A korai táplálékfogyás és az étrend hatása a baktériumok transzlokációjára a gasztrointesztinális traktusból az újszülött patkányban

Absztrakt

A bakteriális transzlokációt úgy határozták meg, mint az életképes baktériumok átjutását a GI traktusból a mesenterialis nyirokcsomókba és más extraintesztinális szervekbe, mint a máj, a lép és a vér (1). Bár a transzlokációval kapcsolatos jelenlegi ismeretek nagy része állatkísérletekből származik, ma már széles körben elfogadott, hogy a bélből származó mikroorganizmusok szisztémás elterjedése részt vesz azon megmagyarázhatatlan és potenciálisan halálos szeptikus állapotok patogenezisében, amelyek immunhiányos betegeknél fordulnak elő (2, 3), portális hipertóniában és májcirrhosisban szenvedő betegeknél (4, 5), valamint súlyos termikus (6, 7) vagy mechanikus trauma (8, 9) után .

Egy másik populáció, amely hajlamos a gram-negatív szepszis megszerzésére a bejutás nyilvánvaló fókuszának hiányában, az újszülöttek, különösen korai korban (10). Ennek az egyedülálló érzékenységnek a lehetséges magyarázata lehet a GI traktus éretlensége a baktériumokkal való kolonizáció idején (11) és egy még mindig nem teljesen fejlett immunrendszer (12), amely nem képes teljesen megtisztítani a behatoló baktériumokat. Kísérleti támogatás arra a nézetre, hogy a baktériumok transzlokációja megkönnyíti, ha a bélgát éretlen, Glode tanulmányaiból származiket al. (13) és Pluschke et al. (14), bemutatva, hogy a szájon át beoltott Escherichia coli A K1 újszülött patkányokban nyerhető ki a mesenterialis nyirokcsomókból, a májból és a vérből. Az emberi újszülött baktériumok transzlokációjának legközvetlenebb bizonyítékát valószínűleg Lambert-Zechovsky állította elő et al. (15), akik több törzs genetikai rokonságát bizonyították Enterobacter cloacae széklet, vér és cerebrospinalis folyadék tenyészeteiből izolálva, baktériumban és agyhártyagyulladásban szenvedő csecsemőben.

Egyes bizonyítékok arra utalnak, hogy az újszülött bél baktériumok felvételére való hajlam tovább fokozható a gazdaszervezet táplálkozási állapotának megváltoztatásával. A klinikai megfigyelések és az epidemiológiai adatok alapján jól értékelhető, hogy a táplálkozási hiányosságok a fertőzések fokozott előfordulásához kapcsolódnak (16). Úgy tűnik, hogy ez az összefüggés a mesterségesen táplált csecsemőknél érvényesül, míg az anyatejnek bizonyos fertőzésellenes hatása van (17, 18). A korai táplálkozási hiány, hasonlóan a mesterséges tápláláshoz, megváltoztathatja a bél nyálkahártya-gátjának permeabilitását és/vagy felépítését (19–22), csökkentheti a gazdaszervezet immunvédelmi rendszerét (23–25), és megzavarhatja a normális egyensúlyt, amely a különböző táplálkozások között fennáll a GI baktérium mikroflóra tagjai (26, 27). Ezeket az elváltozásokat Deitch és Berg (28) azonosították, hogy képviseljék a baktériumok transzlokációjának fő kockázati tényezőit felnőtt rágcsálókban.

A jelenlegi kísérletek során először azt vizsgáltuk, hogy az őshonos baktériumok transzlokációja spontán történik-e a szülés utáni időszakban. A korai táplálkozáshiányos és táplálkozási mód hatását a baktériumok transzlokációjára is tanulmányoztuk természetes és mesterséges táplálás modelljeivel. Újszülött patkányokat alkalmaztak alanyként, mert ezek az állatok születésükkor viszonylag éretlenek, ezért modellként szolgálnak a koraszülöttek számára (29, 30) .

MÓD

Állatok

Időszakos vemhes Sprague-Dawley patkányokat a bécsi Himberg tenyésztőlaboratóriumokban vásároltak. Szabadon hozzáférhettek a vízhez és a rendszeres chow-hoz, és 12 órás világos-sötét ciklusban tartották őket. A patkányokat spontán szabadon engedték. Ezekhez a kísérletekhez csak tanúként született születéseket használtak. Minden kölyköt lemértek a szülés után.

