A hosszú távú bezafibrát kezelés javítja az mtDNS mutátor egér bőr- és lépfenotípusait

Sejtbiológiai és anatómiai tagozat, Miami Egyetem Miller Orvostudományi Kar, Miami, Florida, Amerikai Egyesült Államok

A Miami Egyetem Miller Orvostudományi Egyetem Neurológiai Tanszéke, Miami, Florida, Amerikai Egyesült Államok

A Wisconsini Egyetem genetikai tanszéke, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

Sejtbiológiai és anatómiai osztály, Miami Egyetem Miller Orvostudományi Kar, Miami, Florida, Amerikai Egyesült Államok, Neurológiai Tanszék, Miami Egyetem Miller Orvostudományi Egyetem, Miami, Florida, Amerikai Egyesült Államok

Lloye M. Dillon,
Aline Hida,
Sofia Garcia,
Tomas A. Prolla,
Carlos T. Moraes

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Dillon LM, Hida A, Garcia S, Prolla TA, Moraes CT (2012) A hosszú távú bezafibrát kezelés javítja az mtDNS Mutator Mouse bőr- és lépfenotípusait. PLoS ONE 7 (9): e44335. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044335

Szerkesztő: Yidong Bai, a Texasi Egyetem Egészségügyi Tudományos Központja, San Antonio, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2012. május 28 .; Elfogadott: 2012. augusztus 1 .; Közzétett: 2012. szeptember 4

Finanszírozás: Ezt a munkát az Egyesült Államok Közegészségügyi Szolgálata (PHS) támogatta: AG036871, EY010804, NS079965; az Izomdisztrófia Egyesület és a floridai orvosbiológiai kutatási alapítvány. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Számos friss tanulmány összekapcsolta a mitokondriális diszfunkciót az öregedéssel és az öregedéssel összefüggő betegségekkel [1]. A mitokondriális DNS (mtDNS) mutátor egér a korai öregedés egérmodellje, amely támogatja ezt a kapcsolatot. Ennek az egérnek mutáns mtDNS-polimeráz γ (POLG) van, amelynek hiányzik az olvasási képessége [2], [3]. Kimutatták, hogy a mutátor egerek (amelyeket Mut egereknek neveznek) a korai öregedés számos jellemzőjét kifejlesztik, például korai hajhullás, vérszegénység, csontritkulás, szarkopénia, kardiomiopátia és csökkent élettartam [2], [3]. Ezek az öregedésszerű fenotípusok fokozott mtDNS mutációval és mitokondriális diszfunkcióval társultak [2], [3]. Nemrégiben kimutattuk, hogy a mitokondriális biogenezis és az izomfunkció növelése a peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor (PPAR) γ koaktivátor-1α (PGC-1α) transzgénikus túlzott expressziójával javította a Mut egerek vázizom- és szívfenotípusait [4].

A Mut egér mitokondriális diszfunkciójának kompenzálására 8 hónapig bezafibrát diétára (BD) helyeztük őket. Itt megmutatjuk, hogy a bezafibrát nem növelte a mitokondriális tartalom/funkció számos tesztelt markerét; azonban késleltette a hajhullást és drasztikusan javította a Mut egerek bőr- és lépfenotípusát. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a PPAR-k aktiválása jótékony hatással lehet bizonyos mitokondriális stressz alatt álló szövetekben.

Eredmények

A bezafibrát szisztémás hatásai a mutegérben

A mitokondriális funkció javítása érdekében az összes szövetben 2 hónapos hím Mut egereket helyeztünk el standard egér diétára, amely 0,5% bezafibrátot (BD) tartalmazott. Ezt az egércsoportot eddig MutBD-nek nevezik. Annak biztosítására, hogy a MutBD egerekben észlelt változások a bezafibrát miatt következtek be, 2 hónapos WT egereket is elhelyeztünk a BD-n (a továbbiakban WTBD néven). A BD-n lévő egereket azonos idős hím Mut és WT egerekkel hasonlítottuk össze, amelyeket standard egér-diétával (standard étrend, SD) tápláltunk. Ezeket az egereket MutSD-nek és WTSD-nek fogjuk nevezni. Az állatokat a megfelelő étrendjükkel etették 8 hónapig, majd 10 hónapos korukban elemezték, hogy feltárják a hosszú távú bezafibrát adagolásának a fizikai fenotípusra, a szervek szerkezetére/működésére és a mitokondriális funkcióra gyakorolt hatásait a mitokondriális öregedés modelljében.

