A melanin-koncentráló hormon közvetlenül gátolja a GnRH neuronokat és blokkolja a kisspeptin aktiválódását, összekapcsolva az energiaegyensúlyt a reprodukcióval

Szerkesztette: Wylie Vale, The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, Kalifornia, és 2009. augusztus 18-án jóváhagyta (2009. július 29-én kapott felülvizsgálatra)

Absztrakt

Az MCH idegsejtek, amelyek többnyire a laterális hipotalamuszban és a zona incerta-ban helyezkednek el, szintén közvetlenül megcélozhatják a GnRH neuronokat, mivel az MCH rostok szoros kapcsolatban vannak a GnRH neuronokkal (22). Az MCH az MCHR1 (23–27) és az MCHR2 (28–30) G-fehérjéhez kapcsolt receptorokon keresztül hat; csak az MCHR1 van jelen a rágcsáló agyában, és a patkány GnRH neuronjainak 50–55% -a expresszálja az MCHR1-et (22). Az MCH intracerebrális infúziói képesek elnyomni (31) vagy fokozni (32, 33) az agyalapi mirigy gonadotropin felszabadulását, az ösztrogén közegtől függően. Az éhomi étrendkorlátozás, amely gátló hatást gyakorol a termékenységre, amint azt a csökkent keringő gonadotropinok és az anovuláció bizonyítja (34), szabályozza az MCH rendszert (35, 36). Az aktivált MCH rendszer csökkenti az energiafelhasználást és növeli az élelmiszer-bevitelt. Ezzel szemben az egerek MCH-hiánya soványsághoz és fokozott anyagcseréhez vezet. Karcsúsága ellenére az MCH kiütés (37, 38) és az MCHR1 kiütés (39) termékeny marad. Az MCH rendszer részt vehet az alvás (40–42), a kábítószer-függőség (43, 44) és a hangulat (45) szabályozásában is. Az MCHR1 antagonistákat jelenleg elhízás elleni és antidepresszáns gyógyszerekként fejlesztik (46, 47).

Az MCH-nak tulajdonított különféle funkciók, az MCH knockout egerek drámai fenotípusa és az MCH klinikai jelentősége ellenére kevés információ áll rendelkezésre az MCH központi idegrendszeri neuronokra gyakorolt elektrofiziológiai hatásairól. A rendelkezésre álló vizsgálatok azokra a hipotalamusz neuronokra korlátozódnak, amelyek az MCH-ra az adó felszabadulásának preszinaptikus gátlásával reagálnak (48, 49). Az MCH közvetlen hatásáról a központi idegrendszer idegsejtjeinek membránpotenciáljára soha nem számoltak be.

Az MCH idegsejtek sűrűn innerválják a Broca rágcsáló mediális septumát/átlós sávját (MSDB) (50, 51), amely tartalmaz kolinerg, GABAerg és vGluT2-glutamaterg idegsejteket, valamint a GnRH neuronok két alcsoportját, amelyek közül csak egyet aktivál a pubertás kiváltó peptid kisspeptin (19).

Az agy MCH sejtcéljainak azonosítása, valamint az energiaegyensúly és a szaporodás összekapcsolásának mechanizmusainak megértése érdekében a jelen tanulmány célja az volt, hogy tesztelje azt a hipotézist, miszerint az MCH módosítani fogja a kisspeptinnel aktivált és kisspeptin-érzéketlen MSDB aktivitását GnRH neuronok. Elektrofiziológiai felvételeket és anatómiai jelölési módszereket alkalmazva a transzgénikus GFP egerek több vonalában beszámolunk az MCH erős, gátló hatásáról a kisspeptinnel aktivált vGluT2-GnRH neuronokra. A kisspeptin-érzéketlen GnRH, kolinerg, GABAerg és glutamaterg MSDB neuronok nem reagáltak az MCH-ra. Az MCH megfigyelt gátló hatásait közvetlen posztszinaptikus mechanizmus közvetíti, és ezek nagyságrendje nagyobb, mint bármelyik központi idegrendszeri neuron esetében beszámoltak róla. Az MCH ezen hatásai a kisspeptinnel aktivált GnRH neuronokon kritikus kapcsolatot biztosíthatnak az energiaegyensúly és a reproduktív fiziológia között.

