A hipotalamusz miR-219 szabályozza az egyes anyagcsere-különbségeket az étrend okozta súlyciklusra adott válaszként

Mariana Schroeder

1 Neurobiológiai Tanszék, Weizmann Tudományos Intézet, Rehovot, 76100, Izrael

2 Stressz-Neurobiológiai és Neurogenetikai Tanszék, Max-Planck Pszichiátriai Intézet, München, 80804, Németország

Yonat Drori

1 Neurobiológiai Tanszék, Weizmann Tudományos Intézet, Rehovot, 76100, Izrael

2 Stressz-Neurobiológiai és Neurogenetikai Tanszék, Max-Planck Pszichiátriai Intézet, München, 80804, Németország

Yair J. Ben-Efraim

1 Neurobiológiai Tanszék, Weizmann Tudományos Intézet, Rehovot, 76100, Izrael

2 Stressz-Neurobiológiai és Neurogenetikai Tanszék, Max-Planck Pszichiátriai Intézet, München, 80804, Németország

Alon Chen

1 Neurobiológiai Tanszék, Weizmann Tudományos Intézet, Rehovot, 76100, Izrael

2 Stressz-Neurobiológiai és Neurogenetikai Tanszék, Max-Planck Pszichiátriai Intézet, München, 80804, Németország

Társított adatok

Absztrakt

Az alacsony kalóriatartalmú étrend fogyasztása a fogyás leggyakoribb megközelítése. Míg eleinte általában hatékony, gyakran utána következik a visszaesés, amikor az étrend előtti súlyt visszanyerik és gyakran meghaladják. Az ismételt súlycsökkenés/visszanyerés ezen mintázatát súlyciklusnak nevezik, és az ebből eredő anyagcsere-válasz egyénenként nagyon eltérő.

Célkitűzés

Megpróbáltuk kezelni a hím egerek súlygyakorlására adott válaszok közötti különbségek kérdését.

Mód

A felnőtt vad típusú egereket először magas/alacsony zsírtartalmú táplálék ismételt ciklusainak tettük ki. Ezután lentivirális megközelítés alkalmazásával leütöttük vagy túl expresszáltuk a miR-219-et egy további egér kohorsz ventromediális hipotalamuszában (VMH), és teljes metabolikus értékelést végeztünk.

Eredmények

A vad típusú hímek súlykerékpározásnak való kitettsége azt eredményezte, hogy a kohorsz a rezisztens versus metabolikus szindrómára hajlamos (MS) állatok alcsoportjaira oszlott, amelyek metabolikus profiljuk és hipotalamuszuk miR-219 szintjeiben különböztek egymástól. A miR-219 lentivirális leütése a VMH-ban a metabolikus szindróma súlyosbodásához vezetett. Ezzel szemben a miR-219 túlzott expressziója a metabolikus szindróma fenotípusának mérséklését eredményezte.

Következtetések

Eredményeink azt sugallják, hogy a miR-219 szerepet játszik a metabolikus fenotípus közvetítésében, amely az ismételt súlyciklus eredményeként jön létre.

1. Bemutatkozás

A hipotalamusz és különösen a medio-bazális hipotalamusz az a kulcsfontosságú agyi régió, amely integrálja a táplálkozási állapotról és a változó energiaigényről információt továbbító perifériás és központi jeleket, fenntartva ezzel az állandó energiaháztartást. A ventromediális hipotalamusz (VMH) neuronokat tartalmaz, amelyek közvetlenül reagálnak a glükózra, és efferens szimpatikus idegrendszeri rostok révén vesznek részt a máj glükóz-anyagcseréjében, amelyek a splanchnicus idegén keresztül jutnak el a májba [7]. A metabolikus egyensúly mechanizmusának új, komplexitási szintje jelent meg az újonnan megállapított hipotalamusz kis nem kódoló RNS-ek (miRNS-ek) részvételével az energia homeosztázis szabályozásában, beleértve az anyagcserével kapcsolatos folyamatokat, például az inzulin szekréciót, a glükóz és a lipid anyagcserét (áttekintve [8]), valamint a magas zsírtartalmú étrend (HFD) táplálására vagy kalória-korlátozásra vonatkozó metabolikus válasz [9].