Korábban kimutatták, hogy a Mut egér testsúlya csökkent a WT egerekhez képest [2], [3]. Ezért havonta BD-n és SD-n követtük nyomon a testtömeg változását 2 hónapos kortól kezdve. A korábbi jelentésekhez hasonlóan azt találtuk, hogy a 3 hónappal idősebb MutSD egerek testtömege alacsonyabb volt a WT egerekhez képest (1A. Ábra). Megfigyeltük, hogy az összes csoportban az egerek testtömege hasonló volt 2 hónapos korban, de csak a WTSD egereknél tapasztalható a testtömeg folyamatos növekedése 4 és 11 hónapos kor között (1A. Ábra). Azt is megállapítottuk, hogy a MutBD és a WTBD egerek súlya kevesebb volt, mint a MutSD, illetve a WTSD egerek 3 hónapos korától kezdődően (1A. Ábra). Ez a testtömeg-különbség nem a MutBD egerek táplálékfelvételének csökkenése miatt következett be (nem látható). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a bezafibrát csökkentette a Mut és a WT egerek testsúlyát.

(A) A 2–14 hónapos egerek testsúlya (n = 11–26/csoport 2–11 hónapig; 2–6/csoport 12–14 hónapig). A WTSD és a MutSD egerek közötti testsúlykülönbség statisztikailag szignifikáns 3 és 14 hónap között, a WTSD és WTBD egerek között minden időpontban szignifikáns, a MutSD és a MutBD közötti különbség pedig 3 és 14 hónap között szignifikáns. A teljes (B) csont ásványi sűrűség (BMD), (C) csont ásványi anyag tartalom (BMC) (D), testfelület (cm 2), sovány tömeg (g), teljes testzsír (g) és százalék (%) mérése 10 hónapos egerek zsírja (n = 5–7/csoport). (E) Az egerek százalékos túlélése (n = 11-15/csoport). *, P 2. ábra. A Bezafibrate késleltette a hajhullást és helyreállította a Mut egerek bőrszerkezetét.

(A) 7 hónapos és 10 hónapos egerek képei, amelyek a kabát fenotípusát mutatják (n = 6/csoport). A négyzetek kiemelik a leírt kabát területét. (B) 10 hónapos egerek háti bőrrészei, amelyeken hematoxilin és eozin (H&E) festődött, a szerkezeti változások ábrázolására (fekete nyíl jelzi a MutSD egerek epidermiszrétegének törését), Verhoeff Van Geison (EVG) festése rugalmas szálakra fekete/sötétbarna (sárga nyíl) és Masson trichrom festése kék kollagént mutat (n = 2/csoport). (C) Western-blot, amely 10 hónapos egerek teljes Smad3- és glicerinalgehid-3-foszfát (GAPDH) fehérje szintjét mutatja a teljes bőrhomogenátumban, és a teljes Smad3 sávintenzitás GAPDH-ra normalizált mennyiségének meghatározása (n = 4/csoport). A hibasávok képviselik a SEM-et.