Eredmények

Az MCH gátolja a vGluT2-GnRH neuronokat egy MCHR1 által transzdukált közvetlen posztszinaptikus mechanizmus révén.

Az MCH gátolta a vGluT2-GnRH neuronok egyedülálló szubpopulációját az MSDB-ben, amely vGluT2-GFP vagy GnRH-GFP egerekből készített szeletekben azonosítható (19, 52). Az MCH (1 μM) 3-20 mV hiperpolarizációt (átlag: 8,1 ± 1,5 mV; n = 15) eredményezett a vGluT2-GnRH neuronok 59% -ában, 17 posztpubertus egérből (n = 22 sejt; –160 napos kor). 300 prepubertális egérből (12–30 napos) készített agyszeletekben az MCH gátolta a vizsgált idegsejtek 60% -át (n = 327), és statisztikailag hasonló, 6,7 ± 0,3 mV (2–20 mV; n = 149) hiperpolarizációt eredményezett. ). Mivel mind a prepubertális, mind a postpubertal egerek neuronjai hasonlóan reagáltak az MCH-ra, a fennmaradó vizsgálatokat prepubertal egerekből készített szeleteken végezték.

Az MCH gátló hatása amplitúdójában hasonló volt mind a pubertás kor előtti hímeknél, mind a nőknél, és az első után 5–15 perccel beadott agonista második alkalmazásához csekély deszenzitizációt mutatott (nőstények, első MCH alkalmazás: 8,2 ± 0,7 mV, második MCH alkalmazás: 8,1 ± 0,7 mV; 18 egérből rögzített n = 20 sejt; hímek, első MCH alkalmazás: 7,8 ± 0,8 mV, második MCH alkalmazás: 7,9 ± 0,9 mV; n = 15 sejt rögzítve 14 egérből; Student páros t tesztje, nem szignifikáns; 1A és B ábra). A neuropeptid-glutaminsav-izoleucin (n = 9), a kokain- és amfetamin-szabályozott transzkriptum (n = 11) és a nesfatin (n = 10) nem volt hatással az MCH-ra reagáló vagy nem reagáló vGluT2-GnRH neuronokra; mindhárom peptidet MCH neuronok képesek előállítani (51, 53, 54). Hasonlóképpen, a leptin (n = 5) és az NPY (n = 19), amelyek szintén jelzik az energiatárolók rendelkezésre állását, nem voltak hatással a kisspeptinnel aktivált vGluT2-GnRH neuronokra.

A vGluT2-GnRH idegsejtekben az MCH által kiváltott hiperpolarizáció TTX-ben (kontroll: 7,1 ± 1,3 mV; TTX: 7 ± 1 mV; n = 7; nem szignifikáns, Student páros t tesztje) és „nulla” Ca 2+/magas Mg 2+ ACSF (kontroll: 6,5 ± 1,5 mV; „nulla” Ca 2+/magas Mg 2+: 8,5 ± 2 mV; n = 8 sejt; nem szignifikáns), ami közvetlen posztszinaptikus mechanizmus bevonására utal (1C. Ábra - F). A várakozásoknak megfelelően az MCHR1-antagonista PMC-3881-PI blokkolta az MCH által kiváltott gátló hatást (kontroll: 9,8 ± 1,4 mV; antagonista: 0 ± 0 mV; n = 6; P + csatornák (kontroll: 11,6 ± 1,4 pA); Ba 2+: 1,8 ± 0,4 pA; n = 5; Student páros t tesztje; önmagában a P 2+ 10,6 ± 3,3 pA befelé áramot eredményezett feszültség-szorító felvételekben (n = 5). Összhangban van egy K + bevonásával áram, az MCH által indukált kifelé irányuló áram megfordult az átlagos megfordítási potenciálnál -101 ± 1,7 mV (n = 5), amely közel van a számított Ek értékéhez -101 mV (1L ábra). Így a vGluT2-GnRH MCH által kiváltott gátlása az idegsejtek a Ba 2+ -érzékeny K + csatornák megnyitásával járnak.