Jelen vizsgálatunkban a hipotalamusz miRNS-lábnyomával párhuzamosan ismételt metabolikus kihívásnak alávetett egerek metabolikus profiljának különbségeit vizsgáltuk azzal a céllal, hogy feltárjuk azokat a központi molekuláris mechanizmusokat, amelyek felelősek a WC-re adott metabolikus válasz egyéni különbségeiért. Beszámoltunk arról, hogy az ismételt WC szelektív módon súlygyarapodást, glükóz-intoleranciát, inzulinrezisztenciát és hiperadipozitást váltott ki az egerek egy részében a krónikus HFD-expozícióhoz hasonló módon, de nem volt tartós hatása a genetikailag azonos állatok további alcsoportjára . Eredményeink azt sugallják, hogy a VMH-ban található miR-219 központi szerepet játszik az energia homeosztázis közvetítésében. Felfedeztük, hogy a miR-219 leütésével a VMH-ban a metabolikus betegségre való hajlam jelentősen megnőtt. Ezzel szemben, a túlzott expresszióval, a VHM-ben található miR-219 mérsékelten védte az állatokat ettől a fenotípustól. Ezért feltártunk egy potenciális miRNS által közvetített hipotalamusz mechanizmust, amely részt vesz a WC kezelésében, amely érzékenységet vagy ellenállást eredményez a metabolikus betegségekkel szemben.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatok

A hím C57BL/6J egereket (IMSR_JAX: 000664) és a vemhes nőstény ICR egereket és kölykeiket (IMSR_JAX: 009122) kórokozótól mentes hőmérséklet-szabályozott (22 ± 1 ° C) egérben tartottuk fordított 12 órás világos/sötét ciklus a Weizmann Tudományos Intézetben, az intézményi irányelvek szerint. Az ételt és a vizet ad libitum adták.

2.2. Súlykerékpáros modell

Az ismétlődő súlygyarapodás és -vesztés modelljének megállapítása érdekében a 9 hetes C57BL/6J hím egereket (n = 60) ad libitum HFD-vel (a kalória 60% -a) etették (D12492 Research Diets Inc., New Brunswick, NJ) (USA) 3 hétig, majd 2 hétig ad libitum rendszeres chow-étrenddel (Harlan Biotech Israel Ltd, Rehovot, Izrael). Ezt az eljárást 3 egymást követő alkalommal (összesen 15 hét) megismételtük. Az egereket hetente kétszer lemértük. Ezt a ciklusos időszakot egy előzetes kísérlet nyomán választották, amely megmutatta, hogy a súlygyarapodás változása 3 hét HFD és 2 hét rendszeres chow után viszonylag mérsékelt. A WC-protokollt követően az egerek metabolikus fenotípusát értékeltük az egész test glükóz homeosztázisának, az indirekt kalorimetria és a testösszetétel meghatározásával.

2.3. Glükóz és inzulin tolerancia tesztek

Glükózt (2 g/testtömeg-kg) injektáltunk i.p. 6,5 órás éhezést követve. Az injekció beadása után 0, 15, 30, 60, 90 és 120 perccel a farokvénából nyert teljes vénás vért automatikus glükométerrel (Roche) mértük a glükózhoz. Az inzulin tolerancia teszthez az egereket 4–5 órás éhgyomri után inzulinnal (0,75 vagy 1 egység/testtömeg-kg) injektálták. A vércukorszintet 0, 15, 30, 60 és 90 perccel mértük az inzulininjekció után.

2.4. Test felépítés

A testösszetételt az EchoMRI-100TM (Echo Medical Systems, Houston, TX, USA) alkalmazásával értékeltük.

2.5. Anyagcsere vizsgálatok

A közvetett kalorimetriát, az élelmiszer- és vízbevitelt, valamint a mozgásszervi aktivitást a LabMaster rendszer (TSE-Systems, Bad Homburg, Németország) segítségével mértük. A LabMaster eszköz etetés és ivásérzékelők kombinációjából áll az automatizált online méréshez. A kalorimetriás rendszer egy nyílt áramkörű rendszer, amely meghatározza az O2-fogyasztást, a CO2-termelést és a légzéscsere arányát. A fénysugár alapú aktivitás-ellenőrző rendszer minden ketrecben észleli és rögzíti az ambuláns mozgásokat, beleértve a nevelést és a mászást is. Az összes paramétert folyamatosan és egyidejűleg mérjük. Az adatokat 24 órás adaptációs periódus után gyűjtöttük, akklimatizált, egyetlen házban.

