A proteinuria megelőzi az agyi ödémát agyvérzésre hajlamos patkányokban

A Nefrológiai (ELAB, MS, HAK, JAJ) és a Kísérleti Neurológiai (PRDB), valamint a Patológiai (GHJ) osztályokról, az Utrechti Egyetemi Kórház és az In Vivo NMR Tanszék, Bijvoet Center, Utrechti Egyetem (ELAB, KN), Utrecht, Hollandia.

Absztrakt

Háttér és cél- A magas nátrium bevitelnek kitett, stroke-ra hajlamos, spontán hipertóniás patkányokban (SHRSP) súlyos magas vérnyomás, agyi ödéma és proteinuria alakul ki, amelynek szervkárosodása és korai halála következik be. A sorozatosan alkalmazható MRI egyedülálló lehetőséget kínál a változások időbeli és kvantitatív összefüggéseinek tanulmányozására és arra, hogy a nátrium-bevitel csökkenése csillapíthatja-e a kialakult agyi ödémát.

Mód—SHRSP-t 1% NaCl-nak tettünk ki ivóvízben. Az agyi MR-t, a proteinuriát és a szisztolés vérnyomást (SBP) sorozatosan mértük. Az agyödéma (T2-súlyozott MRI) kimutatása után 6 patkányt leöltek szövettani vizsgálat céljából, hogy megerősítsék az agyödéma diagnózisát. A többieket további 7 napon keresztül követtük nyomon, miközben folytattuk a sótöltést (n = 10, 1. csoport), vagy a nátriumbevitel normalizálása után (n = 7, 2. csoport).

Eredmények—SHRSP változatlanul 30 nap alatt (8-54 nap alatt) alakult ki agyi ödéma. Ezen a ponton 23 patkányból 16-ban nem voltak neurológiai tünetek. Az SBP 1 hétig emelkedett az agyi ödéma kimutatása előtt, majd körülbelül 265 Hgmm-re stabilizálódott. A proteinuria minden esetben megelőzte az agyi ödémát, a 40 mg/d-t meghaladó koncentráció előre jelezte az agyi ödéma kialakulását 9 nap alatt (3 és 15 nap között). Lineáris összefüggés volt (R= .62, P 1 2 és a stroke előfordulása. 3 4 5 Az étrendi sókorlátozás csökkenti a stroke kockázatát és mortalitását. 6 Az SHRSP a malignus hipertónia kísérleti modellje, és magas (80%) az agyi érrendszeri megbetegedések előfordulása. 7 A nátrium bevitelének megemelkedése 8 hetes kortól felgyorsítja a vérnyomás növekedését és az agyi vazogén ödéma megjelenését az SHRSP-ben. 8 Így a fiatal SHRSP megfelelő modell a malignus hipertónia és az agyi érrendszeri betegségek nátrium bevitelével összefüggő kialakulásának tanulmányozására. Az agyi vazogén ödéma mellett az SHRSP proteinuria kialakul, 7 8 amelyet a prognosztikai marker fontos prognosztikai markerként jelent a stroke kialakulásában. 9.

Anyagok és metódusok

Állatok

A 6 hetes férfi SHRSP-t (n = 23) az IFFA Credo-tól (L'Arbresle, Franciaország) szereztük be. Állandó körülmények között (nappal/éjjel: 12/12; páratartalom, 55%; hőmérséklet, 22 ° C) tartották őket, szabad hozzáférést kapva egy szokásos patkány-chow-hoz (RMH-TM patkány-chow: fehérje 22,2%, zsír 4,8%; 0,85% kálium; 0,40% nátrium; Hope-Farmok), és ad libitum engedett vizet. A protokollt az Utrechti Egyetemi Testület jóváhagyta a kísérleti állatokon végzett vizsgálatokhoz.

Jegyzőkönyv

A kiindulási méréseket minden patkánynál 7 hetes korban összegyűjtöttük, hogy meghatározzuk az agyi ödéma standardizált küszöbét minden egyes patkányban (lásd alább). Ezt követően 8 hetes korban az összes patkányt 1% NaCl (170 mmol/l) ivóvízben magas sóbevitelre váltották az agyödéma megjelenésének felgyorsítása érdekében. 8 A patkányokat naponta megfigyelték nyilvánvaló neurológiai tünetek miatt, és heti vérnyomásmérést, az agy T2W MRI-jét és metabolikus vizsgálatokat végeztek, utóbbiak a nátrium-bevitel, a vesefunkció és a proteinuria értékelésére (lásd alább). Ezt addig folytattuk, amíg az agyi rendellenességeket T2W MRI-vel (0. napként definiáltuk) nem észleltük. Ha patkány viselkedési diszfunkciót mutatott, azonnal interaktív képalkotást hajtottak végre.