A bezafibrate hajhullásra és őszülésre gyakorolt hatásainak további jellemzése érdekében a háti és a ventrális bőrt 10 hónapos WTSD, MutBD és MutSD egerekből gyűjtöttük össze. A paraffinba ágyazott bőrrészeket hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük a strukturális változások meghatározása érdekében. Megfigyeltük, hogy a MutSD egerek háti bőrszakaszai vékonyabbak voltak, és hiányoztak azok a különálló rétegek, amelyek a WTSD egereknél voltak, míg a MutBD egerek bőrstruktúrája jobban hasonlított a WTSD egerekhez (2B. Ábra, H&E). Pontosabban, a MutSD egerek háti bőrszakaszai elsősorban a dermis/kötőszövetből álltak, és nem folytonos epidermiszrétegük volt (2B. Ábra, H&E). Ezenkívül a MutSD egerek bőrszekcióinak kisebb volt a szőrtüszője a WTSD és MutBD egerekhez képest (nem látható). Ezeknek az egereknek a ventrális bőrszakaszaiban nem figyeltek meg egyértelmű strukturális különbségeket, amelyek arra utalnak, hogy a háti bőr hajlamosabb lehet a mitokondriális DNS károsodására. (nem látható).

Mivel a kollagén és az elasztin rostok a bőr dermisz/kötőszöveti rétegének elsődleges funkcionális komponensei [12], azt akartuk megállapítani, hogy a bezafibrát hatással van-e ezen összetevők expressziójára. Az elasztin rostok és a kollagén kimutatásához a háti bőrrészeket Verhoeff Van Geison (EVG), illetve Masson trichrom foltjával festették. Megállapítottuk, hogy az elasztin szálak (fekete/sötétbarna folt) mind a MutSD, mind a MutBD egerek kötőszövetében a WTSD egerekhez hasonló szinten voltak (2B. Ábra, EVG). A WTSD egerekhez képest azonban a MutSD egerekben lényegében nem volt kollagén (kék folt) a bőr kötőszöveteiben (2B. Ábra, Masson trichromja). Meglepő módon a bőr kollagénszintje helyreállt a MutBD egerekben (2B. Ábra, Masson's trichrome).

Kimutatták, hogy a béta 1 transzformáló növekedési faktor (TGF-β1)/Smad3 jelátviteli út számos kollagén gén promotert szabályoz az emberi dermális fibroblasztokban [13]. Azt is kimutatták, hogy az aktivált PPARδ a TGF-β1/Smad3 útvonalon keresztül szabályozhatja a bőr kollagénszintjét [14]. Mivel a bezafibrát egy PPARδ agonista, azt akartuk meghatározni, hogy ez az út aktiválódott-e a 10 hónapos MutBD egerek bőrében. A Smad3 Western blot-ját 10 hónapos egerek bőréből származó teljes homogenátumban végeztük. Eredményeink az összes Smad3 fehérje felhalmozódását mutatták a WTBD és MutBD egerek bőrében a WTSD és MutSD egerekhez képest (2C. Ábra). Korábban kimutatták, hogy a teljes Smad3 fehérje felhalmozódása összefügg a megnövekedett Smad2/3 szignalizációval az emberi dermális fibroblasztokban [15]. Ezért eredményeink azt sugallják, hogy a bezafibrát aktiválja a TGF-β1/Smad3 útvonalat, ezáltal megnöveli a kollagén mennyiségét a MutBD egerek bőrében.

Bezafibrate csökkentette a lép méretét és visszaállította a mutagérek lépszerkezetét

A mut egerekről korábban kimutatták, hogy egyes szervek megnagyobbodtak, az egyik a lép volt [2]. Megállapítottuk, hogy a bezafibrát csökkentette a 10 hónapos MutBD és WTBD egerek léptömegét és méretét (3A. És 3B. Ábra). A MutBD egerek lépmérete visszaállt a WTSD egerek méretéhez (3A. Ábra). A bezafibrátnak a Mut és WT egerek lépére gyakorolt hatásának további vizsgálatához a paraffinba ágyazott lép szakaszok H & E festését végeztük. Megállapítottuk, hogy a bezafibrát javította a MutBD egerek lépszerkezetét (3D ábra). Eredményeink azt mutatták, hogy a MutSD egerek aberráns lépszerkezettel rendelkeztek, amelyet markáns atrófia és csökkent fehér pép (lila területek a 3D-s ábrán) és a lép vörös pépének növekedése jellemzett (3D-s ábra). Mivel a lép fehér pépe antitesteket szintetizál, a MutSD egerek ezen területének atrófiája ronthatja immunválaszukat [16]. Érdekes, hogy a MutBD egerek lépjének fehér és vörös pépeloszlása és szervezete hasonló volt a WTSD egerekhez (3D ábra). Ezek a megállapítások azt mutatják, hogy a bezafibrát védte a lépet a Mut egérben.