2.6. Hipotalamusz mRNS extrakció és miRNS expressziós profil

A WC-kísérlet végén friss hipalamikat gyűjtöttünk össze és szárazjégre fagyasztva csattantunk. A teljes mRNS-t miRNeasy mini kit (QIAGEN, Hilden, Németország) alkalmazásával izoláltuk, és az nCounter miRNS expressziós vizsgálattal (Nanostring Technologies, Seattle, WA) kereskedelemben profilizáltuk. A nyers adatokat normalizáltuk a pozitív kontrollszámra és a 100 leggazdagabban expresszált miRNS-re, és az nCounter Data Analysis segítségével korrigáltuk a háttérkorrekciókat.

2.7. 3 'UTR-ek klónozása Psicheck2 luciferáz expressziós plazmidba

A Cnrip1 3'UTR szekvenciáját PCR-rel amplifikáltuk egér genomi DNS-ből a következő primerek alkalmazásával: 5'-ATGATTCCTTCTGATGTTGC-3 'és 5'-ATTACCATTCCATACACGGT-3'. A 3'UTR fragmenst ezután a gyártó útmutatásai szerint pGem-T könnyű vektorba (Promega, Madison, WI) ligáltuk, majd 15-öt további szubklónoztunk egyetlen NotI helyre a luciferáz 3 'végén a Psicheck2 riporter plazmidban (Promega, Madison, WI). A klónozási orientációt diagnosztikai vágásokkal és szekvenálással igazoltuk. A Cnrip1 3′UTR mutált formáját, amelyből hiányzik a miR-219 konzervált mag-illesztési szekvencia mind a 6 bázisa, 2 részlegesen komplementer PCR-fragmens előállításával hoztuk létre, ligálási PCR-ként templátként használtuk (primerek: 5′-CTGATGTTGCAACTCCAGAAA-3 ′ és 5 ′ -CAGTTTCTGGAGTTGCAACAT-3 ', mindegyiket a fent említett láncindítók egyikével együtt használtuk). A Cc2d1a és Rbms1 3'UTR szekvenciáit a fentiek szerint szubklónoztuk a következő primerek alkalmazásával - Cc2d1a 3′UTR: 5′-CCCATCCTGGACTACAGGC-3 ′ és 5′-GCCTTGGCTGTTCATTCTGT-3 ′; A Cc2d1a mutáns 3 ′ UTR: 5′-CAACTGTCCGCTGCTTGTCTGTT-3 ′ és 5′-ACAGACAAGCAGCGGACAGTTGG-3 ′; Rbms1 3′UTR: 5′-CTGTGAGATGTACCGAAGGG-3 ’és 5′-TGTTAGTGTACAGCCTTATAAACA-3’; Rbms1 mutált 3′UTR: 5′-GAAGGCTGATGGATTTTTC-3 ′ és 5′-AAAATCCATCAGCCTTCAC-3 ′.

2.8. Transzfekciók és luciferáz vizsgálat

A Huh7 sejteket polilizinnel bevont 48 lyukú lemezeken növesztettük 70–85% -os összefolyásig, és a jetPEI (Polyplus-transfection SA, Illkirch, Franciaország) alkalmazásával transzfektáltuk a gyártó utasításai szerint a következő plazmidokkal: 5 ng Psicheck2 -3 ′ UTR plazmid és 215 ng fokozott zöld fluoreszcens fehérje (EGFP) túlexpresszáló vektor akár miR-219, akár egy összekevert miR EGFP plazmid esetében. A transzfekció után negyvennyolc órával a sejteket lizáltuk, és a luciferáz riporter aktivitását meghatároztuk a korábban leírtak szerint [10]. A renilla luciferáz értékeket a kontroll luciferáz szintekkel normalizáltuk (ugyanattól a vektortól írtuk át, de a tesztelt 3 'UTR nem befolyásolta), és állapotonként 8 kút ismétlésnél átlagoltuk.

