A hőkezelés javítja a glükóz toleranciát és megakadályozza a csontváz izom inzulinrezisztenciáját a magas zsírtartalmú étrendben szenvedő patkányokban

Absztrakt

CÉLKITŰZÉS-A hőkezelés és a hősokk-fehérje 72 (HSP72) túlzott expressziója bizonyítottan védelmet nyújt a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott inzulinrezisztencia ellen, de a HSP működésének alapmechanizmusáról vagy célszöveteiről keveset tudunk. A vizsgálat célja annak meghatározása, hogy az in vivo hőkezelés megakadályozhatja-e a vázizom inzulinrezisztenciáját.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREKA hím Wistar patkányokat 12 héten keresztül magas zsírtartalmú étrendben (60% kalória a zsírból) táplálták, és hetente egyszer alacsonyabb testű hőkezelést kaptak (41 ° C 20 percig).

EREDMÉNYEK-Eredményeink azt mutatják, hogy a hőkezelés a magas zsírtartalmú étrendben lévő patkányok metabolikus jellemzőit a szokásos étrenddel szemben eltolja. A hőkezelés javította a glükóz toleranciát, helyreállította az inzulin által stimulált glükóz transzportot, és fokozta az inzulin jelátvitelt a magas zsírtartalmú étrendet tápláló patkányok soleus és extensor digitorum longus (EDL) izmaiban. A hőkezelés a Jun NH2-terminális kináz (JNK) és az κB kináz inhibitor (IKK-β), az inzulinrezisztenciában szerepet játszó stressz-kinázok, valamint a HSP72 és HSP25, a fehérjék, amelyekről korábban kimutatták, hogy gátolják a JNK és az IKK-β, gátló aktivitását csökkentették. aktiválás, ill. A mitokondriális citrát-szintáz és a citokróm-oxidáz aktivitása kissé csökkent a zsírtartalmú étrend mellett, de a hőkezelés helyreállította ezeket a tevékenységeket. Az L6 sejtek adatai arra utalnak, hogy a hőkezelés egy része növeli a mitokondriális oxigénfogyasztást és a zsírsav oxidációt.

KÖVETKEZTETÉSEKEredményeink azt mutatják, hogy a hőkezelés megvédi a vázizomzatot a magas zsírtartalmú étrend okozta inzulinrezisztenciától, és erős bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a vázizomzat HSP-indukciója potenciális terápiás kezelés lehet az elhízás okozta inzulinrezisztencia szempontjából.

Az inzulinrezisztencia számos kapcsolódó egészségügyi komplikációval jár együtt, beleértve a 2-es típusú cukorbetegséget és a szívbetegségeket. Egy nemrégiben elvégzett tanulmány bebizonyította a test természetes védekező rendszerének, a hősokk-fehérjéknek (HSP) indukcióját, amelyek védenek az elhízás okozta inzulinrezisztenciával szemben (1). Korábbi vizsgálatok 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegeknél azt mutatták, hogy a forró kádterápia javította a glikémiás kontrollt (2), és fordított összefüggést mutat a HSP72 mRNS expressziója és a 2-es típusú cukorbetegség mértéke között (3). Jelenleg számos HSP-indukáló gyógyszert vizsgálnak vagy végeznek klinikai vizsgálatokban diabéteszes neuropathia és neurodegeneratív betegségek miatt (4,5), és figyelembe lehet venni az inzulinrezisztencia megelőzésében. Kevéssé ismert azonban a HSP72 újonnan felfedezett szerepének mechanizmusa arról, hogy más indukálható HSP-k megvédhetik-e az inzulinrezisztenciát, vagy a HSP hatásának elsődleges célszövete.

A vázizom a fő test, amely az egész test inzulin által közvetített glükózfelvételéért felelős (6,7). A HSP-k vázizmokban fejeződnek ki, és erőteljesen indukálódnak a testedzéssel (8,9). Kimutatták, hogy a HSP72 túlzott expressziója az életkor előrehaladtával csökkenti a vázizmok atrófiáját és az oxidatív stresszt (10). Ezért a vázizom logikus választás, mint célszövet a HSP túlzott expressziójának előnyeire. Korábbi tanulmányok azt mutatják, hogy a HSP-k bazális szintje különbözik az izomrost-típusok között, a lassú rángatózású oxidatív izmok magasabb konstitutív HSP-expresszióval rendelkeznek, mint a gyorsan rángatózó glikolitikus izmok (11). Ezzel szemben a gyors rángatózással rendelkező izmok nagyobb mértékben képesek a HSP indukciójára, reagálva a fiziológiai stresszekre és a testmozgásra (11,12). Bizonytalan, hogy a HSP-k ugyanolyan hatékonyak lennének-e, mint a lassú és gyors rángatózó izmok inzulinhatásának közvetítői.