Az MCH szelektíven gátolja a kisspeptin által aktivált vGluT2-GnRH neuronok szubpopulációját az MSDB-ben.

Az MCH fent leírt hatásai az MSDB-n belül egy nagyon egyedi neuronpopulációban jelentkeztek. Az MCH által gátolt vGluT2-GnRH idegsejteket az MSDB-n belüli egyéb főbb neuronpopulációktól meg lehet különböztetni az I. csoportba tartozó glutamát metabotropikus receptor agonista DHPG-re gyakorolt gerjesztő válasz hiányával, valamint a neuropeptid, a kisspeptin, a természetes a GPR54 liganduma (19, 52). Bár a DHPG-érzékenységet minden vizsgált idegsejtben megvizsgálták, a kisspeptin válasz erős és elhúzódó jellege miatt a kisspeptin agonistát csak a kísérlet végén alkalmazták. A kisspeptin iránti érzékenységet a kissspeptin-10 (KP-10) bioaktív fragmens alkalmazásával értékeltük. A kísérlet végén összesen 75 MCH-érzékenységű vGluT2-GnRH neuron igazolták, hogy KP-10-érzékenyek (2A, B és E ábra).

Az MCH által gátolt vGluT2-GnRH idegsejteket egyedülálló módon a kisspeptin aktiválja, de az I. csoportba tartozó metabotrop glutamát receptor agonista, a DHPG nem. (A) Egy áramellátással befogott DHPG-érzéketlen GnRH-GFP idegsejt diagramdokumentuma azt mutatja, hogy az idegsejt MCH-ra (1 μM, 15 s) 7 mV hiperpolarizációval reagált, amely 110 másodpercig tartott. Ugyanez az idegsejt hosszan tartó gerjesztéssel reagált a bioaktív kiss-peptin fragmentumra, a KP-10-re (100 nM, 15 s) (kimosást nem mutatunk be). (B) vGluT2-GFP hasonló tulajdonságú idegsejtek. Az idegsejt érzéketlen volt a DHPG-re, de az MCH-ra egy 13 mV-os hiperpolarizációval reagált, amely 187 másodpercig tartott; az idegsejtet a KP-10 is aktiválta. (C) Megmutatja, hogy egy KP-10-re érzéketlen DHPG-aktivált GnRH-GFP idegsejt szintén érzéketlen az MCH-ra. (D) Hasonlóképpen, az MCH hatása sem volt látható egy DHPG-aktivált, KP-10-érzéketlen vGluT2-GFP idegsejtben. (E) Az oszlopdiagram összefoglalja az adatokat, és azt is mutatja, hogy az azonos magban elhelyezkedő kolinerg és GAD67-GFP idegsejtek nem reagálnak az MCH-ra; mind a kolinerg, mind a GABAerg idegsejteket a DHPG aktiválja, a KP-10 azonban nem. Megjegyezzük, hogy a DHPG-érzéketlen vGluT2-GFP és GnRH-GFP neuronok hasonló százalékát gátolta az MCH; ezek az idegsejtek valószínűleg ugyanazt a neuronpopulációt képviselik, mivel a GnRH neuronok együtt lokalizálják a vGluT2-t (19).

