A plazma kolecisztokinin endogén emelkedése nem gátolja az epeköveket

Rafiq A. Shahid

1 Orvostudományi Tanszék, Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, USA

David Q.-H. Wang

5 Belgyógyászati Klinika, Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Saint Louis Egyetem Orvostudományi Kar, St. Louis, MO 63104, USA

Brian E. díj

1 Orvostudományi Tanszék, Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, USA

Shannon J. McCall

2 Patológiai Osztály, Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, USA

Joelle M.-J. Romac

1 Orvostudományi Tanszék, Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, USA

Steven R. Vigna

1 Orvostudományi Tanszék, Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, USA

3 Sejtbiológiai Tanszék, Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, USA

Rodger A. Liddle

1 Orvostudományi Tanszék, Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, USA

4 Durham VA Medical Center, Durham, NC 27710, USA

Absztrakt

Háttér

Az epehólyag rendszeres összehúzódása csökkenti az epe pangását és megakadályozza az epekő képződését. Az exogén hasnyálmirigy szekréciós tripszin inhibitor (PSTI-I, más néven monitorpeptid) intraduodenális beadása kolecisztokinin (CCK) szekréciót okoz.

Tervezés

Javasoltuk, hogy a CCK felszabadulásának PSTI általi stimulálása epehólyag-összehúzódást eredményezzen és megakadályozza az epeköveket litogén étrenddel etetett egerekben. Ezért teszteltük a patkány PSTI-I hasnyálmirigy-acináris sejtekben történő túlzott expressziójának hatását a plazma CCK szintjére és az epehólyag működésére transzgénikus egérvonalon (TgN [Psti1]; a továbbiakban PSTI-I tg néven ismert).

Eredmények

Fontos, hogy a PSTI tg egereknél magasabb volt az éhomi és táplált plazma CCK szint, mint a vad típusú (WT) egereknél. Csak a litogén étrendet tápláló egereknél alakultak ki epekövek. Az éhgyomri és az stimulált plazma CCK szintek mind a WT, mind a PSTI-I tg egerekben lényegesen csökkentek a litogén étrendben. Sőt, a magasabb CCK szint ellenére a PSTI-I tg állatokban több epekő fejlődött ki, mint a WT állatokban.

Következtetések

A CCK által stimulált epehólyag kiürülésének korábban megfigyelt csökkenésével együtt a litogén étrendet tápláló egerekben megállapításaink azt sugallják, hogy a litogén étrend az epehólyag képződését a CCK szekréciójának károsodása mellett az epehólyag CCK iránti érzékenységének csökkenése mellett is okozza.

Bevezetés

Megalapozott, hogy a vékonybél hormon kolecisztokinin (CCK) az epehólyag összehúzódásának fő stimulátora étkezés után [1]. A CCK szekréciójának szabályozása összetett, több intraluminális tényezőt magában foglal, beleértve a fehérjéket, zsírokat és a hasnyálmirigy szekréciós tripszin inhibitor-I-jét (PSTI-1, más néven monitorpeptid) [2]. A PSTI-I egy 61 aminosav, tripszin-érzékeny peptid, amelyet patkány hasnyálmirigy-levéből tisztítottak [3, 4]. Serkenti a bél CCK felszabadulását, amelynek következtében fokozódik a hasnyálmirigy enzim szekréciója az étrendi fehérje hatására, és részben felelős lehet a hasnyálmirigy enzim szekréciójának fiziológiai visszacsatolásának szabályozásáért [5]. A PSTI-I gátolja az intrapankreatikus tripszin aktivitást is. A tripszin-gátló aktivitás hatékonynak bizonyult a hasnyálmirigy-gyulladás csökkentésében mind akut [6], mind krónikus [7] hasnyálmirigy-gyulladás állatmodelljeiben, amikor a PSTI-I túlzottan expresszálódik egy transzgenikus egérvonal hasnyálmirigyében. Nem ismert azonban, hogy a PSTI-I transzgénikus overexpressziója befolyásolja-e a plazma CCK szintjét éhgyomorra vagy táplált állapotban, vagy befolyásolja-e az emelkedett plazma CCK koncentrációk az epehólyag működését vagy az epekő képződést.