Jelen vizsgálat célja annak meghatározása volt, hogy a heti in vivo hőkezelés megakadályozhatja-e a vázizom inzulinrezisztenciáját magas zsírtartalmú étrenddel táplált patkányokban, és tisztázza a HSP működésének mechanizmusait a vázizomban. Feltételeztük, hogy a hőkezelés lehetővé teszi a vázizmok alkalmazkodását és az inzulinrezisztencia kialakulásának ellenállását a megnövekedett HSP expresszió következtében. Eredményeink azt mutatják, hogy a hőkezelés megakadályozza a vázizom inzulinrezisztenciáját és a stressz kináz aktiválódását, míg a megnövekedett oxigénfogyasztás és a zsírsav oxidáció az L6 sejtekben arra utal, hogy a hőkezelés javíthatja a mitokondriális funkciót.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

[14C] mannitot és 2-dezoxi [1,2-3H] glükózt az American Radiolabeled Chemicals-tól (St. Louis, MO) vásároltunk. Az alkalmazott antitestek közé tartoznak a foszfo-Thr183/Tyr185 és a teljes Jun NH2-terminális kináz (JNK), a foszfo-Ser473 és az összes Akt, valamint a κBα (IkBα) inhibitorok (Cell Signaling, Beverly, MA); HSP72, foszfo-Ser82 és teljes HSP25, HSP60 és citokróm c (Stressgen, Victoria, BC, Kanada); tubulin (Sigma, St. Louis, MO); a citokróm-oxidáz IV I. és IV alegységei (Molecular Probes, Eugene, OR); citrát-szintáz (Alpha Diagnostic, San Antonio, TX); a protein-3 szétkapcsolása (UCP-3; Chemicon International, Temecula, CA); peroxiszóma-proliferátor-aktivált receptor (PPAR) -γ koaktivátor 1 α (PGC-1α; Calbiochem, San Diego, Kalifornia); foszfo – Tyr612-IRS-1 (Biosource, Camarillo, Kalifornia); és az IRS-1 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). A [3H] palmitátot a Perkin Elmer-től (Waltham, MA), az inzulin ELISA-készleteket az Alpco diagnostics-tól (Salem, NH) és az összes többi reagenst a Sigma-tól vásároltuk.

Kísérleti állatok és kezelés.

A Charles River Laboratories (Wilmington, MA) Wistar hím patkányait (100-130 g) szabályozott hőmérsékletű (22 ± 2 ° C) helyiségben helyezték el 12:12 világos/sötét ciklus mellett. Az állatokat 12 hétig ad libitum-mal etettük standard chow-étrenddel (8604; Harlan Teklad, Madison, WI) vagy magas zsírtartalmú étrenddel [60% kalória zsírból és zsíros kukoricaolajból, valamint 20% szénhidrátból (13)]. A kísérleteket 48 órával az utolsó hő- vagy színlelt kezelés után végeztük, és a patkányokat 12 órával a kísérleti eljárások előtt éheztettük. Valamennyi protokollt a Kansasi Egyetem Orvosi Központjának állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyta jóvá.

In vivo hőkezelés.

Hetente egyszer nagy zsírtartalmú táplálékkal ellátott állatokat pentobarbitál-nátriummal (5 mg/100 g testtömeg) altattunk, és az alsó testet vízfürdőbe merítettük. A testhőmérsékletet fokozatosan emeltük, és 41 és 41,5 ° C között tartottuk 20 percen keresztül, végbélhőmérővel követve. Az álkezelés a maghőmérsékletet 36 ° C-on tartotta. A kezelés után 5 ml 0,9% -os sóoldatot adagoltunk a kiszáradás megakadályozása érdekében. Laboratóriumunkban végzett előzetes kísérletek azt állapították meg, hogy hetente egy hőkezelés fenntartja a HSP72 expresszió növekedését és elkerüli a potenciális HSP gátlást ismételt hőkezeléssel (14).

Intraperitoneális glükóz tolerancia teszt.

Az intraperitoneális glükóz tolerancia tesztet (IPGTT) a 11. héten végeztük, 48 órával az utolsó hőkezelés után. Az éjszakán át éheztetett patkányokat altattuk és 2 g/testtömeg-kg glükózterhelést kaptunk. A kiszáradás megelőzése érdekében a GTT után 5 ml 0,9% -os sóoldatot adtunk be.

Immunblot, glükóz transzport és kináz vizsgálat.

A 12. héten patkányokat altattunk a soleus és az extensor digitorum longus (EDL) izmok eltávolítása céljából. Az izmokat hosszanti irányban szétválasztottuk, hogy lehetővé tegyük a szubsztrátok megfelelő diffúzióját (11,15). Patkányonként két izomcsíkot vizsgáltak a glükóz transzport szempontjából, és két csíkot inkubáltak 1 mU/ml inzulinnal vagy anélkül 20 percig, és lefagyasztották Western-blot analízishez a korábban leírtak szerint (11). A Western-blotokat először foszforilált fehérjék szempontjából vizsgáltuk, majd a teljes fehérje-expresszió érdekében sztrippeltük. A glükóztranszport-aktivitást 1,5 μCi/ml 2 [1,2-3H] dezoxi-glükóz és 0,2 μCi/ml [14C] mannit (11,16,17) alkalmazásával határoztuk meg. A κB kináz inhibitor (IKK-β) aktivitási szintjét a teljes sejt-lizátumokban a korábban leírtak szerint vizsgáltuk (18). A foszforilezett IκBα szinteket Western blot analízissel detektáltuk.

