A probiotikus mikrobák fenntartják a fiatalos szérum tesztoszteronszintet és a herék méretét az öregedő egerekben

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Theofilos Poutahidis, Alex Springer

Összehasonlító Orvostudományi Osztály, Massachusettsi Műszaki Intézet, Cambridge, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok, Patológiai Laboratórium, Állatorvos-tudományi Kar, Thesszaloniki Arisztotelész Egyetem, Thessaloniki, Görögország

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Theofilos Poutahidis, Alex Springer

Összehasonlító Orvostudományi Osztály, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok, Biotechnológia, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok

Összehasonlító Orvostudományi Osztály, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok

Thesszaloniki Arisztotelész Egyetem, Thesszaloniki, Görögország Állatorvos-tudományi Kar Patológiai Tagozatának Laboratóriuma

Biológiai mérnöki tagság, Massachusettsi Műszaki Intézet, Cambridge, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok, Broad Institute of MIT és Harvard, Cambridge, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok

Összehasonlító Orvostudományi Osztály, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok

Theofilos Poutahidis,
Alex Springer,
Tatiana Levkovich,
Peimin Qi,
Bernard J. Varian,
Jessica R. Lakritz,
Yassin M. Ibrahim,
Antonis Chatzigiagkos,
Eric J. Alm,
Susan E. Erdman

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Poutahidis T, Springer A, Levkovich T, Qi P, Varian BJ, Lakritz JR és mtsai. (2014) A probiotikus mikrobák fenntartják a fiatal szérum tesztoszteronszintet és a hereméretet az öregedő egerekben. PLoS ONE 9 (1): e84877. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0084877

Szerkesztő: Stefan Schlatt, Münster Egyetemi Kórház, Németország

Fogadott: 2013. június 30 .; Elfogadott: 2013. november 20 .; Közzétett: 2014. január 2

Finanszírozás: Ezt a munkát az Országos Egészségügyi Intézet P30-ES002109 (kísérleti projekt-díj a SEE és az EJA számára), az U01 CA164337 (SEE és EJA) és a RO1CA108854 (SEE) támogatásával támogatta. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A hím emlősökben a tesztoszteron fő sejtforrása a Leydig sejt, amely a herék interstitiumán belüli fürtökben helyezkedik el. A felnőtt Leydig-sejtek androgéntermelését a hipotalamusz-agyalapi mirigy tengelyéből származó luteinizáló hormon által közvetített jelek szabályozzák [1]. A férfiaknál a keringő tesztoszteron elkerülhetetlen csökkenése következik be az életkor növekedésével [2] - [4]. A jelenséget irányító mechanizmusok nagyrészt ismeretlenek. Az embereken és a rágcsálókon végzett vizsgálatok azonban azt sugallják, hogy az alacsony tesztoszteron oka a herék korral járó elváltozásoknak, nem pedig a szabálytalan luteinizáló hormon anyagcserének [1], [5] - [7].

A tesztoszteron csökkenése szerepet játszik a férfiak öregedésének számos káros hatásában, beleértve a csökkent spermatogenezist, a libidót és a szexuális funkciókat, a megnövekedett testzsírt, az izom- és csonttömeg csökkenését, az alacsony energiaszintet, a fáradtságot, a rossz fizikai teljesítőképességet, a depressziós hangulatot és a károsodott állapotot. kognitív diszfunkció [8] - [11]. Vita tárgyát képezte, hogy az alacsony tesztoszteron az idős férfiak meghatározott klinikai egységének okozója-e vagy sem [12]. Ezenkívül különböző neveket használtak ennek az állapotnak a leírására (férfi menopauza, andropauza, az öregedő férfi részleges androgénhiánya és későn megjelenő hipogonadizmus), és ennek meghatározásához különböző kritériumokat használtak, ezért az epidemiológiai vizsgálatok eltérései a betegségről való beszámolás során prevalencia [12] - [13]. Mindazonáltal megkérdőjelezhetetlen egyetértés van abban, hogy a Leydig-sejtek életkorral összefüggő progresszív morfológiai és funkcionális változásai alacsony tesztoszteronszinthez vezetnek, ami viszont csökkenti a reproduktív alkalmasságot és befolyásolja az idősödő férfi életminőségét [1], [4] - [5], [9] - [10], [12] - [13].

