A látható implantátum elasztomer címkék értékelése a zebrafish-ban (Danio rerio) Biology Open

Biológia nyitva

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
Levelezés céljából: [email protected]

Összegzés

Megvizsgáltuk a látható implantátum elasztomer (VIE) címkézési rendszer használatát zebrafish (Danio rerio). Két hátsó úszó orientációt (vízszintes és függőleges) a háti uszony alján teszteltünk a címkék megtartására, a tag tagolódására és arra, hogy a VIE tagek befolyásolták-e a fiatalkorú zebrafish növekedését és túlélését (1–4 hónappal a kikelés után). Hat címke helyét (has, anális uszony alapja, farok kocsánya, háti uszony alapja, mellkasi uszony alapja, isthmus) és 5 címke színét (sárga, piros, rózsaszín, narancs, kék) értékelték a VIE címke alkalmazásának megkönnyítése és a címke láthatósága érdekében felnőtt zebrafish. Hosszú távú retenciót (1 év) és többszörös címkézési helyeket (a háti uszony és a mellúszó bázis jobb és bal oldala) vizsgáltunk felnőtt zebrafish-ban. Végül a rekombinációs aktivációs gén 1 -/- (rag1 -/-) zebrafish túlélését értékeltük a VIE jelölés után.

A legjobb címke elhelyezkedése a háti uszony alapja volt, a leglátványosabb címke színe pedig rózsaszín volt. A fiatalkorú zebrafish növekedési ütemét a VIE jelölés nem befolyásolta. A víz növekedésének korai szakaszában (a kikelés után 1-2 hónappal) vízszintes jelölés ajánlott. A VIE-címkéket 1 évig megtartottuk, és a jelölés nem befolyásolta a hosszú távú növekedést és a túlélést. A rag1 -/- zebrafish-ban a VIE jelölésével nem társult mortalitás.

A VIE címkézési rendszer kiválóan alkalmas kisméretű zebrafishoz. Amikor ismeri az eljárást, 120 felnőtt zebrafish címkézhető meg egy óra alatt. Nem növeli a felnőtt zebrafish halandóságát, és nem zavarja a fiatalkorú vagy felnőtt zebrafish halak növekedését.

Bevezetés

Anyagok és metódusok

Állatgondozás

A vad típusú és rag1 -/- mutáns zebrafish-t (tübingeni törzs) a Mississippi Állami Állatorvos-egészségügyi Főiskola (MSU-CVM) specifikus kórokozótól mentes (SPF) halkeltetőjében helyezték el (Hohn és Petrie-Hanson, 2007; Petrie-Hanson és mtsai., 2009). A halakat a http://www.cvm.msstate.edu/zebrafish/index.html címen közzétett módosított standard protokollok szerint szaporították. A Mississippi Állami Egyetem intézményi állatgondozási és -használati bizottsága jóváhagyta az összes kísérleti állat-protokollt.

Valamennyi vizsgálatban a zebrafish-t altattuk 110 mg/l pufferolt tricaine-metán-szulfonátban (MS222). A látható implantátum elasztomer címkéket inzulin fecskendővel injektálták. Az érzéstelenítésből való kilábalás után a halakat átfolyóvízrendszerben (kb. 0,5 liter/perc) 20 literes tartályokba helyeztük, és 27 ± 1 ° C-on tartottuk. A tartályokat levegőztették, hogy az oxigénszint 6,0 és 6,5 mg L -1 között legyen. Mivel a tűsebek gyógyulása több napot igényel, a halakat a VIE injekció beadása után legalább 10 napig nem kezelték (Northwest Marine Technology, Inc., 2006, „Kis halak címkézése látható implantátum elasztomerrel”, http: // www .nmt.us/support/appnotes/ape03.pdf). Valamennyi halat ugyanazon körülmények között tartottuk minden kísérlet során, és naponta háromszor figyeltük meg őket a címkék elvesztése és egészségi állapota szempontjából. A halandó halakat 340 mg/l MS222-vel eutanizálták, és a mortalitást a kísérlet időtartama alatt feljegyezték.

