúció során a természetes bázispárok számára, és hogy a d-t tartalmazó DNS hatékony és nagy pontosságú replikációja5SICS-dNaM enyhén csökkent exonukleáz aktivitást igényel. Ettől függetlenül egyértelmű, hogy a bináris polimeráz keverékek jobban megfelelnek a d-t tartalmazó DNS replikációjának5SICS-dNaM. Tekintettel annak megbízhatóságára, mint kereskedelmi termék, úgy döntöttünk, hogy tovább vizsgáljuk a OneTaq (Taq és Deep Vent keveréke a New England Biolabs cégtől) használatát.

Az amplifikáció szekvenciafüggőségének feltárása érdekében a természetellenes nukleotidokat beépítettük különféle DNS templátokba, ahol az oldalsó szekvenciák a magas GC-től a magas AT-tartalomig terjedtek, vagy randomizáltak voltak. A OneTaq, a standard PCR körülmények (pl. 200 μM dNTP-k és 1 perces hosszabbítási idő) és 100 μM mindegyik természetellenes trifoszfát alkalmazásával az összes templátot hatékonyan amplifikálták 99,7% és 99,99% közötti hűségekkel (1. táblázat és SI függelék, 1. ábra). S3) (a nukleotidonkénti 10–3–10–4 hibaaránynak felel meg). Ezek a hűségek a természetellenes bázispár 87% -tól> 99% -ig terjedő visszatartását eredményezték a termékben 1012-szeres amplifikáció után. Nyilvánvaló, hogy a OneTaq képes amplifikálni egyetlen d-t tartalmazó DNS-t5SICS-dNaM különféle szekvenciákban, nagy hatékonysággal és hűséggel.

A PCR-amplifikáció szekvenciafüggése

PCR szelekció és bioinformatikai elemzés.

A szekvencia kontextusának hatásának szigorú feltárásához PCR-szelekciót hajtottunk végre (2A. Ábra). A primerek által bevezetett élhatások figyelembevételére három szubkönyvtárat terveztek, amelyek tartalmazzák d-t5SICS-dNaM három különböző helyzetben 40 randomizált nukleotid régiójában (2B. ábra). Alkönyvtár-specifikus két nukleotid vonalkódokat vezettünk be a természetellenes bázispár helyzetének azonosítására a szekvenálási adatok elemzése során. A kombinált szubkönyvtárakat, összesen ∼2 × 1010 tagból, amplifikáltuk a OneTaq-tal, és alikvot részeket vettünk elemzésre 10 3 -, 10 6 -, 10 12 -, 10 18 - és 10 24-szeres amplifikáció után (SI függelék, Ábra S4). A preferenciálisan replikált szekvenciák szelekciós nyomásának megváltoztatásához párhuzamosan két amplifikációs készletet hajtottunk végre, amelyek csak hosszabbítási időben változtak (1 vagy 4 perc).

(A) PCR-szelekciós séma. x = NaM (vagy ha biotinilezett, annak analógja MMO2; lásd S5) és Y = 5SICS. (B) Könyvtártervezés. Azok a természetellenes bázispár közelében lévő régiók, amelyeket elemeztek az előfeszítések szempontjából, piros színnel, a kontrollként használt disztális régiók pedig zöld színnel jelennek meg. A nem természetes bázispár helyzetét jelző, könyvtárkönyv-specifikus vonalkódok a randomizált régiókat szegélyezik, és dőlt betűvel vannak feltüntetve. Az alapozó kötő régiókat PBR-ként jelöljük (szekvenciák az SI függelék S1 táblázatában).

Az egyes amplifikációk során vett alikvot részekből származó DNS-t két populációra választottuk szét annak alapján, hogy megtartotta-e vagy elvesztette-e a természetellenes bázispárt további hat PCR-ciklus végrehajtásával; a PCR során, dNaMA TP-t biotinilezett d-re cseréltékMMO2TP (2) (SI függelék, S5. Ábra), majd a sztreptavidin szilárd hordozón való áthaladás (2A. Ábra). A DNS szekvencia-előkészítéséhez további 10 PCR-amplifikációs ciklust hajtottunk végre Illumina primerekkel populáció-specifikus vonalkódokkal (SI függelék, S3. Táblázat) és csak természetes dNTP-kkel (a természetellenes nukleotidok természetes nukleotidokkal való helyettesítésére). A kémiailag szintetizált (nem erősített) szubkönyvtárakat ugyanazon eljárásnak vetették alá, biotinilezéssel és anélkül, hogy ellenőrizzék az elemzés során bevezetett torzításokat. Összesen 23 populációt elemeztek mély szekvenálással egy Illumina HiSeq2000 szekvenáló rendszeren (SI függelék, S3. Táblázat). Ebből az elemzésből összesen 58 millió nyers leolvasást generáltak és szűrtek a minőségi pontszám és a hossz szerint, ami átlagosan 1,6 × 10 6 olvasást eredményezett népességenként (összesen ~ 37 millió feldolgozott olvasás).

