Határok az immunológiában

Táplálkozási immunológia

Ez a cikk a kutatási téma része

A táplálkozás, a bél mikrobiota és az immunrendszer kölcsönhatása Mind a 9 cikk megtekintése

Szerkesztette

Reinaldo B. Oria

Szövetségi Egyetem, Ceara, Brazília

Felülvizsgálta

Yuji Naito

Kiotói prefektúra Orvostudományi Egyetem, Japán

Raquel Hontecillas

Virginia Tech, Egyesült Államok

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

Cikk letöltése
- PDF letöltése
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Kiegészítő
  Anyag
Exportálás
- EndNote
- Referencia menedzser
- Egyszerű TEXT fájl
- BibTex

OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

1 Agrártudományi Agrártudományi Egyetem, Gifu Egyetem, Gifu, Japán
2 Természettudományi és Technológiai Doktori Iskola, Gifu Egyetem, Gifu, Japán
3 Alkalmazott élettudományi tanszék, Alkalmazott Biológiai Tudományok Kar, Gifu Egyetem, Gifu, Japán
4 A nano- és élettudományok fejlett integrációs központja (G-CHAIN), Gifu Egyetem, Gifu, Japán

Bevezetés

A főként fekélyes vastagbélgyulladásból és Crohn-betegségből álló gyulladásos bélbetegségek (IBD) a gyomor-bél traktus idiopátiás gyulladásos rendellenességei. Epidemiológiai vizsgálatok azt mutatják, hogy Észak-Amerikában több mint 1,2 millió, Európában pedig 2 millió ember szenvedett IBD-ben (1–4), Észak-Amerikában, Óceániában és Európában a prevalencia meghaladja a 0,3% -ot. Ezen túlmenően az IBD előfordulása nemcsak a fejlett országokban, hanem az újonnan iparosodott afrikai, ázsiai és dél-amerikai országokban is növekszik (5). Bár az IBD pontos etiológiája továbbra sem tisztázott, úgy gondolják, hogy azok a bélben lévő kommensális mikroflóra iránti rendellenes nyálkahártya immunválasz eredményeként, a fogékony genotípusokkal kombinálva (6). A genetikai tényezők mellett az étkezési szokások is társulnak az IBD kialakulásához.

A pektin a komplex poliszacharidok családjába tartozik, és a szárazföldi növények középső lamellájának fő alkotóeleme. A pektin főként a-1,4-kapcsolt-D-galakturonsavmaradékok (fő lánc) lineáris homopolimerjéből áll, amelyet részben metil- és acetilcsoportokkal észtereznek. A pektin metilészterezésének (DM) mértéke növényfajonként eltérő, és befolyásolja a vakbél fermentációját, az SCFA termelést és a gyulladáscsökkentő aktivitást (17, 20). Ezenkívül a pektin fő lánca kovalensen kapcsolódik a ramnogalakturonánhoz (RG) -I és az RG-II-hez (21), amelyek mindkettő felépíti az oldallánc régiókat a pektinmolekulában. Az RG-I főként semleges cukorláncokból áll, beleértve az arabinánt, a galaktánt és az arabinogalaktánt, míg az RG-II galaktózból, arabinózból, ramnózból, apiózból, acersavból, 3-dezoxi-lixo-2-heptulózársavból és 3-dezoxi- manno-2-oktulozonsav. Bár a pektin oldallánc-tartalma növényfajtánként is változik (22), nincs egyértelmű bizonyíték az oldallánc-tartalom védőhatására önmagában gyomor-bél gyulladás ellen.

Korábbi tanulmányunk kimutatta, hogy a pektin elnyomta a gyulladásos citokintermelést Peyer tapasz CD11c + sejtjeiben és csillapította a szisztémás gyulladást egerekben (16). Ezenkívül a gyulladáscsökkentő hatáshoz a pektin semleges cukor oldallánca szükséges. Ennek megfelelően feltételeztük, hogy a pektin oldallánca a vastagbélgyulladás elleni védőhatását fejti ki a vastagbél SCFA termelésének modulálásával és/vagy a bél gazdasejtjeivel való közvetlen interakcióval. Jelen tanulmányban megvizsgáltuk a pektin oldalláncok szerepét egy kísérleti vastagbélgyulladás egérmodelljében magas és alacsony oldallánc tartalmú étrendi pektinek felhasználásával, és feltártuk annak colitis-ellenes hatásának lehetséges mechanizmusát.

