A különböző egér vad típusú törzsek fogékonysága az étrend által kiváltott NAFLD/AFLD-asszociált májbetegség kialakulására

Társulás BioPersMed/Biobank Graz, Graz Orvostudományi Egyetem, Graz, Ausztria

Tartományi Gyógyszerészeti Tanszék, Gyógyszerbiológia, Saarland Egyetem, Saarbrücken, Németország

Tartományi Gyógyszerészeti Tanszék, Gyógyszerészeti Biotechnológia, Saarlandi Egyetem, Saarbrücken, Németország, Mikrobiális Természetes Termékek Tanszék, Helmholtz-Gyógyszerkutató Intézet Saarland (HIPS), Helmholtz Fertőzéskutató és Gyógyszerészeti Biotechnológiai Központ (HZI), Saarbrücken, Németország

Tartományi Gyógyszerészeti Tanszék, Gyógyszerbiológia, Saarland Egyetem, Saarbrücken, Németország

Biomedicina és Egészségtudományi Intézet, Joanneum Research, Graz, Ausztria

Gráci Orvostudományi Egyetem Polgársági Intézete, Graz, Ausztria

Graz Orvostudományi Egyetem, Polgársági Intézet, Graz, Ausztria

Társulás BioPersMed/Biobank Graz, Graz Orvostudományi Egyetem, Graz, Ausztria

Vera H. I. Fengler,
Tanja Macheiner,
Sonja M. Kessler,
Beate Czepukojc,
Katja Gemperlein,
Rolf Müller,
Alexandra K. Kiemer,
Christoph Magnes,
Johannes Haybaeck,
Carolin Lackner

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Fengler VHI, Macheiner T, Kessler SM, Czepukojc B, Gemperlein K, Müller R és mtsai. (2016) A különböző egér vad típusú törzsek fogékonysága az étrend által kiváltott NAFLD/AFLD-asszociált májbetegség kialakulására. PLoS ONE 11 (5): e0155163. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155163

Szerkesztő: Pavel Strnad, RWTH Aachen, NÉMETORSZÁG

Fogadott: 2016. február 5 .; Elfogadott: 2016. április 25 .; Közzétett: 2016. május 11

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a munkát a BioPersMed [COMET K-projekt 825329] támogatta, amelyet a Szövetségi Közlekedési, Innovációs és Technológiai Minisztérium (BMVIT), a Szövetségi Gazdasági és Munkaügyi Minisztérium, a Szövetségi Gazdasági, Családügyi és Ifjúsági Minisztérium (BMWA) finanszírozott./BMWFJ), a stájerországi üzleti promóciós ügynökség (SFG) (VHIF és KS), valamint a Szövetségi Oktatási és Kutatási Minisztérium által az [O1KU1216F] (AKK) projektszám alatt. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Hagyományosan a diéta indukálta NAFLD és AFLD hím C57BL/6, CD-1 és 129Sv WT egér törzsek a leggyakrabban használtak [26–28, 30, 34, 47]. Ezáltal az egerek neme és genetikai meghatározói befolyásolhatják hajlamukat a NAFLD/AFLD kialakulására. Nemek szerinti különbségekről számoltak be a NAFLD fejlődésében egerekben. A hím rágcsálók fokozottan hajlamosak a NAFLD kifejlesztésére, ami ellentétes az emberi megfigyelésekkel, ahol úgy tűnik, hogy a nőknél gyakoribb a NAFLD [9, 49–51]. A NAFLD fejlődését befolyásoló C57/BL/6 egerek ismert genetikai meghatározói magasabb szterin szabályozó elem-kötő protein-1c (SREBP-1) és sztearoil-koenzim A deszaturáz 1 (SCD-1) expresszióját és aktivitását tartalmazzák [27]. Ezenkívül úgy tűnik, hogy a C57BL/6 egerek hajlamosabbak a NAFLD-szerű fenotípusra, a makrofág-aktivációt magában foglaló mechanizmusok révén [52].

Anyagok és metódusok

Egerek és diéták

Az állati protokollt (BMWF-66.010/0081-II/3b/2012) jóváhagyta a grazi Orvostudományi Egyetem Állatvédelmi Bizottsága és az Osztrák Szövetségi Tudományos és Kutatási Minisztérium Ref. II/3b. Az egerek elhelyezését táplálékkal és vízzel végezték ad libitum segítségével, és a grazi orvosi egyetem állatjóléti politikájának megfelelően követték nyomon.