Kísérleti csoportok és etetési protokoll

I. kísérlet. Hét alomból származó 56 újszülött hím és nőstény patkány kölyköt véletlenszerű sorrendben négy különböző csoport egyikébe osztottak be, hogy kiküszöböljék az interlitter variáció hatását. 1) A patkányokat azonnal tanulmányozták, és újszülött kontrollként szolgáltak (n = 15).2) A patkánykölykök a gát mellett maradtak és szoptatták őket ad libitum (n = 15). Két különálló patkánycsoportot, az egyiket szoptatták, a másikat mesterségesen táplálták, táplálékkorlátozásnak vetették alá az alultápláltság kiváltása érdekében (31, 32). A táplálék ütemezését a jelentős alultápláltság előidézése érdekében, magas halálozási arány nélkül, előzetes vizsgálatok határozták meg. 3A) A kölyökkutyáknak 12 óránként 30 percig szopni kellett 7 patkány/gát sűrűségben (n = 13). A táplálkozási időszakok között a kölyköket elválasztották a gáttól és éheztették. 3B) A korlátozott tápszerrel kezelt patkányokat a szoptatás megkezdése előtt minden anyától azonnal levették (n = 13). A kölyköket 6 óránként etettük cseppentővel, amelynek képlete 250-300 kcal/(kg · nap) energia bevitelre számított. A különféle etetéseket 5 napig tartottuk.

II. Kísérlet. Négy alomból származó huszonhét újszülött patkányt véletlenszerűen két csoport egyikébe osztottak: az első csoportban a patkányokat megfelelő mennyiségű tápszerrel etették szondánként, kiszámítva, hogy 500 kcal/(kg · d) energiafelvételt biztosítsanak, ahogy másutt leírják ( 30, 33); a második csoportban patkányok szoptattak ad libitum a gát mellett, és 6 óránként ál-intubálták őket. A patkányokat 3 nap múlva elemeztük.

Kölykök, amelyek nem szoptak ad libitum A gát mellett egyedi hungarocell csészékben helyezkedtek el, amelyeket 37 ° C-on tartott vízfürdőben lebegtek. Az anyai tevékenységek szimulációja érdekében a genitorectalis területet finom ecsettel stimulálták a kiürülés és a székletürítés kiváltására. Az összes kölyköt minden nap ugyanabban az időben mértük.

A patkánytej-tápszert (amelyet a Milupa Nutrition Co., Ausztria bőségesen szolgáltatta) a patkánytej-összetételre vonatkozó közzétett adatok alapján állították össze (34). Minden 100 ml 175 kcal-t, 9,6 g fehérjét, 2,9 g szénhidrátot és 12,9 g zsírt tartalmaz, ásványi anyagokkal és vitaminokkal megközelítve a patkánytejben lévő mennyiséget. A tápszer legfőbb energiát biztosító összetevői a kukoricaolaj (12,7 g/100 ml), a nátrium-kazeinát (7,2 g/100 ml) és a laktalbumin (3,2 g/100 ml) voltak, hasonlóan a korábbi munkásokhoz (33, 34). Az étrend ozmolalitása fagyáspont-depresszióval mérve 346 mosmol/l volt (összehasonlításképpen: a patkánytej ozmolalitása 352 mosmol/l) (34). A tejkészítményt 12 óránként készítették porított alkotórészekből. Mindegyik 12 órás adagból a maradék képlet alikvot részeit tenyésztettük véragaron a bakteriális szennyeződés kimutatása céljából. Mindezek a kultúrák negatívak voltak.

A baktériumok transzlokációjának vizsgálata

Morfológia

A disztális vékonybél két centiméteres szakaszait minden kölyöktől fixáltuk 10% -os pufferolt formaldehid-oldatba merítve fénymikroszkópos célra. A mintákat hematoxilinnal és eozinnal, Masson-féle trichrommal és periodikus savval-Schiff festettük. Az összes mintát egyetlen megfigyelő értékelte, aki nem volt tisztában a vizsgálat tervével.

A folyamatos adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki, és a Tukey-val való variancia-elemzéssel elemezzük post hoc teszt vagy a párosítatlan kétfarkú t teszt, adott esetben. A folytonos adatokat χ 2 analízissel értékeltük. o értékek

EREDMÉNYEK

A különböző táplálkozások hatása a testsúlyra.Az 1. táblázat azt mutatja, hogy a súlygyarapodás hasonló volt, ha az anyatejet vagy tápszert tartalmazó étrendet megfelelő mennyiségben biztosították. Bármelyik étrend korlátozott táplálása jelentős növekedési késést eredményezett.

