A magas zsírtartalmú metionin- és kolinhiányos étrend okozta májkárosodás összehasonlító vizsgálata három különböző forrásból származó ICR egerekben

Absztrakt

Bevezetés

Az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) egy máj metabolikus rendellenesség, amely nem jár alkoholfogyasztással. Fontos, hogy az évek során az elhízás aránya az életmód és az étkezési szokások változása miatt nőtt, és ennek eredményeként a NAFLD sok országban a krónikus májbetegségek gyakori okává vált [1]. A NAFLD a májbetegségek széles spektrumát foglalja magában az egyszerű steatosistól az alkoholmentes steatohepatitisig (NASH), a fibrózisig és a cirrhosisig, és végül a hepatocelluláris carcinomáig és a májelégtelenségig [2]. Az egyszerű steatosis általában nem tekinthető súlyos állapotnak. A NASH azonban cirrhosissá vagy májrákká fejlődhet, amelyek végül végzetesek lehetnek [3]. Bár számos vizsgálatot végeztek, a NAFLD kóros mechanizmusai még tisztázatlanok és a terápiás gyógyszerek kidolgozása még folyamatban van. A NAFLD széles spektruma megnehezíti a betegség pontos stádiumának azonosítását, és a nagyon lassan progresszív betegségek jellemzőit nehéz meghatározni a klinikai kutatások során [4]. Ezért az emberi NAFLD-t összefoglaló állatmodell fontos információkkal szolgálhat a betegség patogenezisének meghatározásához és a különféle gyógyszerek terápiás hatásainak vizsgálatához [5].

A NAFLD állatmodelljeit az etiológia szerint nagyrészt genetikailag módosított és táplálkozási (étrendi) modellek közé sorolják. Általánosságban elmondható, hogy a NAFLD étrendi indukálása kísérleti állatokban az emberben megfigyelt állapotok, például a metabolikus szindróma reprodukálásának előnyben részesített módszere, míg a génmanipulált állatokat részletes mechanisztikus vizsgálatokhoz használják [6]. Mivel az ICR egerek alacsony szintű agresszióval és erős szaporodási képességgel rendelkeznek, világszerte számos betegség kutatására használják őket, különféle területeken, például onkológia, fertőzések és farmakológia területén [7].

Anyagok és metódusok

Állatok és kezelés

Nyolc hetes hím ICR egereket három különböző forrásból nyertünk. Korl: Az ICR egereket a NIFDS (Cheongju, Korea) laboratóriumi és állati erőforrások osztálya szívesen látta el. Az ICR egerek másik két csoportját az Egyesült Államok (A: ICR) és Japán (B: ICR) beszállítóktól vásároltuk. Minden állatkísérletet a Pusan Nemzeti Egyetem állatkísérleti és felhasználási bizottsága jóváhagyott (PNU-2018-1994). Az alapvető feltételek, például a létesítmény környezete és az étrend a korábban leírtak voltak [16]. Az egereket 22 ± 2 ° C-ra és 55 ± 5% -os páratartalomra adaptáltuk az étrendben 12 órás világos/sötét ciklusban 1 hétig a felhasználás előtt. Véletlenszerűen két csoportra osztották őket 6 hétig különböző étrendekkel: normál étrend (kontroll) vagy HFMCD, amely 60 kcal% zsírból, hozzáadott kolin és 0,1% metioninból állt. A májból és a veséből mintát vettek az 1. és a 6. héten.

Vér biokémiai elemzése

Vérmintákat vettünk minden egér hasi aortájából; a szérumokat BD Microtainer vérvételi csővel (BD Life Sciences, Franklin Lakes, NJ, USA) választottuk el, és az alanin-aminotranszferáz (ALT), az aszpartát-aminotranszferáz (AST) és a laktát-dehidrogenáz (LDH) aktivitásának mérésére használtuk. Az ALT-t és az AST-t Reitman és Frankel protokolljaival [17], az LDH-t pedig a Dogen-től (Szöul, Korea) vásárolt kereskedelmi készlet segítségével mértük. Az eredményeket spektrofotométerrel számszerűsítettük Multiskan GO olvasóval (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).

Szövettani elemzés

A máj bal oldali lebenyét felszeleteltük és 4% paraformaldehiddel rögzítettük. A szöveteket paraffinba ágyazottuk, és egy 5 μm-es metszetet festettünk hematoxilinnel és eozinnal (H&E), hogy megkülönböztessük a magokat és a citoplazmát.