Különböző táplálkozási tényezők és az étrend által kiváltott elhízás kimutatták, hogy mind az embereknél, mind az egereknél növelik a későn megjelenő hím hipogonadizmus és az alacsony tesztoszterontermelés kockázatát. Úgy tűnik, hogy a tesztoszteronhiány és az anyagcsere-betegségek, például az elhízás, inter-digitálissá válnak az összetett ok-okozati összefüggésekben [14] - [17].

Nemrégiben azt tapasztaltuk, hogy az idős egerek étrend-kiegészítése a Lactobacillus reuteri probiotikus baktériummal fiatalabbnak tűnik, mint a párosítatlan kezeletlen testvér egerek, legalábbis részben kedvező integumentáris hatások kiváltásával, amelyek dús szőrként nyilvánulnak meg [18] és diéta okozta elhízás [19]. Érdekes módon mindkettő ezekhez a hatásokhoz kapcsolódott a CD4 + szabályozó-T-sejtekhez és az Il-10-hez kapcsolódó szisztematikus down-regulációhoz a pro-gyulladásos citokin Il-17-hez [18] - [19]. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a bél mikrobiota a helyi gasztrointesztinális immunitás modulációját indukálja, ami szisztémás hatásokat eredményez az immunrendszerre, amelyek aktiválják a szöveti homeosztázist és az egészségi állapotot helyreállító metabolikus utakat. Valójában egy másik tanulmányban felfedeztük, hogy az L. reuteri-t fogyasztó idős egerek gyorsított bőrsebek gyógyulását mutatják, ami az immunrendszer szuppresszív karjától és az agyalapi mirigy neuropeptid oxitocin hormonjának szabályozásától függ (publikálásra benyújtott kézirat). Mindezen vizsgálatok során következetesen megfigyeltük, hogy a megtisztított L. reuteri organizmusokat fogyasztó fiatal és idős egereknek különösen nagy a heréjük és a hím viselkedése domináns.

Korábbi tanulmányaink és megfigyeléseink együttvéve arra a feltételezésre késztettek bennünket, hogy az étrendi L. reuteri megakadályozhatja az életkorral és az elhízással kapcsolatos herék atrófiáját egerekben. Jelen tanulmány eredményei megerősítették ezt a hipotézist. A probiotikummal táplált idős egerek heréit mind a szemfenék tubulus atrófiájából, mind a normális öregedési folyamatra jellemző interstitialis Leydig sejtterület-csökkentésből kimentették. A herék felépítésének megőrzése az időskor vagy a magas zsírtartalmú étrend ellenére egybeesett a keringő tesztoszteron kiemelkedően magas szintjével. A probiotikus fogyasztás jótékony hatásait összefoglalták a gyulladásgátló Il-17 citokin kimerülésével.

Tekintettel a tesztoszteron-helyettesítő terápia előnyeiről és mellékhatásainak kockázatairól szóló súlyosbodott vitákra [9] - [10], [13], [20], az étrendi L. reuteri alternatív természetes megközelítést nyújthat a későn megjelenő férfi megelőzésében. hipogonadizmus.