(A) 10 hónapos egerek léptömege és (B) Mut egerek lép képe (n = 4–6/csoport). (C) A hasított kaszpáz-3 immunfestés mennyiségi meghatározása paraffin metszetekben 10 hónapos egerek lépéből (n = 3-4/csoport). *, P 6 µl) (n = 5–6/csoport) (F) A PGC-1α és a PPARγ mRNS szintje 10 hónapos egerek lépében normalizálódott aktinná. (G) A Western blot mennyiségi meghatározása, amely kimutatja, hogy a mitokondriális fehérje szintje a teljes homogenizátumban 10 hónapos egerek lépére normalizálódott, aktinná normalizálva. NADH dehidrogenáz (ubiquinone) 1β 8. szubkomplex alegység (NDUFB8; az I komplex alegysége), szukcinát-dehidrogenáz B alegység (SDHB; a II komplex alegységei), ubiquinol-citokróm c reduktáz magfehérje 2 (UQCRC2; A III komplex A alegysége), szintáz 5a alegység (ATP5A; az V komplex alegysége). *, P 4. ábra: A bezafibrát hatása a Mut és WT egerek vázizomzatára.

Itt megmutattuk, hogy a bezafibrát javította a Mut egerek néhány korai öregedésszerű fenotípusát, amelyek a legvilágosabban a bőrön és a lépen figyelhetők meg. Nemrégiben kimutatták, hogy a szomatikus őssejtek mitokondriális diszfunkciója hozzájárulhat a Mut egerekben jelenlévő progeroid fenotípusokhoz [21]. Ezért eredményeink azt sugallják, hogy a bezafibrát segíthet fenntartani az őssejtpopulációt a szövetek, például a bőr és a lép replikálásában a Mut egerekben. Érdekes módon a megfigyelt előnyök nem korreláltak a generalizált megnövekedett mitokondriális tartalommal vagy funkcióval, és a PPAR-ok más, a gyulladás, a zsírsavcsere-anyagcsere és az apoptózis szabályozásában szerepet játszó szabályozási utak hatásaiból is származhatnak.

Anyagok és metódusok

Egér modell

Az MtDNS mutátor egereket (Polg D257A/D257A) (Mut) korábban jellemeztük [2], [3]. 2 hónapos hím Mut és WT egereket (MutBD, illetve WTBD) egy 0,5% bezafibrátot (bezafibrát diéta, BD) (Bio-Serv) tartalmazó standard egér diétára helyeztünk. Kontrollként azonos korú hím Mut és WT egereket helyeztünk a szokásos egér diétára (standard étrend, SD) (MutSD és WTSD). Az egereket 8 hónapig tartottuk a megfelelő étrendjükön, és 10 hónapos korukban elemeztük őket. Csak a hím egereket választjuk a vizsgálatunkhoz felhasznált állatok számának csökkentésére, valamint a nőstény állatoknál észlelt ciklusuk miatt megfigyelhető kísérleti változékonyság elkerülésére.

Állattenyésztés

Az egereket a University of Miami Veterinary Resources Division vírusantigén-mentes létesítményében helyezték el, 12 órás világos/sötét ciklusban, 22 ° C-on, és ad libitum táplálták besugárzott standard egér- vagy bezafibrát-diétával.