Az első rendellenességek T2W MRI-n való megjelenése után a patkányokat három csoportba randomizálták. Az patkány miatt hat patkányt leöltek, hogy értékeljék az MRI-változások jellegét (0. csoport). Ezeket a patkányokat nem vették fel a kvantitatív adatok elemzésébe. Az 1. csoport (n = 10) folytatta a magas sóbevitelt, és a 2. csoportot (n = 7) normál sóbevitelre váltották. Az 1. és 2. csoportot T2W MRI-vel vetették alá a 3. és 7. napon, és metabolikus vizsgálatoknak vetették alá a 6. napon. 7 nap elteltével ezeket a patkányokat kóros vizsgálatnak vetették alá, hogy támogassák az MRI-adatok értelmezését.

Vesefunkció és vérnyomás

A heti metabolikus vizsgálatokhoz a patkányokat lemértük, majd 24 órán át egyenként metabolikus ketrecekben helyeztük el. Ezen mérések során megmérték az élelmiszer- és a vízbevitelt, és a vizeletet összegyűjtötték. Meghatároztuk a vizelet térfogatát, valamint a nátrium-, kreatinin- és fehérjekoncentrációkat. A plazma kreatinin meghatározásához a farokartériából származó vért egy MRI-ülés előtt heparinban gyűjtöttük, és azonnal centrifugáltuk 10 percig 3000 ° C-on.g. A vizelet fehérjét Bradford módszerrel határoztuk meg. A plazmában és a vizeletben található kreatinint kalorimetriásan határoztuk meg. A szisztolés vérnyomást hetente mértük farok-mandzsetta pletizmografiával (IITC) eszméletlen patkányokon, 37 ° C-os környezeti hőmérsékleten történő előmelegítés után.

Szövettan

Közvetlenül az utolsó MRI-ülés után, a 7. napon, az érzéstelenített állatok mellkasát kinyitották, és perfúzió céljából egy perfúziós kanült helyeztek a szív bal kamrájába. Izotóniás heparinizált (270 NE/kg) sóoldattal (2–3 perc) mossuk, majd azonnal perfúziós rögzítést követünk 4% formaldehiddel 0,1 mmol/l foszfátpufferben, az utolsó mért szisztolés vérnyomás kétharmadának megfelelő nyomáson. pletizmográfiai farok-mandzsetta módszerrel. Az agy tíz μm-es szakaszait (10 szakasz 500 μm-es időközönként) hematoxilin/eozin és luxol gyorskékkel festettük. A spontán elhullott patkányok agyát formaldehidben gyűjtötték a szövettani vizsgálat céljából.

T2W MRI

Miután 1% halotánnal N2O/O2-ban (70/30) érzéstelenítést indukáltunk, a patkányokat ugyanazzal a keverékkel intubáltuk és mechanikusan szellőztettük az MRI-ülés során. Megfigyeltük a kilélegzett CO2-t, és a test hőmérsékletét 37 ° C-on tartottuk fűtött vízpárna alkalmazásával. A mozgás megakadályozása érdekében a patkányokat sztereotaxiás tartóba rögzítettük és 4,7-T, 200 - 400-NMR spektrométerbe (SIS Co) helyeztük. 120 mm-es Helmholtz tekercset használtunk mind az átvitelhez, mind a jel vételéhez. Szagittális felderítő kép után koronás, többszeletes spin-echo T2W MRI, lefedve az egész agyat (25 db 1 mm-es szelet; TE/TR, 60/3000; mátrix, 128 × 128; látómező, 40 × 40 mm; két átmenet ) elő lett adva.

T2W MRI értékelés

Az agyat autokontúrozással szegmentálták a környező képhez, amely elemzés automatikusan generál kontúrokat élkövetéssel egy bináris maszkon, amelyet az intenzitás felső és alsó küszöbértéke határoz meg. Mindegyik állatból a kiindulási SIIS-t gyűjtöttük a sótöltés előtt. Ebben a SIIS-ben 25 kisagyi T2W képet (40 × 40 × 1 mm) rostral a kisagyból gyűjtöttünk össze oly módon, hogy az agy rostralis/caudalis, bal/jobb és dorsalis/ventralis tengelyei párhuzamosan helyezkedjenek el z, x, és y az NMR spektrométer mágnesének tengelyei, ill. A kisagy/cerebrum vonal felé haladó négy szeletet referenciaterületnek tekintették, ahol ödéma soha nem fordult elő (REFerence terület). Ezt megerősítették (lásd: „Eredmények”). Az agy ezen a vonalon fennmaradó részét az agykérgi területű utolsó szeletig elemeztük az agyödéma megjelenése szempontjából. Erről az agyterületről és a referencia területről számoltuk ki a pixelek átlagos intenzitását (mi) (o BRAIN SIIS mi és o REF SIIS mi, ill. Az alapvonal szórása (ς) o Agyi SIIS mi is kiszámításra került.

A szabványosított küszöb, o AJB agy standardizált küszöbértéke az agyban egyedülálló az egyes állatok esetében, és a következőképpen határozható meg:

Statisztika

Az adatokat kétirányú ANOVA-val értékeltük ismételt mérésekhez, majd páronkénti többszörös összehasonlítási eljárással (Student-Newman-Keuls módszer). Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. P (17) Innentől kezdve az ödéma változatlanul az ipsilaterális fehér anyaggá fejlődött. Bizonyos esetekben az ödéma a corpus callosumon keresztül terjedt az ellenoldali fehér anyagra. Az ödémát soha nem figyelték meg a kisagyban. A vazogén ödémás helyeken alkalmanként másodlagos vérzéses foltok jelentkeztek.