A hím C57BL/6N (C57BL/6), 129S2/Sv (129Sv) és CD-1 egereket (Charles River Laboratories, Németország) egyedileg szellőztetett ketrecekben csoportosítottuk, egy specifikus kórokozótól mentes (SPF) létesítményben, 12 órán át. világos és sötét ciklus. Az akklimatizációs periódus után a 8-10 hetes egereket súly szerint egyeztettük és négy csoportra osztottuk (n = 5). Az első csoport folyékony Lieber DeCarli magas zsírtartalmú étrendet (HF) kapott (46,23% zsír: 28,17% kukoricaolaj, 16,49% olívaolaj, 1,57% sáfrányolaj) (Ssniff, Németország). A második csoportot etanollal kezeltük folyékony Lieber DeCarli diéta (EtOH) etetésével, a harmadik csoport pedig folyékony Lieber DeCarli magas zsírtartalmú étrendet kapott etanollal (HF + EtOH) kiegészítve [25]. Az egereket a folyékony étrendhez igazítottuk, mielőtt az etanol koncentrációját minden harmadik napon 1% -kal, végül 5% -ra EtOH-ra és 2,5% -ra HF + EtOH-ra emeltük. Az egerek HF-t kaptak 7 hétig, EtOH-t 12, 14 és 16 hétig, és HF + EtOH-t 5, 7 és 9 hétig. A negyedik csoportot az akklimatizációs periódus után feláldoztuk, és kezeletlen csoportként szolgált. A szövet- és vérminták összegyűjtése céljából az egereket izoflurán inhalációval altattuk és lefejeztük. A szövetmintákat pillanatszerűen lefagyasztottuk és folyékony nitrogénben tároltuk. További máj-alikvot részt 10% -os formalinban rögzítettünk.

A szérumparaméterek biokémiai elemzése

A szérumot centrifugálással gyűjtöttük (5000 g, 15 perc, szobahőmérsékleten). Az aszpartát-aminotranszferázt (AST), az alanin-aminotranszferázt (ALT), a szérum TG-t, a szérum koleszterint (Roche Diagnostics, Svájc) és a szérum szabad zsírsavakat (FFA) (Wako Chemicals GmbH, Japán) kereskedelmi vizsgálati készletek felhasználásával határoztuk meg a gyártó utasításainak megfelelően.

Szövettani elemzés

A formalin rögzítése után a májat paraffinba ágyaztuk, és 3 μm-nél metszettük. Az összes szeletet hematoxilinnal és eozinnal (HE) festettük mikroszkópos vizsgálat céljából, amelyet két testület igazolt patológus (J. H., C. L.) vaks vizsgálat során végzett. Ezenkívül a fagyasztott májmintákat 6 μm-nél metszettük és olajvörös O-val festettük a máj lipidfelhalmozódásának szemléltetése céljából.

A különböző táplálkozási rendek által okozott májhatások kvantitatív értékeléséhez steatosis, gyulladás és fibrózis került besorolásra, analóg módon a NASLD-CRN NAFLD aktivitási pontszámával (NAS) [10].

A májgyulladás paramétereinek immunvizsgálata

A mélyhűtött tartósított májmintákat homogenizáltuk, a felülúszókat kétszer centrifugáltuk (16 000 g, 10 perc, 4 ° C), majd az összes fehérjekoncentrációt DC Protein Assay Kit-rel (Bio-Rad, USA) mértük. Az interleukin 6 (IL-6), a tumor nekrózis faktor α (TNFα) és a máj monocita kemo attraktáns protein-1 (MCP-1) tartalmát ProcartaPlex TM Immunoassay-vel (eBioscience, USA) mértük a gyártó utasításai szerint. Így a máj homogenizátumok felülúszóit 10 mg/ml teljes fehérjekoncentrációra hígítottuk, és ebből a hígításból 25 μl-t használtunk a mérésekhez.

A lipidosztályok elemzése

A lipidek extrakcióját és a vékonyréteg-kromatográfia (TLC) elemzését a korábban leírtak szerint végeztük, kénsav/etanol keverék alkalmazásával a kimutatáshoz [54]. Röviden: 15 mg fagyasztva szárított szövetet diszpergálunk hexán/2-propanol [3: 2 (v/v)] -ben 10 percig, és 4 ° C-on centrifugálunk, 10 000 g 10 percig. A nitrogénáramban szárított felülúszót kloroform/metanol [1: 1 (v/v)] -ben oldjuk, és a vékonyréteg-kromatográfiai lemezekre visszük, amelyeket kloroform/metanol [2: 1 (v/v)] elegyével előmosunk. 110 ° C-on 1 órán át aktiváljuk. A mintákkal és standard anyagokkal töltött TLC lemezeket először a lemezek közepéig fejlesztettük ki kloroform/metanol/ecetsav/víz elegyben [50: 30: 8: 3 (v/v/v/v)], majd teljesen kifejlesztettük. heptán/dietil-éter/ecetsav [70: 30: 2 (v/v/v)]. Az egyes sávok területi sűrűségét az ImageJ szoftver segítségével számszerűsítettük.