Kifejlesztettünk egy transzgénikus egérvonalat, amelyben a patkány hasnyálmirigy szekréciós tripszin inhibitor I (PSTI-I) génje túlzottan expresszálódik az egér hasnyálmirigy-acináris sejtjeiben [6, 20, 21]. Egyéb tevékenységek mellett a PSTI-I stimulálja a CCK szekrécióját az I sejtekből a vékonybél nyálkahártyájának epitéliumában, és a CCK megnövekedett plazmakoncentrációja viszont az epehólyag összehúzódását okozza. Ezért feltételeztük, hogy a PSTI-I transzgénikus egerek megemelkedett CCK plazmaszintet mutatnak, ami az epehólyag összehúzódásának folyamatos stimulálását eredményezi, és értékeltük, hogy ezek a válaszok megvédik-e az egereket az epekő képződésétől, ha litogén étrendet táplálnak. Felfedeztük, hogy a PSTI-I expressziója transzgénikus egerekben valóban a CCK krónikus emelkedéséhez vezetett. Ez a magasság azonban nem akadályozta meg az epekő képződését. Megfigyeltük azt is, hogy a litogén étrend gátolta a CCK szekrécióját, ezáltal csökkentve az epehólyag összehúzódását, és ezáltal hozzájárulva az epekő képződéséhez.

Mód

Két egér törzset használtunk ezekben a vizsgálatokban. A vad típusú és a C57BL/6J egereket a Jackson Laboratóriumtól (Bar Harbor, Maine, USA) vásároltuk. A genetikai C57BL/6J háttérrel rendelkező transzgénikus egereket, amelyek a patkány hasnyálmirigy szekréciós tripszin inhibitor I génjét expresszálják hasnyálmirigy-acinar sejtekben (TgN [Psti1]; PSTI-I tg), laboratóriumunkban előállítottuk az előzőekben leírtak szerint [6]. A transzgén az egér elasztáz I fokozó/promóter kiméra konstrukciójából állt, amely a patkány PSTI-I 4,6 kb méretű minigénje előtt volt klónozva, és a patkány PSTI-I mRNS-ét és fehérjét kizárólag hasnyálmirigyben expresszálták. Az egereket klímaberendezéssel szabályozott helyiségekben helyezték el 12:12 órás világos-sötét ciklusban, és ad libitum engedélyezték a vizet és a chow-t. Minden állatkísérletet a Duke Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottságának jóváhagyásával hajtottak végre.

6 hetes korban a hím vad típusú és PSTI-I tg egereket a két ad libitum étrend egyikére helyezték: (1) normál egér chow (Purina) vagy (2) litogén étrend, amely 1% koleszterint és 0,5% -ot tartalmaz % nátrium-taurokolát (Harlan-Teklad egér diéta # 5015 CB, Indianapolis, IN). Nyolc hét folyamatos táplálkozás végén az állatokat eutanizálták a vér és a szövetek gyűjtése céljából.

Plasma CCK assay

A plazma CCK-koncentrációkat egy specifikus biológiai vizsgálattal mértük a leírtak szerint [22]. Ez a vizsgálat a CCK azon képességén alapul, hogy stimulálja az izolált patkány hasnyálmirigy-acinok amiláz-felszabadulását. Röviden, a plazmát extraháljuk és az oktadecil-szilil-szilícium-dioxid C-18 patronokra adszorpcióval koncentráljuk (Waters Associates, Millipore Corp., Milford, MA). A megfelelő érzékenység elérése érdekében a plazmát 3 egérből egyesítettük [23].

Epehólyag hisztopatológia

Az epehólyagokat 10% -os formalinban rögzítették, paraffinba ágyazva, és a metszeteket 5 μm-en vágták és üveglapokra szerelték. A krónikus epehólyag-gyulladást egy patológus osztályozta (megvakítva a csoportmegjelölést), a lamina propria krónikus gyulladásának, a Rokitansky-Aschoff sinusok jelenlétének és a muscularis externa megvastagodásának mértékével. Más gyulladásos változásokat is megvizsgáltak, ideértve a hám neutrofiljeinek számát, a neutrofilek és az eozinofilek számát a lamina propriában, a reaktív hámváltozásokat, például az eozinofil citoplazmatikus zárványokat, a papilláris nyálkahártya felépítését és a gyulladásos sejtek hiányát a papilláris ödémával szemben; minden kategória 0, 1 vagy 2 pontot kapott (maximális lehetséges pont = 16).