2.9. A miR-219 lentivírusok tervezése, felépítése és validálása

2.10. Sztereotaktikus koponyaűri injekciók

A lentivírusokat számítógéppel vezérelt sztereotaxiás eszköz és motorizált nanoinjektor segítségével (Angle Two Stereotaxic Instrument, myNeurolab, Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) injektáltuk. Az egereket 1,5% izoflurán alkalmazásával altattuk, és 1 μl lentivirális készítményt juttattunk mindegyik VMH-hoz egy motoros nanoinjektoros rendszerhez csatlakoztatott Hamilton-fecskendő segítségével, 0,15 μl/perc sebességgel (koordináták a bregmához viszonyítva: AP = -1,46 mm, ML = ± 0,3 mm, DV = −5,5 mm). Az egereket az injekció beadása után 1 héttel a WC protokollnak vetettük alá.

2.11. In situ hibridizáció a miR-219 kimutatásához

A felnőtt C57BL/6 agy parafin szakaszait (-1,58 mm-re a bregmától) egy éjszakán át DIG-jelzett zárolt nukleinsav (LNA) próbákkal (Exiqon, Vedbaek, Dánia) hibridizáltuk 55 ° C-on (U6 és miR-219) és 60 ° C-on. C (miR-124), a [13] -ben korábban leírtak szerint és nitrokék-tetrazólium-klorid/5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát (NBT/BCIP) közeggel kifejlesztve.

2.12. Valós idejű PCR elemzés

A következő gének mennyiségi expresszióját megszereztük és elemeztük egy 1. lépésben termociklerrel (Applied Biosystems, Waltham, MA), kifejezetten nekik tervezett primerek felhasználásával.

MiR-219-5p: 5′- TGATTGTCCAAACGCAATTCT - 3 ′.

Cnrip1: 5′- TAAAGAGCCTGACGGGGAGA - 3 ′ és 5′- CCACACTGTCTCGAAGGTCC - 3 ′

CC2d1a: 5′- ACCCTCTACCAGTCTGCACT - 3 ′ és 5′- AGCAGGTTTTCCAGCGTCTT - 3 ′

Htr1a: 5′- GTGCACCATCAGCAAGGACC - 3 ′ és 5′- GCGCCGAAAGTGGAGTAGAT - 3 ′

Rbms1: 5′- TACGTGATTCCAGTGGTGCC - 3 ′ és 5′- ACTCCTGGTGGGGTCTTGAT - 3 ′

Szarkolipin: 5′- TGTGCCCCTGCTCCTCTTC - 3 ′ és 5′- TGATTGCACACCAAGGCTTG - 3 ′

Az RNS mintákat a miScript Reverse transzkripciós készlet és a SYBRGreen PCR készlet (QIAGEN, Hilden, Németország) alkalmazásával értékeltük a gyártó útmutatásai szerint. Belső kontrollként U6 snRNS-t használtunk.

2.13. Western blot elemzés

A WC-állatok külön készletéből származó hipotalamint RIPA pufferben homogenizáltuk és jégen inkubáltuk 10 percig. A homogenátumot 15 percig centrifugáltuk, és a felülúszót új csőbe helyeztük, a mintákat mintapufferrel adtuk hozzá és 5 percig forraltuk. A mintákat 12% -os akrilamid gél SDS PAGE-n szétválasztottuk és nitrocellulóz membránra helyeztük. 10% tejjel történő blokkolást követően az αCnrip1 (nyúl poliklonális anti-CNRIP1, AB_10709018), αCc2d1a (nyúl monoklonális anti-Cc2d1a ab191472, abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) és αActin (egér monoklonális anti-aktin, Cell Signlying Technology, ) éjszakán át 4 ° C-on adtuk. Szekunder antitesteket adtunk szobahőmérsékleten 2 órán át (anti-nyúl HRP és anti-egér HRP, Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Végül ECL-t adtak a membránhoz, amelyet filmnek tettek ki.