Zsírsavprofil elemzés GC-MS módszerrel

A gyorsfagyasztott és liofilizált májszövet koleszterint és zsírsavakat (FA) a zsírsav-metil-észter (FAME) módszerrel extraháltuk, és a korábban publikált GC-MS-szel mértük [55].

statisztikai elemzések

Minden eredményt mediánban fejezünk ki interkvartilis tartományban, ha másképp nem jelöljük. Az adatok elemzéséhez Kruskal-Wallist, majd a kiválasztott oszloppárok Dunns-tesztjét vagy Mann-Whitney U-tesztet alkalmaztunk. A különbségeket az 1. ábra P-értékei szempontjából szignifikánsnak tekintették.

(A-C) A HF, EtOH és HF + EtOH csoportok és a különböző egér törzsek tömegének növekedését hetente kétszer ellenőriztük, aminek következtében a kezelés indukálta a súly növekedését a C57BL/6 és a CD-1-ben, de a 129Sv egerekben nem. (DF) A megfelelő törzsek és táplálkozási csoportok zsír-test aránya, amely megnöveli a szubkután, valamint a teljes zsír és test súly arányát a C57BL/6 és a 129Sv egerekben, míg a CD-1 egerek csak kisebb változásokat mutatnak a HF, EtOH, és HF + EtOH táplálás. Minden kísérlet végén a szubkután és a zsigeri zsírszöveteket boncoltuk, súlyoztuk és a szubkután zsírokat, a zsigeri zsírokat, valamint az összes zsír és test arányt kiszámítottuk. Medianák vannak interkvartilis tartományban, és a releváns szignifikáns különbségeket csillag jelöli (Kruskal-Wallis, majd a kiválasztott oszloppárok Dunns-tesztje, a 2. ábra P-értékei. A TG szérumszintje, az összes koleszterin, az FFA és a májfunkció, az AST transzaminázok és a C57BL/6, CD-1 és 129Sv egerek összes kezelési csoportjának ALT-ja.

(AE) A C57BL/6 egerek metabolikus szérumparaméterei és transzamináz szintje szignifikáns növekedést mutatott a HF, az EtOH 14 és a HF + EtOH 9 héten át etetett egerek szérum koleszterinszintjében és a szérum TG csökkenését az EtOH-val etetett egerekben 12 hétig kezeletlen egerekhez képest. (F-J) A kezeléssel kezelt CD-1 egerek szérum metabolikus és májparamétereinek változásai 14 héten át HF-vel és EtOH-val etetett egereknél szignifikánsan megnövekedett összkoleszterin-szintet eredményeztek a kezeletlen társakhoz képest. (K-O) A metabolikus és májparaméterek szérumkoncentrációi a 129Sv egerekben a HF csoportban megnövekedett koleszterinszintet, a HF és EtOH táplált egerekben megnövekedett AST értéket mutattak a kezeletlen csoporthoz képest. Az interkvartilis tartományban lévő mediánok láthatóak, és a releváns szignifikáns különbségeket csillag jelöli (Kruskal-Wallis, majd a kiválasztott oszloppárok Dunns-tesztje, a 3. ábra P-értékei, a máj szövettana HE és Oil Red O festéssel, valamint a NAS mennyiségi meghatározása étrend által kiváltott májbetegség.

A C57BL/6 máj szövettani vizsgálata mikrovezikuláris és enyhe makrovesikuláris steatózist mutatott ki HF és HF + EtOH táplált egerekben. A ballonozásra hasonlító sejteket figyeltek meg HF-etetéskor és ezen felül a C57BL/6 egerek májában, amelyeket HF + EtOH-val tápláltak 9 héten keresztül, és mindkét diétás csoport szignifikánsan magasabb NAS-t mutatott a kezeletlen csoporthoz képest. Az EtOH-val táplált csoportok fokozott steatosist és gyulladást mutattak, de nem voltak ballonok (3. ábra és 1. táblázat).

CD-1 egerekben az étrend a NAFLD/AFLD kisebb jellemzőit eredményezte, mivel szinte semmilyen steatózist nem figyeltek meg. A léggömbözés szintén nem történt meg, és a gyulladásos sejtek ritkák voltak. A kezeletlen csoporthoz képest a NAS csak abban a csoportban nőtt szignifikánsan, hogy 16 hétig etanollal etették, míg ez elsősorban a megnövekedett gyulladásnak volt köszönhető (3. ábra és 1. táblázat).