Epehólyag térfogata

Az epehólyag térfogatát a korábban leírtak szerint mértük [10, 24]. Röviden: az egereket egy éjszakán át éheztettük, szabadon hozzáférve az ivóvízhez, érzéstelenítettük, laparotómiát hajtottunk végre steril körülmények között, az epehólyagot kitettük és méretét mikrotolómérővel mértük. Az epehólyag térfogatait a következő képlet segítségével számoltuk ki, feltételezve egy ellipszoid alakot (amely pontosnak bizonyult az epehólyag alakjában mutatkozó jelentős különbségek hiányában) [24]:

Az epehólyag ürítésének és a plazma CCK koncentrációinak meghatározására az intraduodenális zsírra adott válaszként a laparotomia során PE-10 polietilén katétert illesztettek a duodenumba. A duodenális katétert a bal hasfalon keresztül kivezettük és infúziós pumpához csatlakoztattuk. A műtét után az epehólyag méretét mikro-féknyereggel mértük, és az epehólyag térfogatát a fenti képlet segítségével számítottuk ki. Ezután az egereket intraduodenálisan kukoricaolajjal infundáltuk 40 μl/perc sebességgel 5 percig. A kontrollokat azonos módon infundáltuk 0,9% NaCl-val. 30 perc elteltével ismét mérjük az epehólyag térfogatát, mint korábban, és vegyes arteriovenózus vért gyűjtöttünk a plazma CCK vizsgálatához. A harminc perces intervallumot azért választottuk, mert ez az embereken végzett korábbi vizsgálatokban [1, 25] és patkányokban [26] bebizonyosodott, hogy megfelel a csúcs plazma CCK szintjének és az epehólyag összehúzódásának, és megfelelő egereknél [27]. Az epehólyag kiürülését az epehólyag térfogatának különbségeként határoztuk meg a duodenális infúziók előtt és után.

Az epehólyag epe és az epekövek mikroszkópos vizsgálata

Egy éjszakán át tartó böjt után kolecisztektómiát végeztünk PSTI-I transzgénikus és vad típusú egerekben (N = 18–20 csoportonként) 8. héten, litogén vagy chow étrenden. Az epehólyag epét polarizáló fénymikroszkóppal vizsgáltuk mucin gél, folyadékkristályok, vízmentes koleszterin kristályok, lemezszerű koleszterin monohidrát kristályok, homokos kövek és valódi epekövek esetében, amelyeket mind korábban meghatározott kritériumok szerint határoztak meg [28].

Lipid elemzés

Az epe-koleszterint, a teljes és az egyes epesókat, valamint a foszfolipideket a korábban leírtak szerint határoztuk meg [29]. Az összesített epehólyag-epének koleszterin-szaturációs index (CSI) értékeit a kritikus táblázatokból számoltuk ki [30]. Az összesített epehólyag-epe minták relatív lipidösszetételeit háromszög fázisdiagramon ábrázoltuk, az összes lipidkoncentrációjuknak megfelelően. A fázishatárokat és a kristályosodási útvonalakat extrapoláltuk nátrium-taurokolátra épülő epe modellekből 37 ° C-on [31]. Az epehólyag epe hidrofobicitási indexeit Heuman módszerével számoltuk [32].

Statisztikai analízis

Az éhomi és a lipiddel táplált (kukoricaolaj) plazma CCK koncentrációinak összehasonlítása vad típusú egerekben (nyitott rudak) és PSTI-I tg egerekben (töltött rudak) normál étrendet tápláltak (N = 3 3 egérből álló készlet). A PSTI-I túlzott expressziója jelentősen megnövelte az éhgyomri és a lipidekkel táplált CCK koncentrációt. (* P 2A ábra). Mindkét egér törzsben a litogén étrend jelentős hisztopatológiai változásokat okozott, beleértve a megnövekedett gyulladásos sejteket, megvastagodott izomfalakat, reaktív hámváltozásokat és megváltozott nyálkahártya papilláris architektúrát. A hisztopatológiai pontszámok számszerűsítése során azonban nem volt szignifikáns különbség a vad típusú és a PSTI-I tg egerek között, akik litogén étrendet tápláltak (2B. Ábra).