2.14. Statisztikai megközelítés

Az egyes WC-állatok elosztását a rezisztens, mérsékelt és MS-re hajlamos alcsoportokba hierarchikus klaszteranalízissel, Ward-módszerrel és négyzet alakú euklideszi távolsággal határoztuk meg. A prediktorok erősségét kétlépcsős csoportosítással határoztuk meg. A különböző MS paramétereket paraméteres tesztek, T-tesztek, ANOVA és adott esetben ismételt ANOVA mérések segítségével elemeztük. A WC, KD és OE kísérletek összehasonlításához az injektált kezelési csoportok Z-értékeit (miR-219 KD/OE) először normalizáltuk az egyes kísérleteken belüli keveredési kontrollokhoz, majd az egyes pontszámokat megszoroztuk a prediktorok pontszámával. a WC-kísérlet. A statisztikai erő megszerzéséhez és a miRNS-manipulációk globális pontszámukra gyakorolt hatásának megjelenítéséhez a keverési csoportokat ezután két új alcsoportra osztották. A pozitív Z pontszámúakat MS-re hajlamosnak, a negatív pontszámúakat pedig rezisztensnek határoztuk meg. A miR-219 KD és a miR-219 OE globális pontszámokat és az átlagos nyers adatokat ezután összehasonlítottuk a különböző keveredési alcsoportokkal, hogy megbecsüljük pozíciójukat a válaszspektrumban. Az összes adatot elemeztük az IBM SPSS 20. verziójával és a Graphpad Prism5 alkalmazásával.

3. Eredmények

4. Megbeszélés

A MiRNA-k megjelenése az energia homeosztázis fontos szabályozói között, ideértve az inzulin szekréciót, a glükóz és a lipid anyagcserét [8], számos közelmúltbeli tanulmányban kimutatták. Néhány példa a miR-200a, miR-200b és miR-429, amelyek a leptinhiányos ob/ob egerek hipotalamuszában felfelé voltak szabályozva, és a leptin kezelésre válaszul lefelé szabályozva voltak [26]. Ebben a vizsgálatban a miR-200a hipotalamusi elnémítása növelte a leptin receptor és az inzulinreceptor 2 szubsztrátjának expressziós szintjét, csökkentette az egerek testtömeg-növekedését és visszaállította a máj inzulinra való reagálását. Egy további tanulmány kimutatta a miR-383, miR-384-3p és miR-488 szabályozását ob/ob egerek hipotalamuszában [27]. Végül 10 specifikus miRNS-t utánzó oligonukleotidok infúziója várhatóan a PI3K-Akt-mTOR útvonalat célozza meg a hipotalamusz gyengített adipozitásának íves magjáig a Dicer KO-ban [28], ami tovább utal a miRNS-ekre az energiaegyensúly szabályozásában.

Második célpontunk, a Cc2d1a (más néven Freud-1) a szerotonin receptor (Htr) 1a transzkripciós represszora, a Htr1a gén 5′-represszor eleméhez (FRE) kötődve [38]. A CC2D1a fehérje in vivo a Htr1a receptorral együtt lokalizálódik, ami arra utal, hogy fontos a receptor szabályozásában [39]. Tekintettel a szerotonerg neurotranszmissziónak az etetési viselkedésre gyakorolt mély hatásaira, amelyet elsősorban a Htr1a és Htr2c receptorok közvetítenek [40], [41], [42], a Cc2d1a által történő Htr1a szuppresszió szabályozhatja a táplálkozási magatartást a WC válaszaként. A Htr1a a VMH-ban expresszálódik a hipotalamusz egyéb területei között [40], és ezért a miR-219 valószínűleg közvetett célpontja a Cc2d1a-szabályozás révén. Végül, a szerotonin és a kannabinoid rendszerek közötti potenciális kölcsönhatás a Htr1a és CB1 receptorok [43], [44] révén további komplexitásréteget adhat a WC-re adott metabolikus válasz szabályozásában a miR fel/le szabályozásának eredményeként. -219 a VMH-ban.

5. Következtetések

Összességében meghatároztunk egy speciális hipotalamusz mechanizmust, amelyen keresztül az miR-219 közvetíti a WC-re adott metabolikus választ. Úgy tűnik, hogy ennek a miRNS-nek a VMH-ban bekövetkező endogén variációja határozza meg a genetikailag azonos egyének körében bekövetkező metabolikus kihívásra adott válaszban megfigyelhető nagy változékonyságot. Ez a WC-vel való sikeres vagy hibás megbirkózást eredményezi, ami az SM kialakulásához vezet. A Cnrip1 és Cc2d1a célzásával miR-219-et javasolunk, mint mechanikus utat, amely a WC-re adott egyedi válasz mögött áll.