DEXA Scan

Ezt az eljárást a korábban leírt módon hajtották végre [22]. Összefoglalva: az egereket érzéstelenítjük, majd lemérjük, és a csont ásványi sűrűségét és tartalmát, valamint a zsír és a sovány testtömeget Lunar PIXImus II denzitométerrel (GE Medical Systems, Waukesha, WI) mértük.

Szövettan

Az eutanizált egerek hátsó és ventrális bőrét leborotválták, a bőrbiopsziákat összegyűjtötték és legalább 24 órán át formalinban tárolták, mielőtt a Miami Egyetem Lois Pope Life Center szövettani magjába küldték őket paraffin beágyazás céljából. A paraffinbőr szakaszokat hematoxilinnal és eozinnal (H&E), Verhoeff Van Geison-nal (EVG) és Masson trichromfoltjával festették a Miami Egyetem Bőrgyógyászati Patológiai Magjában. A festett szakaszokat fénymikroszkóppal elemeztük. A lép és a máj elemzéséhez a mélyen altatott egereket hideg PBS-sel perfundáltuk, a májat és a lépet összegyűjtöttük és legalább 24 órán át formalinban tároltuk. A rögzített szöveteket ezután paraffinba ágyazottuk, metszettük, festettük a H&E számára, és elemeztük a szerkezeti változásokat a Miami Egyetem összehasonlító patológiai laboratóriumában.

Immunfestés

A paraffinba ágyazott lép szakaszokat felmelegítettük, majd paraffinoztuk és rehidratáltuk. A metszeteket 70% hangyasavban inkubáltuk az antigén kinyerése céljából, majd 0,2% Tritonnal permeabilizáltuk. Az endogén peroxidázokat leállítottuk, majd a metszeteket 1 órán át normál kecskeszérummal (KPL) blokkoltuk. A metszeteket egy éjszakán át inkubáltuk 1-250 hígításban a hasított kaszpáz-3 primer antitestben (sejtjelzés). Másodlagos antitestet, biotinilezett kecske anti-nyulat (KPL) alkalmaztunk, majd a metszeteket 30 percig streptavidin-peroxidázokkal (KPL) kezeltük, mielőtt diaminobenzidinben (DAB) inkubáltuk volna. A tárgylemezeket alkoholban dehidratáltuk, majd vizes rögzítőközeggel xilolba helyeztük és fénymikroszkóppal néztük meg. A pozitív (barna) festés számát minden látómezőből 4 látómezőben számoltuk és átlagoltuk.

Western Blot

Western-blotot a korábban leírtak szerint hajtottunk végre [23]. Az alkalmazott primer antitestek a Smad3 (sejtjelzés), a GAPDH (GeneTex), a teljes OXPHOS rágcsáló koktél (mitológiai tudományok), a PGC-1α (Santa Cruz H-300) és az aktin (Sigma) voltak. Elsődleges antitesteket 1 000 hígításban alkalmaztunk, kivéve a PGC-1α-t, amelyet 1 200 hígításban használtunk, és egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on. Az alkalmazott másodlagos antitestek infravörös konjugált anti-nyúl 700 (1,3000) és anti-egér 800 (1 5000) (Rockland) és kecske anti-nyúl HRP-hez kapcsoltak (1 000) (Cell Signaling) voltak. A blotokat vagy az Odyssey infravörös képalkotó rendszerrel (LI-COR Biosciences) vizualizálták, és a sávintenzitást az LI-COR alapértelmezett szoftverével számszerűsítették, vagy röntgenfilm-fejlesztővel vizualizálták, és a sávintenzitást az ImageJ szoftverrel számszerűsítették.