Morfológia. Mikroszkóposan a normális vagy csökkentett mennyiségű anyatejjel táplált állatokban a disztális belek normálisak voltak. Ezzel ellentétben normális vagy korlátozott mennyiségű tápszerrel etetett patkányokban két rendellenes tulajdonságot észleltek. A nyálkahártyaödéma következetes megállapítás volt 13 normál tápszerrel táplált patkány közül 4-ben (o 2. TÁBLÁZAT A GI traktus bakteriális kolonizációja *

Translokációs tanulmányok. Amint a 3. táblázat mutatja, minden baktériumtenyészet negatív volt a születés után közvetlenül leölt újszülött kontroll patkányokban. 5 d normális szoptatás után baktériumokat tenyésztettek a mesenterialis nyirokcsomókból 27% -ban, a májból és a lépből pedig a patkányok 20% -ában. Hasonló eredményeket értek el, amikor a szoptatást korlátozták. Ezzel szemben a korlátozott vagy normál tápszeres táplálás drámai mértékben megnövelte a baktériumok transzlokációját az extraintesztinális szervekbe, beleértve a szisztémás vért is, amely steril maradt az összes többi csoportban.

A 4. táblázat a mesenterialis nyirokcsomókból és a szisztémás szervekből kinyert különféle baktériumfajokat mutatja be. Az anyatejjel táplált patkányokban a transzlokált baktériumokat általában Enterococcus sp.,E. coli, és Staphyloccus epidermidis. Ezeket az organizmusokat el lehet különíteni tápszerrel táplált patkányok szervkultúráiból is. Ezenkívül a mesterséges táplálás a bőséges transzlokációval járt együttProteus sp. és Enterobacter sp., olyan fajok, amelyeket nem figyeltek meg a szoptatott állatok szerveiben. A pozitív tenyészetek gyakran egynél több fajt növesztettek, különösen tápszerrel táplált patkányokban. Minden egyes kölyöknél a szervkultúrából kinyert fajok a bélflóra részét képezték.

VITA

Az itt bemutatott adatok azt mutatják, hogy a baktériumok transzlokációja a bélből spontán fordul elő újszülött patkányokban, és a mesterséges etetés drámai módon megnöveli. Azt javasolják továbbá, hogy az élelmiszer-korlátozás nem fokozza a baktériumok transzlokációját.

A mesterséges etetés több jellemzővel is jár, amelyek mindegyike elősegíthette a transzlokációt. Ezek az etetés módja, a környezeti hatások és az étrend önmagában.

A transzlokációs szint alacsony maradt a szoptató kontrollok álcázása után, ami azt jelenti, hogy az etetési módszerrel kapcsolatos manipuláció valószínűtlen forrás volt a baktériumok transzlokációjára a csővel táplált patkányokban. Még kevésbé tűnik valószínűnek, hogy a transzlokációt csepegtető módszerrel indukálták, amely nem társul a nyelőcső és/vagy a gyomor nyálkahártyájának potenciális traumatizálásához, csakúgy, mint a csőből történő táplálás. Ezenkívül a képletből származó baktériumtenyészetek következetesen negatívak voltak, ami azt jelzi, hogy a baktériumokat nem oltották be szennyezett tejetartalommal. Összességében elmondható, hogy a mesterségesen táplált patkányok megnövekedett transzlokációs szintje valószínűleg nem a különböző etetési módszereknek köszönhető.

Két bizonyíték arra utal, hogy a mesterséges etetés transzlokációra gyakorolt hatását nem az utódok elválasztása okozta a gáttól és az anyai környezettől. Először is, a transzlokáció sokkal magasabb volt a korlátozott tápszerrel táplált patkányoknál, mint a korlátozott anyatejjel táplált patkányoknál, bár mindkét csoportot inkubátorokban tartották (kivéve a napi 60 percet, amely alatt az anyatejjel táplált patkányokat szívhatták). Másodszor, a transzlokáció szintje mennyiségileg hasonló volt normál vagy korlátozott anyatejjel táplált patkányoknál, annak ellenére, hogy az előbbi állatok a gátnál maradtak, az utóbbiakat pedig az anyjuktól elkülönítve tartották.