Anyagok és metódusok

Reagensek

A citrus-pektint (citrom- és mészhéjból származik) és a narancs-pektint a CP Kelco ApS (Lille Skensved, Dánia) kérte. Dextrán-szulfát-nátrium (DSS) és 2,4,6-trinitrobenzoesav-szulfonsav (TNBS), amelyeket a Wako Pure Chemical Industries-től (Osaka, Japán) szereztünk be. Lipopoliszacharid (LPS, Escherichia coli O111: B4) és Pam3CSK4-et Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA), illetve a Tocris Bioscience-től (Bristol, Egyesült Királyság) vásároltuk.

A hím C57BL/6 egereket a CLEA Japan-tól (Shizuoka, Japán) vásároltuk, és egyedi ketrecekben helyeztük el, szabad hozzáféréssel a vízhez és az élelemhez. Az egereket vagy AIN-93G diétával (pektinmentes kontroll), vagy módosított AIN-93G étrendet etették 5% citrus-pektinnel vagy narancssárga pektinnel kiegészítve a kísérletek teljes időtartama alatt, és állandó hőmérsékleten, 23 ° C ± 1 ° C, napi 12 órás fény/12 órás sötét ciklus mellett. Minden kísérletet 7–8 hetes egereken végeztünk.

TNBS által kiváltott vastagbélgyulladás

A TNBS vastagbélgyulladást Wirtz és munkatársai által leírt módszerrel indukálták. (23) kisebb módosításokkal. 7 és 8 nappal a TNBS szenzibilizálása előtt az egereket pektinnel kiegészített étrenden kezdtük meg, majd 1% TNBS-szel érzékenyítettük aceton és olívaolaj keverékében a hátsó vállon. Tizennégy nappal a pektin-etetés megkezdése után az egereket enyhén érzéstelenítettük izoflurán (Wako) inhalációjával, majd 100 μl 2,5% TNBS 50% -os etanolban oldott intrarektális beadásával, 1 ml-es fecskendővel ellátott 3,5-Fr katéterrel. A katéter hegyét 4 cm-rel az anális széléhez proximálisan illesztették be, és az egereket 90 másodpercig fejjel lefelé tartották intrarektális injekció után, hogy biztosítsák a TNBS oldat eloszlását a vastagbél lumenén belül. A testtömeget és az ételbevitelt naponta ellenőrizték. A vastagbélt és a vakbélt a TNBS injekció után a 2. vagy a 3. napon gyűjtöttük össze további elemzés céljából.

Hisztopatológia

A vastagbélmintákat 10% semleges pufferelt formalinban rögzítettük 24 órán át. Rögzítés után a mintákat paraffinba ágyazottuk, 4 μm-es szakaszokra vágtuk, és hematoxilinnal és eozinnal festettük. A vastagbélgyulladás szövettani jeleit vak módon értékelték egy korábban jelentett pontozási rendszer (24) alkalmazásával, gyulladásos sejtek beszűrődése és szövetkárosodás alapján, az alábbiak szerint. Gyulladásos sejtek beszűrődési pontozása: 0 = alkalmi gyulladásos sejtek jelenléte a lamina propriában; 1 = megnövekedett gyulladásos sejtek száma a lamina propriában; 2 = a submucosába nyúló gyulladásos sejtek összefolyása; és 3 = az infiltrátum transzmurális kiterjedése. A szövetkárosodás pontozása: 0 = nincs nyálkahártya károsodás; 1 = lymphoepithelialis elváltozások; 2 = felszíni nyálkahártya eróziója vagy fokális fekélye: és 3 = kiterjedt nyálkahártya károsodás és a bélfal mélyebb struktúráiba történő kiterjesztés.