VIE címkék

Kézi injekciós készletet (60 ml) a VIE címkékhez a Northwest Marine Technology, Inc.-től (Shaw Island, WA, USA, http://www.nmt.us) vásároltunk. Az elasztomert a készlet utasításainak megfelelően állítottuk elő minimális térfogatra (kis mennyiségű VIE keverésével) (Northwest Marine Technology, Inc., 2011, 'Manuális elasztomer befecskendező rendszerek. Utasítások 10: 1 látható implantátum elasztomerhez', http: //www.nmt .us/products/vie/manual_vie_instructions.pdf). Mindegyik kevert adagból kis mennyiségű elasztomert expresszálunk alumíniumfóliára a megfelelő kikeményedés meghatározása érdekében. A VIE-címke elvesztésének megakadályozása érdekében a fecskendő tűjét 2 mm-rel mélyebbre illesztették a szövetbe, majd az elasztomer címke, az elasztomer kívánt hosszát kifejezték, és a tű körülbelül 1 mm-ig behúzódott az injekció beadásának helye előtt, és a tűt kihúzták a távozó halakból. legalább 1 mm-rel az injekció beadása után elasztomer nélkül. A 4. és 5. kísérletben VIE injekciót rögzítettünk. A VIE befecskendezési ideje magában foglalja a hal befogását, a halak felcímkézését és visszaengedését a tartályba.

1. próba: VIE címke helye

Az optimális címkézési helyek meghatározása érdekében 10 felnőtt zebrafish csoportba ültettek be egy 4 mm-es rózsaszín elasztomer csíkot az alábbi helyek egyikén: has, anális uszony alapja, farok kocsánya vagy háti uszonya alapja és 2 mm rózsaszín elasztomer csíkkal a mellkasi uszony tövénél vagy az isthmusnál (1. ábra). A halcsoportokat 20 napig tartottuk, majd az egyes helyeken meghatároztuk a címke megtartását. A címke elhelyezkedését az elasztomer alkalmazásának könnyűségével (könnyű/nehéz), a címke megtartásával (a címke megtartva/a címke részben megtartva/a címke elveszett) és a sebgyógyulással (teljesen meggyógyult/nem teljesen meggyógyult) értékelték.

A VIE címkéket a zebrafish hat pozíciójában értékeltük, a nyilakkal jelezve.

2. próba: VIE címke színe és láthatósága

Az optimális címkeszín meghatározásához 2 injekciós helyet (dorzális uszony alap és mellkasi uszony alap) külön-külön értékeltünk, helyenként és színenként 10 felnőtt zebrafishal (sárga, piros, rózsaszín, narancs, kék). A halakat körülbelül 4 mm-es, egyszínű elasztomerrel ültettük be a hátsó uszony aljára, vagy körülbelül 2 mm-es elasztomerrel, egy színnel a mellkasi uszony alján. A halcsoportokat 20 napig tartottuk, majd az egyes helyeken meghatároztuk a címke színének láthatóságát.

3. kísérlet: Növekedési vizsgálat

Az elasztomer címkék töredezettsége, rossz láthatósága és elvesztése valószínűleg a halak fő növekedési szakaszában fordul elő (Astorga et al., 2005). A zebrafish-ban a növekedési fázis a kikelés és a kikelés utáni 3 hónap között van (mph). A VIE-címkéket 1 mph, 2 mph és 3 mph juvenilekbe injektáltuk, és a zebrafish-t értékeltük a tag tagoltsága (a fragmensek száma), a címke megtartása (a címke megmaradt/az elveszett tag), valamint a hal növekedése, súlya és túlélése szempontjából. Mivel a halak hossza és szélessége megnő, a hátsó uszony alján lévő vízszintes és függőleges címkéket értékeltük. Minden kezeléshez 30 halat injektáltunk vízszintes (5 mm) VIE címkékkel, 30 halat függőleges (3 mm) VIE címkékkel injektáltunk, és 30 halat szolgáltunk kontrollként. A hal hosszát és súlyát a kísérlet elején és végén határoztuk meg. Tartályonként tíz halat tartottak egy hónapig.

4. kísérlet: Hosszú távú retenciós vizsgálat

A VIE-jelölések hosszú távú retenciójának meghatározásához 50 nőstény és 50 hím felnőtt zebrafish-ot injektáltunk a hátsó uszony aljára rózsaszín elasztomerrel, és 50 nőstény és 50 hím halat szolgáltunk kontrollként. A hal hosszát és súlyát a kísérlet elején és végén határoztuk meg. Az injekciós időt és az elasztomer mennyiségét feljegyeztük. A halakat 1 évig tenyészállatként tartottuk, és havonta kétszer ivartalanítottuk. A túlélést és a címke megőrzését egy év múlva rögzítettük.