Az MCH nem volt hatással a 36 KP-10-érzéketlen GnRH-GFP sejtre, amelyeket 30 egérből készített agyszeletekben rögzítettünk (2C. És E ábra), illetve a 47 KP-10-érzéketlen vGluT2-GFP idegsejtre, amelyeket 42 egér (2D. És E ábra); ezeket a neuronokat a DHPG erősen aktiválta. Az MCH szintén nem volt hatással a kolinergre (n = 27) vagy a GABAerg neuronokra (n = 12; 2E. Ábra); mindkét neuronpopulációt hasonlóan aktiválja a DHPG, de a KP-10 nem (19, 55, 56). Így az MCH szelektíven gátolja a KP-10-aktivált, DHPG-érzéketlen neuronokat az MSDB-n belül.

Az MCH megszakítja a vGluT2-GnRH neuronok kisspeptin által kiváltott aktivációját.

Az energiaegyensúly és a szaporodás közötti szoros kapcsolat miatt ezután meghatároztuk, hogy az MCH gátló aktivitása révén képes-e ellenállni a kisspeptin hosszan tartó gerjesztő hatásának. Kontroll körülmények között a KP-10 aktiválása átlagosan 16 ± 1,5 percig tart (3A. Ábra) (19). 12 sejtben 100 nM KP-10-t alkalmaztunk 5 másodpercig, és miután a KP-10-re gerjesztő választ sikerült megállapítani, MCH-t alkalmaztunk 15 másodpercig. Az MCH megszakította a KP-10 gerjesztő hatását, és 10,9 ± 1,1 mV hiperpolarizációt eredményezett (3B. Ábra). Ez a megszakítás átlagosan 1,8 ± 0,3 percig tartott (n = 12). Ezenkívül az MCH válasz nem érzékenyítő jellege miatt az MCH ismételt alkalmazása továbbra is blokkolja a KP-10 aktiválódást (3C. Ábra). Hasonló megszakítást figyeltek meg a feszültség-szorító felvételeknél (n = 3) (3D ábra).

Az MCH ellenzi a kisspeptin által kiváltott aktivációt a vGluT2-GnRH neuronokban. (A) A KP-10 (100 nM, 5 s)> 17 percig tartó elhúzódó gerjesztést váltott ki. (B) A sejt, amely depolarizált és tüzet kezdett válaszolni a KP-10-re, csak egy későbbi MCH alkalmazás szakította meg. Az MCH gátlás 100 másodpercig tartott. (C) Második cella, amelyben az MCH 140 másodpercig és 120 másodpercig megszakította a KP-10 indukálta tüzelést az újrakezdéskor. (D) Feszültség-szorító felvétel, amely azt mutatja, hogy a KP-10 15 pA befelé áramot indukált. Az MCH 12 pA áramot indukált, szinte teljesen megfordítva a KP-10 által indukált befelé áramot, amely 240 s múlva visszatért az eredeti nagyságára.

Az MCH immunreaktív rostok a septum vGluT2-GnRH neuronok közelében találhatók.

Mivel az MCH gátolta a KP-10 által aktivált vGluT2-GnRH idegsejteket, a vGluT2-GFP (n = 5) és a GnRH-GFP (n = 5) alkalmazásával specifikusan meghatároztuk az MCH-immunreaktív rostok és a vGluT2-GFP és GnRH-GFP idegsejtek közötti anatómiai kapcsolatot. ) egerek és egy jól jellemzett antiszérum az MCH ellen (51). A vGluT2-GFP egerekből készített metszetekben vörös színnel festett MCH immunreaktív axonokat találtunk az egész MSDB-ben, és a vGluT2 sejttestekkel és dendritekkel szoros egymás mellett helyezkedtek el. Egyes sejtekben sok MCH bouton úgy tűnt, hogy érintkezik egyetlen GFP-sejttel (4A – D. Ábra). Hasonlóképpen, a GnRH-GFP egerekben az MCH axonok a GFP sejttestekkel és a dendritekkel szoros egymás mellett helyezkedtek el (4E – G ábra). Az elsődleges vagy a szekunder antitest eliminációja nem eredményezett festést, és a hipokretin/orexin elleni antiszérumokkal való helyettesítés a festés eltérő mintázatát eredményezte. Így az MCH axonok érintkeznek a GnRH-val, valamint a vGluT2 neuronokkal. Az ultrakonstrukturális elemzés segítene megválaszolni azt a kérdést, hogy ezek az érintkezések szinaptikus jellegűek-e.