Mennyiségi PCR

A teljes RNS-t a rákattintott fagyasztott szövetből RNeasy Fibrous Tissue Mini kit (quadriceps) és RNeasy Mini (máj és lép) (Qiagen) alkalmazásával izoláltuk. A cDNS-t 1 ug RNS-ből szintetizáltuk az iScript cDNS szintézis készlet (BIO-RAD) felhasználásával. Kvantitatív valós idejű PCR, specifikus primerekkel a PGC-1α-hoz (5′-CTGCGGGATGATGGAGACA, 5′-AGCAGCGAAAGCGTCACA), PGC-1β (5′-TGGCCCAGATACACTGACTATG),

5′- TGGGCCTCTTTCAGTAAGCT), PPARα (5′- TTCCCTGTTTGTGGCTGCTAT,

5′- CCCTCCTGCAACTTCTCAATGTAG), PPARγ (5′- CGGAAGCCCTTTGGTGACTTTA,

5'GCGGTCTCCACTGAGAATAATGAC), PPARS (5'ACCGCAACAAGTGTCAGTAC, 5'CTCCGGCATCCGTCCAAAG), ACOX (5'ACCGCCTATGCCTTCCACTTTC, 5'GCAAGCCATCCGACATTCTTCG), CD36 (5'CCAAATGAAGATGAGCATAGGACAT, 5'-GTTGACCTGCAGTCGTTTTGC), CPT1 (5' TTTCGACAGGTGGTTTGAC, 5′- TCTGCGTTTATGCCTATCTTG), SCAD (5′- CCTGGATTGTGCTGTGAA, 5′- TGTCTGCCAGCTTGAACT) és β-Actin (5′-TGACAGGATGCAGAAGGAG),

Az 5′-GCGCTCAGGAGGAGCAAT) SsoAdvanced SYBR Green (BIO-RAD) alkalmazásával végeztük. Az MtDNS kópiaszámot a korábban leírtak szerint számszerűsítettük [4]. ΔΔCt módszert alkalmaztunk az egyes gének relatív bőségének meghatározására.

Spektrofotometriás vizsgálatok

A citrát szintáz (CS) aktivitást spektrofotometriásan határoztuk meg az egerek quadricepszéből származó teljes homogenátumban, a korábban leírtak szerint [4]. A vizsgálati eredményeket a Bradford-módszerrel kapott fehérjekoncentrációra normalizáltuk.

Futópad teszt

A futópad tesztet a korábban leírt módon hajtották végre [4]. Az egereket először a futópadhoz igazították (Columbus Instruments, Columbus, OH), majd 3 percig 9 méter/perc sebességgel futtatták őket. Az egerek teljesítményét az határozta meg, hogy hányszor esett le egy egér a futószalagról a rácsra a teszt során.

Vérelemzés

Az egereket egy éjszakán át éheztettük, majd másnap érzéstelenítettük, és a vért szívszúrással vettük össze. A vért a Miami Egyetem összehasonlító patológiai laboratóriumába küldték a teljes vérsejtszám (CBC) elemzésére és egy máj vérpanelre a májkárosodás/gyulladás markereinek mérésére.

Etikai nyilatkozat

Ezt a vizsgálatot szigorúan az Országos Egészségügyi Intézet laboratóriumi állatok gondozásának és felhasználásának útmutatójában szereplő ajánlásoknak megfelelően végezték el. A protokollt a Miami Egyetem állatkísérlet-etikai bizottsága hagyta jóvá (engedélyszám: 12-094). Minden erőfeszítést megtettek a szenvedés minimalizálása érdekében.

Köszönetnyilvánítás

Hálásak vagyunk Dr. Tongyu Cao-nak a bőrelemzésben nyújtott segítségért, Estefania Gonzalez asszonynak az RNS-készítéshez nyújtott segítségért, Dr. Wayne Balkan-nak a DEXA szkennerhez való hozzáférésért, a Miami Egyetem összehasonlító patológiai laboratóriumához és a dermatológiai patológiához a szövettani festéshez/elemzés és az Actavis Pharmaceuticals a bezafibrát nagylelkű ajándékáért.

Szerző közreműködései

A kísérletek megtervezése és megtervezése: LMD CTM. Végezte a kísérleteket: LMD AH SG. Elemezte az adatokat: LMD CTM. Hozzájáruló reagensek/anyagok/elemző eszközök: TP. Írta a dolgozat: LMD CTM TP.