5. próba: Több címkézési webhely

A több helyen jelölt felnőtt zebrafish túlélésének és növekedésének meghatározása érdekében 10 nőstény és 10 hím felnőtt (4 mph) zebrafish-t injektáltunk 2 helyre (a hátsó uszony jobb és bal oldalára), 10 női és 10 hím felnőtt (4 mph) zebrafish-t. injektálva 3 helyre (a hátsó uszony és a mellúszó uszony jobb és bal oldala), és 10 hal szolgált kontrollként. A halakat 10 hal/20 L. sűrűségben tartottuk. A hal hosszát és súlyát a kísérlet elején és végén határoztuk meg. Az injekció időtartamát feljegyeztük, és a címke megtartását 1 hónap után meghatároztuk.

6. próba: A rag1 -/- zebrafish túlélése

Az immunszuppresszált rag1 -/- zebrafish túlélésének meghatározásához 30 felnőtt (4 mph) rag1 -/- és 30 vad típusú zebrafish-ot injektáltunk VIE-címkékkel a hátsó uszony alján. Tíz halat/tartályt tartottak 1 hónapig és értékeltek.

statisztikai módszerek

Az egyes kísérletek kezelési csoportjait a fentiekben ismertettük, és az 1. táblázatban foglaltuk össze. A tartályok számát a kezelésenként és a halak számát a tartályban a fentiekben írtuk le. A csoportok közötti mortalitási adatokat és a címkék megőrzését kontingenciatáblázat-analízissel elemeztük chi-square függetlenségi teszt alkalmazásával, összehasonlítva a szignifikancia szintjével P≤0,05-nél. A növekedési adatokat egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük, post-hoc Tukey-analízissel, többszörös összehasonlítás céljából, szignifikancia szinten P≤0,05-nél. A tag tagolódást független minta T-teszttel elemeztük, szignifikancia szintje P≤0,05. A statisztikai elemzéseket az SPSS for Windows 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) alkalmazásával végeztük.

Eredmények

1. próba: VIE címke helye

Az 1. kísérletben értékelték az injekció beadásának helyén történő gyógyulást, az alkalmazás könnyűségét és az elasztomer retenciót. A 2. táblázat áttekintést nyújt a VIE címkék összes tesztelt helyéről. Az isthmus az injekció beadásának nehéz helyszíne volt, és csak kis mennyiségű elasztomer adható be. Minden elasztomer megmaradt, de nehezen volt látható. A mellkasi uszony alapja megtartotta az összes VIE-címkét is, de nehéz volt injektálni, és ha gondosan nem történt meg, halálosan megsérthette a halakat. A hátsó uszony elasztomer injekciói könnyűek voltak, az összes címkét megtartották, és az injekció helye jól meggyógyult. Ezért a hátsó uszony alapja a zebrafish-ban történő VIE-címkézés előnyös helye. Összességében a legjobb injekciós helyek a háti uszony alapja, majd a mellkas uszonya volt. A hátsó és mellkasi uszonyban lévő összes címkét megtartottuk 4 hónappal az első injekciók után.

2. próba: VIE címke színe és láthatósága

Amikor összehasonlítottuk a VIE jelzőszíneit (a hátsó uszony és a mellüregi uszony alapjainál), minden tagot megtartottunk, és az injekció helyei meggyógyultak, amikor a halakat 20 nap után értékeltük. A sárga és a narancssárga, valamint a rózsaszín és a vörös VIE címkéket nehéz volt megkülönböztetni egymástól, a kék pedig nem volt látható a környezeti fényben, viszont UV fény hatására fluoreszkált. A címkék láthatósága jobb volt a mellkasi uszony alján, de a halakat el kellett távolítani a vizsgálandó vízből, míg a hátsó uszony alján lévő címkék láthatók voltak, anélkül, hogy a halakat eltávolították volna a vízből. A legkevésbé látható színek rangsora a rózsaszín, a piros, a narancs, a sárga és a kék volt.

3. kísérlet: Növekedési vizsgálat

A fiatalkori zebrafish-t lemértük (átlag ± sd), és a hosszúságot (átlag ± sd) mértük a kísérlet kezdetén (kezdetben) és a kísérlet végén (vízszintes, függőleges, kontroll). Az 1 mph, 2 mph és 3 mph kísérletek végén nem volt szignifikáns súlykülönbség (A panel). Az 1 mph, 2 mph és 3 mph kísérlet végén nem volt szignifikáns különbség a hosszúságban (B panel). A fiatalkorú zebrafish növekedési ütemét a háti uszonyon történő címkézés nem befolyásolta. Chi négyzet teszt P> 0,05 (mph = hónapok a kikelés után).