Lamina Propria sejtek előállítása

A vastagbél lamina propria sejteket Couter és munkatársai által leírt módszerrel állítottuk elő. (25) kisebb módosításokkal. A vastagbélt a TNBS-fertőzés után 2 nappal gyűjtöttük össze, és hajlított csipesz segítségével megfordítottuk. A szövetet RPMI-1640 táptalajban (Nissui Pharmaceutical, Tokió, Japán) inkubáltuk, amely 5 mM EDTA-t, 33 μM ditiotreitolt (Wako), 1,6% szarvasmarha-magzati szérumot (FBS) és 100 egység/ml penicillin-sztreptomicint tartalmazott 15 percig 37 ° C-on. ° C keverés közben. Az inkubáció után a szövetet felaprítottuk, majd 0,8 mg/ml kollagenázt (Wako), 0,04 mg/ml DNáz I-t (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA), 1,2% FBS-t és 100 egység/ml-t tartalmazó RPMI-1640-ben inkubáltuk. penicillin-sztreptomicin 40 percig, 37 ° C-on, keverés közben egyetlen sejt szuszpenzió létrehozásához. A sejteket 3 ml 100% -os Percoll-ban (GE Healthcare, Little Chalfont, Anglia) szuszpendáltuk, majd 3 ml 40% -os Percoll-tal borítottuk. A percoll gradiens szétválasztását 800 x g-vel végzett centrifugálással 20 percig 4 ° C-on végeztük. A köztes réteg sejtjeit áramlási citometriának vetettük alá.

Áramlási citometria

A vastagbél lamina propria sejteket anti-CD16/32 antitesttel (2.4G2 klón, Tonbo Biosciences, San Diego, Kalifornia, USA) inkubáltuk az Fc receptorok blokkolására, majd fluoreszcein-izotiocianáttal konjugált anti-CD4 antitesttel (RM4-5, Biolegend, San Diego, Kalifornia, USA). Ezt követően a sejteket fixáltuk és valódi mag transzkripciós faktor pufferkészlettel (Biolegend) permeabilizáltuk, majd phikoeritrinnel (PE) konjugált anti-Foxp3 antitesttel (MF-14 klón, Biolegend), PE-konjugált anti-RORγt antitesttel (klón) festettük. B2D, eBioscience, San Diego, CA, USA) vagy Alexa fluor 647-konjugált anti-T-bet antitest (4B10 klón, Biolegend). Miután a sejteket 0,5% szarvasmarha-szérum albumint tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldattal mostuk, a fluoreszcencia intenzitást áramlási citometriával mértük (FACSCalibur; BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Az adatokat CellQuest szoftver (BD Biosciences) segítségével elemeztük.

Az SCFA-k mérése

A székletmintákat és a vakbéltartalmat a pektinnel kiegészített étrend megkezdése után 14, illetve 17 nappal gyűjtöttük össze. Mindegyik mintát (20 mg) 1:50 (w/v) arányban szuszpendáljuk MilliQ vízben, és cirkónium-gyöngyök alkalmazásával lebontjuk. 10 percig 10 000 × g sebességgel végzett centrifugálás után a felülúszóban lévő SCFA-kat YMC pack FA készlet (YMC, Kiotó, Japán) és nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) (PU-2089 Plus, JASCO, Tokió, Japán) alkalmazásával mértük. ). Az oszlopot 50 ° C-on tartjuk egy mozgó fázissal, amely acetonitril-metanol-víz (30:16:54 v/v/v, pH = 4–5 0,1 M sósavval beállítva) elegyet tartalmaz, 0,5 ml/perc áramlási sebességgel. perc. A jelölt SCFA-kat 400 nm hullámhosszon detektáltuk UV/látható HPLC detektorral (UV-2075 Plus, JASCO).

Antibiotikum kezelés

Az antibiotikumokat Chinen és munkatársai által leírt módszer szerint adták. (26) kisebb módosításokkal. Röviden, az egereknek orálisan meropenem-trihidrátot (50 mg/kg/nap, Wako) és vankomicin-hidrokloridot (50 mg/kg/nap, Wako) adtak be 3 nappal a pektin etetés előtt, majd az antibiotikumokat 19 napig folytatták.

Enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA)

A gyulladásos citokinek koncentrációját a vastagbélszövetben kereskedelmi ELISA kit segítségével mértük a gyártó utasításainak megfelelően. Az egér IL-1β, IL-6, interferon (IFN) - γ és tumor nekrózis faktor (TNF) -α szintjét Duoset ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) alkalmazásával határoztuk meg, és IL-17A szintet IL-vel mértünk. -17A ELISA készlet (Biolegend). Az abszorbanciát 450 nm-en mértük mikrotányér-leolvasóval (Tecan, Mannedorf, Svájc). A vastagbél-citokinek koncentrációját a teljes bélfehérje-koncentrációra normalizáltuk, amelyet egy bicinchonininsav-vizsgálati készlet (ThermoFisher tudományos, Waltham, MA, USA) határozott meg.