Ezzel szemben a 129Sv máj mérsékelt steatózist mutatott, amely szinte az összes májban megtalálható a három különböző étrendi csoportból. A ballonozást azonban a 129Sv egerek egyik májában sem mutatták ki. A gyulladásos sejtek beszivárgását jól megfigyelték az EtOH és HF + EtOH táplált csoportokban, és a legrövidebbtől a leghosszabbig tartó táplálkozási időig emelkedett (3. ábra és 1. táblázat).

Ezenkívül egyik törzsfibrózisos kezeletlen vagy kezeléssel kezelt egérben sem figyeltek meg.

A C57BL/6, CD-1 és 129Sv egerekben összehasonlított NAS és táplálkozási rendek statisztikai összefüggését az S1 táblázat mutatja (S1 táblázat).

Gyulladásos válasz magas zsírtartalmú és etanollal táplált egerek májában

Az étrenddel kezelt egerek májának gyulladásának számszerűsítéséhez az interleukin-6-ot (IL-6), a tumor nekrózis faktor alfát (TNFα) és a monocita kemoattraktáns protein-1-t (MCP-1) mértük a májszövetben, és az eredményeket a 4. ábra mutatja. Az IL-6 szint a kezeletlen C57BL/6 egerekben legalább 1,3-szor magasabb volt, mint a különböző táplálkozási csoportok egereiben, ami összhangban van a korábbi jelentésekkel, amelyekben a máj magas IL-6 szintje egészséges májnak felelt meg, szemben a megnövekedett szisztémás IL-6, amely a NAFLD/AFLD-hez kapcsolódik [48, 56–58]. A HF és HF + EtOH 7 hetes táplálása szignifikánsan csökkentette a C57BL/6 egerek IL-6 szintjét a kezeletlen egerekhez képest (4A. Ábra). A TNFa kulcsfontosságú szerepet játszik a steatohepatitis kialakulásában a fibrózis fokozásával [57, 58], és a máj TNFa jelentősen megnőtt az EtOH-val táplált C57BL/6 egerekben a kezeletlen egerekhez képest (4A. Ábra). Az MCP-1 fontos a máj monocita/makrofág rekrutációja szempontjából, és feltételezik, hogy gyulladást indít a NAFDL/AFLD-ben [32, 59]. A 14 héten át etanolt táplálkozás esetén a máj MCP-1 értéke szignifikánsan megemelkedett a C57BL/6 egerekben, szignifikánsan a kezelés nélkül (4A. Ábra).

A gyulladás markereit a megfelelő egér törzsek és étrendi csoportok összes májának májhomogenátumaiból határoztuk meg. (A) C57BL/6 egerek, (B) CD-1 egerek és (C) 129Sv egerek IL-6, TNFα és MCP-1 szintje, ami gyulladásos választ jelez C57BL/6 és 129Sv egerekben csökkent máj IL- 6 és megnövekedett máj TNFα és MCP-1 koncentráció az adagolási rend miatt. Megadunk interkvartilis tartományú mediánokat, és a releváns szignifikáns különbségeket csillag jelöli (Kruskal-Wallis, majd Dunns-teszt a kiválasztott oszloppárokról, az 5. ábra P-értékei. A kezeléssel kezelt CD-1 és 129Sv egerek máj lipidprofiljának meghatározása.

A máj lipidtartalmát a májból meghatároztuk a CD-1 és 129Sv egerekkel táplált sémákból, félkvantitatív kromatográfiás módszerrel, és a kezeletlen társaikhoz viszonyítva relatív mennyiségben mutatjuk be. (A) A TG szint mindkét egér törzsben megemelkedett, megnövekedett máj TG tárolás volt 129Sv egerekben, összehasonlítva a CD-1 egerekkel. (B) A szabad koleszterin csak a kezelési séma szerint kezelt 129Sv egerek némelyikében változott, beleértve a csökkent szabad koleszterinszintet az EtOH etetőcsoportban 14 hétig és a szabad koleszterinszint növekedését a HF + EtOH-ban 7 és 9 hétig táplálva. (C) A CE és a (D) CER szintet mindkét törzs minden tápláló csoportjában megnövelték, a 129Sv egerekben magasabb volt a CE-tartalom, mint a CD-1 egerekben. (E) A PC-szintek nem változtak a CD-1 egerekben, míg a 7 hétig tartó HF-etetés megnövekedett PC-tartalmat, a HF + EtOH táplálás 7 hétig pedig csökkent PC-szintet okozott. (F) A PE-tartalom mindkét törzsben hasonló volt, a kezeletlen és a kezeléssel kezelt egerek között nem volt változás. Az értékeket standard deviációjú átlagként adjuk meg, és a releváns szignifikáns különbségeket csillag jelöli (Mann-Whitney U teszt, P értékek a 6. ábrán). A kezeléssel kezelt 129Sv egerek májának FA összetétele.