Összefoglalva, a fiatalkorú zebrafish növekedési ütemét nem befolyásolta a dorzális uszonyon történő jelölés (2. ábra). A vízszintes címkék megtartása jobb volt, mint a függőleges címkék megtartása a hal növekedésének korai szakaszában (1–2 mph).

4. kísérlet: Hosszú távú retenciós vizsgálat

Négy hónapos nőstény zebrak beültetésekor a halak átlagos súlya 0,7 ± 0,03 g volt. Egy év elteltével az átlagos súly 1,1 ± 0,12 g-ra nőtt; ami összehasonlítható a kontrollhalak 1,0 ± 0,16 g átlagos tömegével. A túlélési arány 96% volt a jelölt nőknél és 94% a nem jelölt nőstény zebrafish-knál. A hím zebrak hal súlya 0,45 ± 0,05 g 4 mph sebességnél. Egy év elteltével az átlagos tömeg 0,63 ± 0,07 g-ra nőtt; ami összehasonlítható a kontrollhalak 0,64 ± 0,12 g átlagos tömegével. A jelölt hím zebrafish túlélési aránya 90% volt, szemben a nem jelölt hím halak 94% -ával. Valamennyi hal megőrizte VIE címkéjét a vizsgálat ideje alatt. A címkézési időt és az elasztomer felhasználást rögzítettük az elasztomer anyagpazarlás minimalizálása érdekében. Átlagosan 22 ± 3 másodpercbe telt, amíg egy nőstény zebrafish-t 5 mm-es VIE szalaggal ellátott elasztomerrel injektáltak, és 29 ± 6 másodpercig tartott ugyanez az eljárás a hím zebrafish-ban. Összesen 0,1 ml VIE elasztomert használtunk 50 hal egy jelöléssel történő megjelölésére. Összefoglalva, a címkézés nem befolyásolja a hosszú távú növekedést és túlélést. A halak termékenységét a VIE-címkék nem befolyásolták, és átlagosan 120 felnőtt zebrafish-t lehet beadni egy címkével egy óra alatt.

5. próba: Több címkézési webhely

6. próba: A rag1 -/- zebrafish túlélése

A VIE címkék biztonságosan használhatók immunhiányos rag1 -/- zebrafish címkézésére; az összes címkéző kezelés 100% -os túlélést mutatott.

Vita

A VIE módszert sikeresen alkalmazták olyan kishalaknál, mint a mummichogs (Skinner et al., 2006), a kis sügér (Perca fluviatilis) és a közönséges zaklató (Gobiomorphus cotidianus) (Goldsmith et al., 2003). A nagyobb halakba könnyebben beadható helyeket nehéz volt beinjektálni a zebrafish-ba. Az injekció beadását követően azonban a zebrafish halaink, különösen a felnőttek, túléltek és jó a retenciós idejük. Csökkentett jelölésmegtartást figyeltek meg a fiatalkorú zebrafish-ban és a halakban, amelyeket több tag-szal injektáltak. A VIE-címkék alkalmazása olyan fajokban, amelyek továbbra is kicsiek maradnak, kevesebb kihívást jelent, mint azoknak a halaknak a jelölése, amelyek jelentősen növekedni fognak a címke használata során (Northwest Marine Technology, Inc., 2006, „Kis halak címkézése látható implantátum-elasztomerrel”). Kis trópusi halakban (-/- halak. Javasoljuk a mutáns zebrafish törzsekben a túlélés meghatározását, mielőtt VIE-címkéket használnának a kísérletekben.

Összességében az eredményeink azt sugallják, hogy a VIE címkézési módszer alkalmas a zebrafish-ra, akár 1 hónapos korban is. A hátsó uszony alján injektált rózsaszínű VIE címkéket megtartottuk, és hosszú távon a leglátványosabbak maradtak. A látható implantátum elasztomer címkézés kiváló azonosítási erőforrásokat biztosít a zebrafish és más kishalak számára a házon belüli kutatási létesítményekben.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetet mondanak Dr. Robert Wills-nek az útmutatásért és a statisztikai értékeléshez nyújtott segítségért.

Finanszírozás

Ezt a kutatást a Mississippi Állami Egyetem Állatorvostudományi Főiskolája finanszírozta.

Lábjegyzetek

Szerző közreműködései C.H., L.P.-H. megtervezte és megtervezte a kísérleteket. C.H. elvégezte a kísérleteket, elemezte az adatokat és megírta az írást. L.P.-H. átdolgozta és szerkesztette a lapot.

Versenyző érdekek A szerzőknek nincsenek versengő nyilatkozattételi érdekeik.