Az MCH-immunreaktív rostok érintkeznek a vGluT2 és a GnRH-GFP idegsejtekkel az MSDB-ben. (A) MCH axonok az MSDB-ben. Méretarány, 15 μm. (B-D) Ugyanaz a mikroszkópmező, amelyen láthatóak az MCH axonok (B), a vGluT2-GFP neuronok (C) és az MCH axonok (piros színnel), amelyek érintkeznek a vGluT2-GFP neuronokkal (zöld színnel) (D). Méretarány, 9 μm. (E – G) Mikroszkópmező mutatja az MCH axonokat (E), a GnRH-GFP neuronokat (F) és a vörös MCH axonokat, amelyek látszólagos érintkezésben vannak a zöld GnRH-GFP neuronokkal. Méretarány, 10 μm. Vegye figyelembe a vGluT2-GFP és a GnRH-GFP idegsejtek hasonló alakját.

Vita

Jelen tanulmányban először az MCH orexigén peptid központi posztszinaptikus gátló hatásáról számolunk be a központi idegrendszer idegsejtjein. Ezek a hatások az MCH további funkciójára utalnak az agyban. Az MCH gátló hatása a bazális előagy neuronok kizárólagos részhalmazában, nevezetesen a vGluT2-GnRH neuronokban jelentkezik. Az MCH által kiváltott gátlást a vGluT2-GnRH idegsejtekben egy MCH1-receptor által transzdukált posztszinaptikus mechanizmus közvetíti, amely Ba 2+ -érzékeny K + csatornák megnyitásával jár. Az MCH-immunreaktív rostok a vGluT2-GFP és a GnRH-GFP idegsejtekhez közel helyezkednek el. Érdekes módon az MCH gátló hatása megszakíthatja vagy blokkolhatja a hipotalamusz peptid kisspeptin perzisztáló gerjesztő hatását, amely elengedhetetlen a szaporodáshoz. Tekintettel az MCH energiamérlegében betöltött szerepére, a kisspeptin pedig a pubertás kiváltásában, valamint az ovuláció és a termékenység fenntartásában, a kisspeptinre érzékeny vGluT2-GnRH neuronok MCH-gátlása MCH-közvetített kapcsolatra utal az energiaegyensúly és a szaporodás között közvetlenül a GnRH neuron szintjén.

Ebben a tanulmányban az MCH rövid, 15 másodperces alkalmazása erős és reprodukálható gátlást eredményezett a vGluT2-GnRH neuronok erősen szelektív populációjában, amelyet a Gq-kapcsolt GPR54 receptor ligand kisspeptin tartósan aktivál, de a Gq-csatolt I. csoport nem. glutamát metabotrop receptor agonista DHPG. Ezzel szemben az MCH nem volt hatással a DHPG által aktivált, kisspeptin-érzéketlen GnRH, vGluT2, kolinerg vagy GABAerg neuronokra, amelyek ugyanazon a bazális előagy területén helyezkednek el. Így az MCH megfigyelt gátló hatásai az MSDB-ben erősen szelektívek egy neuronális populációra, amely részt vesz a pubertás kiváltásában és a termékenység szempontjából elengedhetetlen kulcsfontosságú reproduktív funkciók fenntartásában. Ezért ezek a megállapítások az MCH újszerű működésére utalnak. Ezenkívül az MCH gátlás hiánya a kisspeptin-érzéketlen, DHPG-aktivált GnRH neuronokban további bizonyítékokat szolgáltat a GnRH neuronok két olyan populációjának javára, amelyek neuromodulátor válaszaik révén különböző funkciókat látnak el (19.