Eredmények

A Lactobacillus reuteri fogyasztása növeli a normál étrend mellett táplált egerek herék tömegét

a. A kültéri svájci hím egerek bruttó megjelenése orális Lactobacillus reuteri kezeléssel 12 hónapos korban. Az L. reuteri táplált egerek heréi nagyobbak a kontroll egerekhez képest. lenni. A herék tömegének statisztikai elemzésének eredményei a kezelés megkezdése után különböző időpontokban, beleértve a (b) 5, (c) 7, (d) 9 és (e) 12 hónapos idõpontok. Az L. reuteri következetesen növelte a herék súlyát mind a kontroll, mind az új nyugati étrenddel táplált egerekben, összehasonlítva az életkorral és az étrendhez illeszkedő kontrollokkal. Az étrend-kiegészítés L. reuteri-vel, de az E coli K12-tel nem, 7 hónapos korban megnövelte a herék súlyát a kontroll étrendet tápláló egerekben, összehasonlítva az életkor és az étrendnek megfelelő kontrollokkal (c). Az oszlopdiagramok y tengelyén lévő számok megfelelnek a herék tömegének ± SEM átlagának vagy a herék tömegének; * p 2. ábra. A diétás L. reuteri növeli a szemcsés tubulusok keresztmetszeti profilterületét és csírasejt-populációját.

a. A svájci egerek szemináris tubulusainak keresztmetszeti profiljainak reprezentatív szövettana 5 hónapos korban. A L. reuteri fogyasztás következtében megnövekedett heretömeg mind a kontroll, mind az új nyugati étrenddel (NWD) táplált egerekben együtt létezett a szemcsés tubulus (ST) keresztmetszeti területének szövettanilag észrevehető növekedésével. Hematoxilin és eozin. Rúd = 100 µm. b. A kör alakú ST keresztmetszetű profilok méretének hisztomorfometrikus értékelése különböző időpontokban. A L. reuteri hatása az életkor előrehaladtával továbbra is rendkívül jelentős. Az oszlopdiagramok y tengelyén lévő számok megegyeznek az ST területméret átlag ± SEM értékével; *** p 3. ábra: Az L. reuteri fogyasztás növeli az interstitialis Leydig-sejtek nagyságát és a Leydig-sejtek számát.

a. A svájci egerek heréinek reprezentatív szövettana 12 hónapos korban. A probiotikummal táplált egerek here-interstitiumában a Leydig-sejtek területe nagyobb, mint a kontroll egerek megfelelő területein. Hematoxilin és eozin. Rúd = 100 µm b. A Leydig sejtterületek hisztomorfometriai számlálása különböző időpontokban feltárta az L. reuteri-hatás statisztikai szignifikanciáját. Az oszlopdiagramok y tengelyén lévő számok megegyeznek a Leydig területméret átlag ± SEM értékével. c. A pontszámláló sztereológiai számlálások azt mutatják, hogy az L. reuteri-vel táplált egér herék jelentősen megnövelték a sejtmag mennyiségét és a herénként megnövekedett Leydig sejtek számát. Az oszlopdiagramok y tengelyén lévő számok megegyeznek a „Csírasejtek magtérfogata egységnyi területre” vagy az „abszolút sejtmag-térfogat” átlag ± SEM értékével; * p 4. ábra. Az L. reuteri növeli a Leydig sejtek proliferációját és a szérum tesztoszteron szintjét.

a. 5 hónapos korban kisszámú proliferáló (Ki-67 +) Leydig-sejt létezett a herék interstitiumában (nyilak). A proliferáló Leydig sejtek szignifikánsan nagyobb arányban voltak probiotikummal táplált egerekben. DAB kromogén, Hematoxylin ellenfestés. Rúd = 25 µm. Az oszlopdiagram y tengelye a Ki-67 + Leydig sejtek átlag ± SEM értékét jelenti. b. A szérum tesztoszteron szintje szignifikánsan magasabb L. reuteri fogyasztásakor, összehasonlítva étrendjüknek megfelelő kontrollokkal. Az y tengelyen lévő számok megfelelnek a szérum tesztoszteronszint átlag ± SEM-nek ng/ml-ben; * p 5. ábra: A diétás L. reuteri megmenti az egereket az életkorral összefüggő here atrófiában.

a. A svájci egér herék reprezentatív szövettana 12 hónapos korban. Az idős kontroll egér herék atrófiás szemcsés tubulusokat mutattak. Ezzel szemben az L. reuteri táplált egerek ST-epiteliuma normálisan normális volt, ritka atrófiás tubulusokkal. Hematoxilin és eozin. Rúd = 100 µm. Az oszlopdiagramon az y tengely az egyes kísérleti csoportokban számolt atrófiás/teljes ST arány átlag ± SEM értékét jelenti; ** p 6. ábra. Az IL-17 szisztémás kimerülése összefoglalja az L. reuteri reproduktív fitnesz tulajdonságait.