RNS tisztítás és kvantitatív RT-PCR

A kvantitatív RT-PCR-t a korábbiakban leírtak szerint határoztuk meg [16]. A teljes RNS-t a máj-lizátumból izoláltuk a Direct-zol RNS kit segítségével (Zymo Research, Orange, CA, USA). A cDNS-t iScript cDNS szintézis rendszerrel szintetizáltuk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). A kvantitatív RT-PCR-t a SensiFAST SYBR qPCR keverékkel (Bioline, London, Egyesült Királyság) végeztük a gyártó protokollja szerint. A génexpresszió értékeit normalizáltuk a GAPDH. Az alapozó szekvenciákat az 1. táblázat tartalmazza.

Statisztikai analízis

Valamennyi adatot átlag ± standard deviációval (SD) fejeztük ki. A statisztikai szignifikanciát Student's segítségével határoztuk meg t-teszt, és o

Eredmények

A HFMCD diéta hatása a testsúly változására

A magas zsírtartalmú étrend elhízást és inzulinrezisztenciát okoz, de a NASH létrehozásához 30 hétre van szükség [14]. Az MCD diétát gyakran használják a NASH kiváltására a máj steatosisának és gyulladásának kiváltásával 4 héten belül, de súlyos súlyvesztés jellemzi [13]. Ezért HFMCD diéta alkalmazásával megkíséreltük a NAFLD/NASH indukálását. A 6 hetes testtömeg-változások nem mutattak szignifikáns különbséget a kontroll és a HFMCD-vel táplált egerek között (1. ábra).

A HFMCD hatása a Korl testtömeg-változásaira: ICR (a), A: ICR (b) és B: ICR (c) egerek. Az ICR egereket kontroll (CON) vagy magas zsírtartalmú L-metionin- és kolinhiányos (HFMCD) táplálékkal etették 60 kcal% zsír, hozzáadott kolin és 0,1% metionin 6 hétig. n = 8 diétánként

A HFMCD diéta hatása a máj és a vese relatív súlyának változására

Az etetési időtartam hatásának vizsgálatához mintákat nyertünk a HFMCD-kiegészítést követő 1. és 6. héten. A máj relatív súlya fokozatosan nőtt (2a. Ábra), és a 6. héten körülbelül kétszeres növekedést mutatott a HFMCD-vel táplált egerekben, összehasonlítva a kontroll diétával táplált egerekkel. A vesék relatív súlya a kísérlet során változatlan maradt (2b. Ábra). Az eredmények minden egérben hasonlóak voltak, származásuktól függetlenül.

A HFMCD diéta hatása a szérum ALT, AST és LDH aktivitására

Az ALT (3a. Ábra), az AST (3b. Ábra) és az LDH (3c. Ábra) szérumaktivitását, amelyek a májkárosodás indikátorai, a HFMCD-diéta jelentősen megnövelte 1 héten keresztül, és a 6. héten magas maradt.

A HFMCD diéta hatása a máj szövettani elváltozásaira

Megvizsgáltuk a máj hisztopatológiai változásait annak megállapítására, hogy a HFMCD időfüggő módon indukálta-e a NAFLD progresszióját. Az 1. héten a NAFLD mind a mikro-, mind a makro-vezikulákat indukálta, tükrözve a lipid felhalmozódását a májban; ez a hatás súlyosabb volt a 6. héten (4. ábra). A makrovezikulák elfoglalták a máj nagy részét, és a neutrofil infiltrációt, amely gyulladásos reakció, a HFMCD-vel táplált egerek májában is megfigyeltek a 6. héten. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a HFMCD időfüggő módon 6 héten belül a steatosisból a NASH-ba fejlődik. A különböző eredetű egerek közötti különbségek jelentőségét nem vizsgálták.

A HFMCD-diéta 1 és 6 héten át gyakorolt hatása az egerek májának lipidfelhalmozódására három különböző forrásból. A májszöveteket H&E-vel festették

Gyulladásos válasz kiváltása a májban HFMCD-diétával

Az MCD diéta növeli a gyulladásos citokinek szekrécióját, és ezáltal májgyulladást vált ki, ami NASH-hoz vezet [18]. A neutrofil infiltráció által javasolt HFMCD által kiváltott gyulladásos válasz indukciójának igazolásához megvizsgáltuk a TNF-α, IL-6 és IL-1β mRNS expresszióját a májban. Mindhárom citokin időfüggő növekedést mutatott, és a HFMCD drámai módon indukálta őket a 6. hét után (5. ábra). A TNF-α (5a. Ábra) és az IL-6 (5b. Ábra) transzkriptumainak szintje körülbelül 15-szeresére emelkedett, az IL-1β (5c. Ábra) szintje pedig több mint 20-szorosára nőtt az a HFMCD bevitele.