Az MCH-val ellentétben az NEI, a CART vagy a nesfatin nem volt látható hatással a kisspeptinnel aktivált vGluT2-GnRH neuronok membrán tulajdonságaira. Az ezekre az idegsejtekre gyakorolt leptin- és NPY-hatások hiánya összhangban van a leptin-receptorok hiányával a GnRH-neuronokban (6); Az NPY-hatásokat csak szoptató egereknél jelentették (58).

Az MCH megfigyelt gátló hatásainak fiziológiai jelentőségét MCH immunreaktivitási vizsgálataink hangsúlyozzák. Az MCH rostok nagy sűrűsége, amelyet egerekben az MSDB-ben észleltünk, összhangban áll a patkányokkal kapcsolatos korábbi jelentésekkel (50, 51, 59). Az egereken a GnRH-GFP idegsejtek és az MCH-ir rostok között megfigyelt szoros hozzászólások összhangban vannak a patkányokkal végzett vizsgálatokkal (22). Ezenkívül tanulmányunkban szoros alkalmazást figyeltünk meg a vGluT2-GFP idegsejtek és az MCH rostok között, amelyek összhangban állnak az MCH vGluT2-GnRH neuronokra megfigyelt gátló hatásával.

Éhezés hiányában, normál fiziológiai körülmények között, az MCH idegsejtek nyugalmi állapotban vannak ébrenlét közben, de tűzhatás-potenciálok a gyors szemmozgás (REM) alvás közben (42). Ezenkívül a c-fos vizsgálatok azt mutatják, hogy az MCH neuronok ~ 60% -a alvás közben aktiválódik egy REM alváshiányos időszak után (40). Vizsgálatunk eredményei megjósolják a gonadotropin felszabadulás csökkenését a REM alvás alatt és a REM alvásmegvonás után. Patkányokban valóban kimutatták, hogy a REM alváshiány csökkenti az LH és az FSH szintjét (68); és felnőtt férfiaknál a REM alvás egyenletesen társult a csökkenő LH-koncentrációval (69).

Összegzésként elmondható, hogy az MCH megfigyelt közvetlen gátló hatása a GnRH neuronok szubpopulációjára, amely elengedhetetlen a pubertás kiváltásához és a preovulációs LH hullám előidézéséhez, bizonyítékot szolgáltat az energiaegyensúly és a reprodukció közötti kritikus kapcsolatra a GnRH idegsejt szintjén. Mivel az MCH antagonistákat jelenleg potenciális antidepresszáns és elhízás elleni gyógyszerként fejlesztik, körültekintő lehet mérlegelni a reproduktív rendszerre gyakorolt hatásukat, különösen, ha anorexiás egyének depressziójának kezelésére használják.

Anyagok és metódusok

Az egész sejtes patch clamp felvételeket GnRH, vGluT2 és GABAerg idegsejteken hajtottuk végre transzgénikus GFP egerek kialakított vonalából készített agyszeletekben. Az MCH-t és más agonistákat Y-csövön keresztül alkalmaztuk. Immunocitokémiát végeztünk a vGluT2-GnRH idegsejtek MCH beidegzésének meghatározásához jól bevált antitest alkalmazásával [a részletes módszereket lásd az SI-ben].

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az Országos Egészségügyi Intézmény MH61465, NS41454 és NS48476 támogatásai, valamint Connecticut állam Mentális Egészségügyi és Függőségügyi Szolgálatának támogatásával támogatták.

Lábjegyzetek

1 Kinek kell címezni a levelezést. E-mail: Meenakshi.Alrejayale.edu

Szerző közreműködései: M.A. tervezett kutatás; M.W., I.D., E.M. és A.v.d.P. végzett kutatás; A.v.d.P. új reagensekkel/analitikai eszközökkel járult hozzá; M.W. és I.D. elemzett adatok; és M. A. megírta a lapot.

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.