DSS által kiváltott vastagbélgyulladás

Az egereket 10 napig pektinnel kiegészített étrenddel etették, mielőtt 8 napig 3% DSS-t kaptak ivóvízben. A testtömeget, a betegség aktivitási indexét (DAI) és a táplálékfelvételt naponta ellenőrizték. A DAI-t a korábban közölt kritériumok (27) összegzésével számítottuk ki a következők alapján: súlycsökkenés százaléka (0 = nincs; 1 = 1–5%; 2 = 5–10%; 3 = 10–20%; 4 = > 20%); ürülékvérzés (0 = nincs vérzés; 1 = néhány vérárnyalatú széklet; 2 = néhány vérzés; 3 = durva vérzés; 4 = az egész vastagbelet kitöltő vér); és a széklet konzisztenciája (0 = normál széklet; 1 = kissé laza széklet; 2 = laza széklet; 3 = vizes széklet; 4 = súlyos hasmenés). A vastagbélmintákat 8 nappal a DSS beadása után gyűjtöttük további elemzés céljából.

A pektin enzimatikus emésztése

A pektin oldalláncából származó poliszacharidokat a korábban leírt módon állítottuk elő (16). Röviden, ecetsav pufferben oldott 1 mg/ml pektin alikvot részeit összekevertük 10 μl pektináz oldattal (Pectinex ultra SPL; Sigma-Aldrich) és 24 órán át 50 ° C-on inkubáltuk. Ezt követően a reakcióelegyet ionmentesített vízzel 3 napig dializáltuk Spectra/Por dialízis membránok alkalmazásával (molekulatömeg-határérték, 6000–8000 Da; Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, Kalifornia, USA) és liofilizáltuk. A pektin teljes lebomlását méretkizárásos kromatográfiával igazoltuk.

Sejtkultúra

Az RAW264.7 egér makrofág sejtvonalat az American Type Culture Collection-től (Manassas, VA, USA) szereztük be, és Dulbecco módosított Eagle táptalajában (Nissui) tenyésztettük 10% FBS-sel és 100 egység/ml penicillin-sztreptomicinnel kiegészítve 37 ° C-on 37 ° C-on. 5% CO2. A RAW264.7 sejteket 3,0 × 105 sejt/ml sűrűséggel oltottuk 96 lyukú tenyésztőlemezekre, és 24 órán át 250 μg/ml pektinnel vagy 50 μg/ml oldalláncból származó poliszacharidokkal inkubáltuk. Pektinkezelés után a sejteket 1 μg/ml LPS-sel vagy Pam3CSK4-gyel stimuláltuk, és a felülúszókat a stimulálás után 24 órával összegyűjtöttük az IL-6 koncentráció ELISA-val történő mérésére a fent leírtak szerint.

Statisztika

Valamennyi eredményt átlagként ± az átlag standard hibájaként fejezzük ki. Az adatokat egyirányú varianciaanalízissel elemeztük, amelyet Tukey – Kramer teszt vagy Dunnett teszt követett. Az átlagok közötti különbségeket jelentősnek tekintették a P ** P + A RORγt + sejtek (Th17) szignifikánsan csökkentek a pektinnel táplált egerekben a kontroll egerekhez képest; azonban nem volt szignifikáns különbség a citrusfélék és a narancssárga pektin között (2A. ábra), ami arra utal, hogy a narancssárga pektin TNBS-vastagbélgyulladás elleni védőhatása nem tulajdonítható a Th17-differenciáció szuppressziójának. Érdekes módon a CD4 + T-bet + (Th1) sejtek gyakorisága szignifikánsan csak a narancssárga pektinnel táplált egerekben nőtt szignifikánsan (2B. Ábra). A Th17-gyel és Th1-gyel ellentétben a szabályozó T-sejtek (Treg), amelyek a Foxp3 expressziójával határozhatók meg, képesek elnyomni a Th17 és Th1 sejtek aktivációját IL-10 termelése révén, és transzformálni a növekedési faktor-β-t egér colitisben. modellek (29). Ennek megfelelően megvizsgáltuk, hogy a narancssárga pektin fokozza-e a vastagbél Treg differenciálódását. A vastagbél CD4 + Foxp3 + sejtek (Treg) gyakoriságát nem változtattuk narancs vagy citrus pektinnel történő etetéssel (2C. Ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a pektin etetés hatással volt a vastagbél Th1 sejtjeinek differenciálódására ezekben az egerekben.