Az ál-IgG-vel kezelt kontroll egerekhez képest 12 hónapos IL-17A-ból kimerült egereknek volt a. megnövekedett páros here súly; b. megnövekedett keresztmetszeti ST területek; c. megnövekedett csírasejt-magtérfogat d és e. megnövekedett interstitialis Leydig-sejtek területe. Hematoxilin és eozin. Rúd = 100 um; f. - megnövekedett Leydig sejtmag mennyisége és a herénkénti teljes szám és g. csökkent ST atrófia. * p 5 organizmus/egér/nap, vagy színlelt E coli K12 3,5 × 105 szervezet/egér/nap ivóvízben. Az ivóvizet hetente kétszer cserélték ki.

Az interleukin-17A szisztémás kimerülése anti-citokin antitestek alkalmazásával

A 6 hónapos vagy annál idősebb egereket anti-IL17A antitest (17F3 klón; BioXcel, Libanon, NH) intraperitoneális injekciójával kezeltük egérenként 500 ug-val hetente háromszor, legalább négy hétig. Ezután az egereket eutanizáltuk, és összehasonlítottuk az életkornak megfelelő egerekkel, amelyek csak izotípus-illesztett ál-IgG antitestet kaptak.

A szérum tesztoszteron mérései

A terminális szívvérgyűjtéseket eutanáziával végezték el délután közepén, hogy normalizálják a tesztoszteron cirkadián ritmusra gyakorolt hatását. A RadioImmunoAssay-t (RIA) Coat-A-Count Total Testosterone RIA kit (Siemens Diagnostics CA) segítségével végeztük, az AniLytics Inc. (Gaithersburg MD).

A spermiumok minőségének meghatározása

C02-t alkalmazó humánus eutanázia után mindkét herét elkülönítettük, hogy eltávolítsuk a kombinált epididymális és vas szöveteket egy adott hím egérből. A szövetet azonnal műanyag Petri-csészébe helyeztük, és 1 ml FHM-oldatba (speciális táptalaj, Millipore) merítettük. Boncoló mikroszkóp alatt spermiumokat mozgattunk meg az epididymákból és a vas deferensekből, 16 g-os tűvel végzett mikrodisszekció segítségével. Az edényt CO2 inkubátorba helyeztük 37 ° C-on 10 percig, hogy lehetővé tegyük a spermiumok teljes mozgósítását. A spermiumokat ezután 1-10-szeres szuszpendáljuk FHM-mel, hogy hemocitométerrel (Fisher) értékeljük a spermiumkoncentrációt. A spermium koncentrációját/ml kiszámítottuk (hígítási tényező) × (számolásszám négy négyzetben) × (0,05 × 106) alkalmazásával. A spermium aktivitását az aktívan mozgó spermiumok számaként/a spermiumok teljes számaként értékelték [54] - [56].

Hisztopatológia és immunhisztokémia

A szövettani értékeléshez a heréket semleges pufferelt formalinban rögzítettük, keresztben kettévágtuk, paraffinba ágyazottuk és 4 µm-nél vagy 10 µm-nél szétvágtuk a sztereológia szempontjából. A soros metszeteket hematoxilinnal és eozinnal festettük és immunhisztokémiai (IHC) módszerrel. Nyúl monoklonális anti-Ki-67 (Cell Marque, Rocklin, CA) vagy poliklonális hasított kaszpáz-3 (Cell Signaling, Beverly, MA) antitesteket használtunk az IHC-hez. A hő által indukált antigén-visszanyerést CC1 epitóp-visszakereső oldattal (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) végeztük ki-67-hez vagy pH 6-os citrátpufferrel kaszpáz-3-hoz.