A 3. ábra a cerebrum százalékos ödémás képpontjait mutatja, amelyek 13–14 szeletet öleltek fel, és azokat a szeleteket a cerebellum/cerebronthoz képest az első kéregterület nélküli szeletig tartalmazta. Az ödémát minden patkányban meghatároztuk egy egyedi küszöbértékhez viszonyítva, amelyet úgy határoztak meg, hogy az átlagos pixelintenzitás ± az alapvonal standard eltérésének kétszerese. Következésképpen a pixelek 5% -a ezen a tartományon kívül esik, definíció szerint 2,5% felett és 2,5% alatt. Az e tartomány fölötti pixelek tehát (definíció szerint) „ödémásak” az alapvonalon. A 0. napon az 1. csoportba tartozó patkányok agyának vizsgált részében a képpontok 5,8 ± 1,1% -a, a 2. csoportban pedig a pixelek 4,9 ± 0,5% -a volt ödémás. Ezek a számok nem különböztek, de mindkettő jelentősen eltért az előző időpontoktól (-3. Nap és az alapvonal; P 12 18 Egymást követő agyképek segítségével számszerűsíteni tudtuk az ödémát a pixelintenzitás növekedéseként egy meghatározott kiindulási küszöbhöz viszonyítva. Az SHRSP-ben az elsődleges és a másodlagos elváltozás helye és mérete változó, és gyakran az agy elsődlegesen érintett oldaláról terjed az kontralaterális oldalra. Ezért össze kellett kapcsolnunk a kisagy pixelintenzitását a kisagyon kívüli referenciaterület pixelintenzitásával. A hipertóniás patkányokban a kisagy mindig ödémamentes. 7 19 Ezt a jelen tanulmány is megerősítette, megerősítve e terület referenciaként történő használatát. Ennek a referenciaterületnek a használata lehetővé tette az inter-imaging variabilitás korrekcióját is. Ez a megközelítés lehetővé tette számunkra az agyi ödéma progressziójának és regressziójának kvantitatív elemzését, amely hatékony technikát kínál a jövőbeli vizsgálatokhoz.

Az SHRSP körülbelül három hónapos korban, vagyis a sóterhelés megkezdése utáni 30 napos mediánban (tartomány: 8 és 54 között) alakult ki agyödémában. A T2W MRI elváltozásait hiperintenzív pixelekkel jellemeztük a T2 megnyúlása eredményeként. A T2-megnyúlás, az agykárosodás érzékeny MRI-mutatója ödémával jár. 12 16 20 Alkalmanként hiperintenzív képpontokat kombináltak hipointense pixelekkel, utóbbiak a T2 redukció eredményeként jöttek létre, ami vérzésre utal. A T2-csökkenés összhangban van a deoxihemoglobin paramágneses hatásaival. 21 A 0. napon végzett kiterjedt agyi vérzés nem volt gyakori (3/23 patkány). Később néha vérzés jelentkezett, mind az eredetileg, mind az újabban érintett területeken.

Amíg a patkányok magas sótartalmú étrendet folytattak, az agyödéma jól korrelált a proteinuriával, rámutatva az agyi érrendszer és a vese glomeruláris kapillárisainak permeabilitásának párhuzamos változására. Természetesen ez nem utal oksági kapcsolatra a proteinuria és az agyödéma között. Valójában az agyödéma stabilizálódása a nátriumbevitel normalizálása miatt a proteinuria jelentős csökkenésével járt. Lehetséges, hogy a nátriumbevitel normalizálódása után az SHRSP képes a nátrium egyensúlyának elérésére a preglomeruláris érellenállás helyreállításával. A preglomeruláris vaszkuláris rezisztencia fenntartása megakadályozza a glomeruláris magas vérnyomást, 33 és a glomeruláris hipertónia előfeltétele a proteinuria hipertóniás vesebetegségben. 34

Összefoglalva, az agyödéma azonosítása a T2W MRI ismételt elvégzésével sóval töltött SHRSP-ben kiderült, hogy ebben a modellben a proteinuria mindig megelőzi az agyi ödémát, és hogy az agyödéma gyakran megelőzi a neurológiai tüneteket. Az agyi ödémát tartalmazó százalékos arány kvantitatív értékelése lehetővé tette számunkra, hogy korreláljunk az agyödéma és a proteinuria között. Ezenkívül a nátriumbevitel normalizálása megakadályozta az agyödéma előrehaladását és a proteinuria csökkenését. Ezek a hatások, amelyek nem a vérnyomás csökkenése miatt következtek be, összefüggésben lehetnek az extracelluláris folyadék térfogatának helyreállításával, így az agyban a folyadék extravazációja a sérült vér-agy gáton keresztül az eltávolítással és a vese glomeruláris kapillárisában egyensúlyban van. a nyomást az upstream vaszkuláris ellenállás helyreállításával normalizálják. Ezek a mechanisztikus hipotézisek további tanulmányozásra várnak.