A fibrózis markerek expressziója a májban HFMCD diétával

A fibrózist a NAFLD fejlettebb szakaszának tekintik, és arra voltunk kíváncsiak, hogy a HFMCD 6 hétig történő bevitele befolyásolja-e a máj fibrogenezisét az ICR egerekben. Az α-SMA és a TGFβ1, a májstellátus sejtek aktiválására szolgáló markerek és az 1A1 kollagén (Col1a1), az ECM egyik komponensének mRNS szintjét a HFMCD szignifikánsan indukálta a 6. hét után (6. ábra). Az α-SMA (6a. Ábra), a TGFβ1 (6b. Ábra) és a Col1a1 (6c. Ábra) transzkriptumszintje a HFMCD bevétele után számított 6 héten kb. 8-, 15- és 3-szorosára emelkedett.

Vita

A NAFLD lett a krónikus májbetegségek leggyakoribb oka világszerte, mivel az elhízás, a cukorbetegség és a metabolikus szindróma gyakorisága nőtt [19]. A NAFLD magában foglalja a zsírmájbetegségek klinikai-kóros spektrumát, amelyek alkoholfogyasztás hiányában fordulnak elő [20]. A kezdeti tünet a máj steatosis, amelyet viszonylag jóindulatú májkárosodásnak tekintenek. Ha azonban a májkárosodás súlyosbodik, a NASH-ra való progresszió gyorsabbá válik, és a májbetegséghez kapcsolódó halálozási arány növekszik [21]. A NASH-ra jellemző a steatosis, a gyulladás és a hepatocellularis halál [22]. Egyre több bizonyíték van arra, hogy a NASH progresszív fibrózist, cirrhosist és ezt követően májrákot okozhat [23].

Az MCD diétát már régóta használják a NAFLD tanulmányozására. Az MCD-vel táplált állatok 2-4 hét alatt jelentős lipidfelhalmozódást mutatnak a májban, amelyet gyulladás és a fibrózis progressziója követ [24]. Az MCD-diéta csökkenti a VLDL-szekréciót, növeli a zsírsav-bevitelt, gyulladásos jelátvitelt vált ki, endoplazmatikus retikulum-stresszt vált ki és lipid-peroxidációt vált ki [25]. Előnye, hogy rövid időn belül kiváltja a NAFLD-t, de hátránya a súlyos súlycsökkenés, amely nem gyakori tünet a humán NAFLD-betegeknél [26]. Ezért a HFMCD étrendet, amely a magas zsírtartalmú és az MCD diéta kombinációja, javasolták a NAFLD kóros tüneteinek reprodukciójára [6]. Fontos, hogy ez az étrend-modell utánozza az emberi betegséget, beleértve a NAFLD progressziójának számos biokémiai és hisztopatológiai jellemzőjét [27]. A mai napig néhány csoport beszámolt a beltenyésztett egerek törzsei közötti különbségekről az étrend által kiváltott NAFLD és NASH iránti fogékonyságuk tekintetében [6, 28,29,30,31]. Különösen a HFMCD-diéta indukált súlyosabb NASH fenotípust fibrózissal a C57BL/6 egerekben az A/J egerekhez képest [6], és a HFD hosszú távú kitettsége NASH-hoz vezetett C57BL/6 J egerekben, de nem A/J-ben. egerek [31].

Következtetések

Ez a tanulmány azt sugallja, hogy a HFMCD modell egy másik lehetőség lehet az NCDLD modell MCD vagy magas zsírtartalmú étrend által kiváltott hátrányának leküzdésére. Megállapítottuk azt is, hogy a NIFDS által Koreában létrehozott Korl: ICR egerek válaszai hasonlóak a más forrásokból származó ICR egerek válaszaihoz, ami arra utal, hogy hasznos forrás az étrend által kiváltott NAFLD patogenezisének tanulmányozása.

Az adatok és anyagok rendelkezésre állása

Az ebben a tanulmányban használt és/vagy elemzett adatkészletek ésszerű kérésre a megfelelő szerzőtől beszerezhetők.