KNK437 inkubáció.

A Soleus izmokat 3 hónapos Fischer 344 patkányokból izoláltuk, és 42 ° C-os hőkezelésnek vagy 35 ° C-os álkezelésnek vetettük alá 30 percig in vitro. Az izmok alcsoportjait 100 μmol/l HSP70 inhibitor KNK437-ben (Calbiochem) inkubáltuk és 10 μg/ml anizomicinnel (Calbiochem) stimuláltuk. A HSP72-et és a p-JNK/JNK-t Western blot analízissel detektáltuk.

Mitokondriális enzimaktivitás.

A citrát szintáz aktivitást izomlizátumokban értékeltük (amelyeket az immunblotoláshoz használt sejtkivonási pufferben állítottunk elő; Biosource), Srere (20) módosított protokollja (19) alkalmazásával. Az abszorbanciát 205 másodpercenként 405 nm-en rögzítettük 3 percig 30 ° C-on, MRXII mikrolemez-olvasóval és kinetikus szoftvercsomaggal (Dynex Technologies, Chantilly, VA). A reakciógörbe lineáris részét használtuk fel a citrát-szintáz aktivitási szintjeinek kiszámításához, normalizálva a citrát-szintáz fehérje expressziós szintjére, mikromol/gramm/perc értékben.

A citokróm-oxidáz vizsgálathoz 140 μg izomlizátumot 20 mmol/l kálium-foszfát pufferben (pH 7,0) és 0,2 mg dodecil-maltozidot 30 ° C-ra melegítettek (21). A reakciót 25 μmol/l redukált citokróm c hozzáadásával indítottuk el, és a redukált citokróm c oxidációját 2 percig követtük 550 nm-en DU sorozatú spektrofotométeren (Beckman Coulter, Fullerton, CA). A citokróm c maximális oxidációját kálium-ferricianid hozzáadásával határoztuk meg. Az aktivitást kiszámoltuk és a citokróm c-oxidáz 4-es alegység (Cox-4) fehérje expressziós szintjére normalizáltuk (másodperc/milligramm fehérje).

Az oxigénfogyasztás mértékének mérése.

Az American Type Culture Collection (Manassas, VA) L6 myoblasztjait Dulbecco módosított Eagle-táptalajában tenyésztettük, 10% magzati szarvasmarha-szérummal, 100 egység/ml penicillinnel és 100 μg/ml sztreptomicinnel kiegészítve. Öt-hat nappal a differenciálódás után az L6 sejteket 30 ng/ml tumor nekrózis faktor-a-val (TNF-a) kezeltük önmagában vagy hőkezeléssel kombinálva (43 ° C 20 percig), és a kísérleteket 24 órával később végeztük. Az O2-fogyasztás mértékét egy Oroboros Oxygraph-2K nagy felbontású respirométerrel (Innsbruck, Ausztria) határoztuk meg. A kiindulási stabilizálás után a légzési lánc inhibitorait egymás után injektáltuk: 1 μg/ml oligomicint, 3 μmol/l karbonil-cianid 4- (trifluor-metoxi) -fenil-hidrazont, 1 μmol/l rotenont és 2 μmol/l myxothiazolt. Valamennyi értéket a fehérjetartalomra normalizáltuk, és a nem-mitokondriális légzési arányokat levontuk.

Zsírsav oxidációs sebességek.

A zsírsav-oxidációt a korábban leírt módon hajtották végre (22). Röviden, az L6 myocsőt hőkezeléssel vagy álkezeléssel kezeltük, és 72 órán át 200 μmol/l palmitátnak tettük ki 7,5% BSA-val (wt/vol) párosítva. A palmitátkezelés utolsó 24 órájában második hőkezelést végeztek. A sejteket PBS-sel mostuk és 200 μl 125 μmol/l [3H] palmitát-BSA oldattal (1 mCi/ml törzs) inkubáltuk, 1 mmol/l karnitinnel kiegészítve 2 órán át 37 ° C-on. Inkubálás után mindegyik üregből az oldatot 200 μl hideg, 10% -os TCA-hoz adtuk, és 10 percig 3300 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. Miután 6 N NaOH-dal semlegesítettük, az elegyet DOWEX gyantaoszlopon futtattuk a zsírsav-oxidációs köztitermékek és a 3H-jelzett víz elválasztására. Szcintillációs folyadékot adunk az átfolyáshoz, és 3 H-CPM-t (percenkénti számot) számlálunk. A zsírsav oxidációs sebességét normalizáltuk a fehérjetartalomra, és nanomol/óra/milligramm értékben fejeztük ki.