Összegzésként elmondhatjuk, hogy jelenlegi tanulmányunk azt sugallja, hogy a pektin legalább részben oldalláncán keresztül gyengíti a vastagbélgyulladást. A vastagbélgyulladás elleni védekezésben a pektin jól bevált prebiotikus hatásával együtt (14, 15) azt javasoljuk, hogy a pektin kétféle módon mutassa ki gyulladáscsökkentő hatását: mikrobiotától és mikrobiotától függetlenül. Ezek az eredmények rávilágítanak arra az új mechanizmusra, amely révén a pektin véd a vastagbélgyulladás ellen, és arra utalnak, hogy a pektin ígéretes profilaxis lehet az IBD elleni küzdelemben. További elemzésre lesz szükség a vastagbélgyulladás elleni védelemhez szükséges semleges cukor oldallánc részletes felépítésének tisztázásához.

Adatelérhetőségi nyilatkozat

A tanulmányhoz létrehozott összes adatkészlet a cikkben/Kiegészítő anyag található.

Etikai nyilatkozat

Az állatkísérlet kísérleti tervét a Gifu Egyetem Állatkutatási Bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta, és az állatok gondozása és felhasználása teljes mértékben megfelelt a Gifu Egyetem intézményi irányelveinek.

Szerző közreműködései

KI, TY és KK megtervezte a tanulmányt és megírta az írást. A KI elvégezte az összes kísérletet. A TM elvégezte a DSS-colitis kísérleteket. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a cikket.

Finanszírozás

Ezt a kutatást a Japán Tudománytámogató Társaság segélyekkel (# 16K21075 és # 19K05879 a KK-nak) támogatta.

Összeférhetetlenség

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást bármilyen kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolat hiányában végezték, amely potenciális összeférhetetlenségként értelmezhető.

Köszönetnyilvánítás

Ezúton szeretnénk köszönetet mondani a dán CP Kelco ApS-nek a pektin biztosításáért. Köszönetet mondunk Kayoko Takanónak és Hayato Iritaninak a sejttenyészet kiemelkedő technikai támogatásáért és Michelle Kahmeyer-Gabbe Ph.D. az Edanz Grouptól a kézirat vázlatának szerkesztéséért.

Kiegészítő anyag

1. kiegészítő ábra. A pektin szerkezetének sematikus ábrázolása citrusfélékben és narancsban.

2. kiegészítő ábra. A pektin etetés hatása három bél rövid láncú zsírsav termelésére az antibiotikumokkal (Abx) kezelt egerekben. A székletmintákat a pektinnel való etetés után 14 nappal gyűjtöttük össze és használtuk a (A) ecetsav, (B) propionsav, és (C) vajsav. Az értékeket átlagként adjuk meg ± az átlag standard hibája (n = 5).

3. kiegészítő ábra. Az antibiotikus (Abx) kezelés hatása a baktériumok 16S rRNS genomi kópiaszámára a székletben. A DNS-t extraháltuk a pektinnel való táplálás után 14 nappal gyűjtött székletmintákból, és a 16S rRNS gént kvantitatív PCR-rel meghatároztuk bakteriális univerzális primerekkel. Az értékek átlagként ± SEM (n = 5). a – c. Azok az értékek, amelyek nem osztanak közös betűt, jelentősen eltérnek egymástól (o Kulcsszavak: vastagbélgyulladás, IL-6, gyulladás, makrofág, pektin

Idézet: Ishisono K, Mano T, Yabe T és Kitaguchi K (2019) Étrendi rost-pektin javítja a kísérleti vastagbélgyulladást semleges cukoroldali láncfüggő módon. Elülső. Immunol. 10: 2979. doi: 10.3389/fimmu.2019.02979

Beérkezett: 2019. szeptember 01 .; Elfogadva: 2019. december 4 .;
Publikálva: 2019. december 19.

Reinaldo B. Oria, a Ceara Szövetségi Egyetem, Brazília

Raquel Hontecillas, Virginia Tech, Egyesült Államok
Yuji Naito, Kiotói prefektúra Orvostudományi Egyetem, Japán