A jelen eredmények legvalószínűbb értelmezése véleményünk szerint az, hogy a mesterséges táplálás baktériumok transzlokációjára gyakorolt hatását elsősorban a tápszeres étrend (és/vagy az anyatej hiánya) közvetítette. A mesterséges képletből hiányzik számos antibakteriális komponens, amely patkányok és emberek kolosztrumában és anyatejében jelen lenne, ideértve a specifikus humorális antitesteket, az immunokompetens sejteket és az olyan nem specifikus tényezőket, mint a lizozim, a komplement és a laktoferrin (37). Ezen tényezők némelyikének helyi hatásai lehetnek, ha a bél mentén érintetlenül átjutnak. A szekréciós IgA például a bélbaktériumok nyálkahártya-sejtekhez való kötõdésének elsõdleges védelmét képviseli (38); Az ebbe a kategóriába tartozó Ig-ket észlelhető mennyiségben tartalmazzák az anyatejben; azonban még nem termelődnek az újszülött éretlen bélében (11). A tápszeres étrendből hiányoznak a növekedést elősegítő tényezők és hormonok, amelyek hozzájárulnak a bélnyálkahártya normális érleléséhez (39), és ezáltal károsíthatják a GI-gát funkciót, amint azt a mesterségesen táplált újszülött állatoknál (21) és az embereknél (22) megfigyelték. .

Az élelmiszer-korlátozás alá esett patkányok eredményei általában megegyeznek a felnőtt rágcsálókkal végzett vizsgálatokkal, amelyek azt mutatják, hogy az alultápláltság nem fokozza a baktériumok transzlokációját (40). Korlátozott szoptatással nem tudtuk megemelni a transzlokáció szintjét, bár az ilyen etetési ütemtervnek alávetett patkányok 5-d periódus alatt következetesen nem tudtak hízni. Megfelelő vagy korlátozott mennyiségű tápszerrel etetett patkányoknál a transzlokáció hasonló mértékben növekedett, bár az előbbi patkányok híztak, míg utóbbiak nem. Mivel ez a két patkánycsoport más szempontból is különbözött (azaz. takarmányozási módszer, alom, életkor), és mivel a súlygyarapodás önmagában nem lehet az étrend megfelelőségének indexe (34), az alultápláltság bizonyos, egymásra helyezett hatása a tápszerrel táplált patkányok transzlokációjára nem zárható ki biztosan. Ugyanígy nincs nyilvánvaló bizonyíték ilyen hatásra.

Noha nem vizsgáltuk a transzlokációs folyamat mechanizmusát, Deitch és Berg (28) szerint az összes fő kockázati tényező, a Bevezetésben vázoltak szerint, jelen volt a mesterségesen táplált patkányokban, és együttesen is működhettek volna.

Először is, az újszülött patkány születésekor viszonylag immunhiányos, részben azért, mert szisztémás Ig-készletének jelentős részét el kell szívnia az anyatejből a bélen keresztül. Az anyatej hiánya tovább ronthatta az immunrendszert, amint azt fentebb említettük.

Másodszor, a GI baktérium mikroflóra összetétele megszakadt, és a tápszerrel táplált kölykök mindkét csoportjában a teljes bélben megnövekedett baktérium populációs szintet mutatott. Azok a tényezők, amelyek megváltoztathatták a bakteriális flórát, az étrend különbségei, a csökkent mozgékonyság és a környezeti hatások. Jól ismert, hogy a mesterséges etetés módosíthatja a GI kolonizációs mintázatát az emberi csecsemőknél is, bár kisebb mértékben, mint patkányoknál tapasztaltuk (27) .

Végül a vékonybél nyálkahártyájának morfológiai változásait, amelyeket subepithelialis ödéma és foltos intersticiális vérzés jellemez, jelentős számú tápszerrel táplált patkányban mutattak ki. Feltételezzük, hogy a bakteriális toxinok a kórosan összetett és fokozott baktériumterheléssel, megváltozott motilitással (41) és a bél mikrocirkulációjának hiperfúziójával összefüggésben vannak a septicemia miatt (42), amelyek nyálkahártya elváltozásokat okozhatnak.

Nyilvánvaló, hogy a patkányok jelenlegi eredményei nem alkalmazhatók közvetlenül az ember helyzetére. Mindazonáltal eredményeink alátámasztják azt az elképzelést, hogy a mesterséges táplálás megváltoztathatja a bélgát funkcióját és megkönnyítheti a baktériumok szisztémás behatolását a belekből az éretlen újszülöttnél.