Az első elemzésből kiderült, hogy a szubkönyvtárak között nincs szignifikáns különbség, ami arra utal, hogy a természetellenes bázispár által előidézett torzítások nem függtek a sablonon belüli pozíciójától. Így a szubkönyvtárakból származó adatokat egyesítettük, és a nem természetes bázispárt kísérő 20 nt-re összpontosítottunk (2B. Ábra, piros). A szekvencia-torzítás első méréseként számszerűsítettük az egyes populációk sokféleségét az észlelt egypéldányos szekvenciák frakciójának kiszámításával. Ezenkívül kiszámítottuk a normalizált Shannon-entrópiát (35, 36) (Eq. 1),

Az egypéldányos szekvenciák (felső) és a normalizált Shannon-entrópia (alsó) töredéke az amplifikációhoz 1- (balra) vagy 4 perces (jobbra) hosszabbítási idővel. A piros vonalak a természetellenes bázispárhoz legközelebb eső régióknak, a zöld vonalak pedig a disztális kontroll régióknak felelnek meg (2B. Ábra). Azokat a populációkat, amelyek megtartották vagy elvesztették a természetellenes bázispárt, folytonos vagy szaggatott vonallal ábrázoltuk. A hibasávokat a három alkönyvtár független elemzéséből határoztuk meg.

A megfigyelt torzítások lehetséges hatásainak értékeléséhez tanulságos figyelembe venni következményeiket. A legnagyobb egy- és dinukleotid-torzítás a frel C (−1) - 1 volt a frel GC esetében (−1, −2) - 1 a nem természetes bázispárt megtartó populációban, amely a teljes 10 21-szeres amplifikáció után csak elérte a 0,32, illetve a 0,51 értéket. Ezek az értékek az 5′-C frekvencia növekedésének felelnek megNaM 18,71% -ról 24,65% -ra, az alpopuláció 5'-GC-vel rendelkezikNaM a szekvencia 2,30% -ról 3,48% -ra nő. Ezek az torzítások nem nagyobbak, mint a természetes szekvenciáknál megfigyelt torzítások (39), és valószínűleg nem zavarják a természetellenes bázispárt tartalmazó DNS in vitro alkalmazását, még akkor sem, ha a masszív amplifikációt igénylő alkalmazások.

Következtetés

Anyagok és metódusok

OneTaq PCR.

PCR szelekció és könyvtár tervezés.

Három szubkönyvtárat készítettünk d5SICS szálak standard automatizált DNS-szintézissel (a szekvenciákat az SI függelék S1 és d táblázatai mutatják beNaM szálakat a 2B. ábra mutatja). A randomizált régió szintéziséhez foszforamiditek keverékét állítottuk elő a korábban leírtak szerint (41). A három tisztított alkönyvtárat UV-vel számszerűsítettük, és 1: 1: 1 arányban kevertük, és 5 ng-ot OneTaq PCR-amplifikációnak vetettünk alá a fentiek szerint. 13 ciklus után a reakciókat 10 3-szoros tényezővel hígítottuk, és PCR-csövekbe helyeztük friss reagensekkel, majd 10 ciklust 10 3 hígítással, 2 × 20 ciklust 106 hígítással, végül 21 ciklust (összesen 84 PCR ciklust) ) (SI függelék, az S4A. Ábra a kvantitatív PCR adatokat mutatja). A különböző amplifikációs szinteken levő mintákat megtisztítottuk, mennyiségileg meghatároztuk és 10% -os nedenaturáló PAGE-n elemeztük (SI függelék, S4B. Ábra).

Duplex biotinilezés.

Az amplifikált termékeket (5 ng) további hat PCR-fordulatnak vetettük alá, és a fent leírt feltételekkel azonos körülmények között futtattuk, azzal a különbséggel, hogy a dMMO2TP-t használtak d helyettNaMTP-t (2) (SI függelék, S5. Ábra) és 80 nm hosszú primert (Primer1-poly-dT) alkalmaztunk a 21-nt hosszú Primer1 helyett, hogy lehetővé tegyük az amplifikációs termék 4% -os agarózgélen történő szétválasztását. (SI függelék, az S1 táblázat teljes szekvenciákat mutat be). Az ~ 180 bázispárnak megfelelő fragmentumot kivágtuk és kivontuk a gélből, megtisztítottuk és mennyiségileg meghatároztuk. Az egyes duplexek biotinilációs szintjét streptavidin gél mobilitási vizsgálattal (SI függelék, SI anyagok és módszerek) számszerűsítettük.

Mélyszekvenálás és bioinformatikai elemzés.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Steven Headnek, Lana Schaffernek és Dennis Shpakovnak a mély szekvenáláshoz és elemzéshez nyújtott segítséget. Ennek a munkának a finanszírozását az Országos Egészségügyi Intézetek \ xNemzeti Kutatási Források Klinikai és Transzlációs Tudományos Központja díj UL1 RR025774 (A.T.-nek) és az Országos Egészségügyi Intézet GM060005 támogatása biztosította (F.E.R. részére).

Lábjegyzetek

  • ↵ 1 Kinek kell címezni a levelezést. E-mail: floydscripps.edu .