A Qiliqiangxin megvédi a szív ischaemia-reperfúziós sérüléseit az mTOR útvonal aktiválásával

Dr. Xinli Li és Dr. Junjie Xiao

Kardiológiai Tanszék, a Nanjing Orvostudományi Egyetem első kapcsolt kórháza,

300 Guangzhou Road, Nanjing 210029, (Kína) és Regenerációs és Öregedési Labor,

Kísérleti Élettudományi Központ, Élettudományi Iskola, Sanghaji Egyetem,

333 Nan Chen Road, Sanghaj 200444, (Kína)

E-mail [email protected] és e-mail [email protected]

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

Facebook
Twitter
LinkedIn
Email

Absztrakt

Bevezetés

A szívkoszorúér elzáródása által okozott akut miokardiális infarktus (MI) a szívműködési zavar és a szívelégtelenség (HF) gyakori oka [1]. Az akut MI-ben szenvedő betegek kezdeti kezelésének elsődleges célja a szívizom perfúziójának korai helyreállítása [1]. Jelenleg a farmakológiai terápia és a perkután koszorúér-beavatkozás fejlődése a betegek többségénél a tünetek megjelenése után rövid időn belül helyreállíthatja a szívkoszorúér-áramlást [2]. A véráramlás helyreállítása azonban kiterjesztheti a szívsérülést, ezt a jelenséget reperfúziós sérülésnek nevezik [3,4]. Az akut MI után a bal kamrai (LV) káros átalakulása, amelyet LV dilatáció és fibrózis jellemez, a HF későbbi kialakulásának kritikus meghatározója [5]. Az LV átalakítása szintén fontos patofiziológiai jellemző az ischaemia-reperfúziós (I/R) sérüléseknél [6]. Ezért az I/R sérüléstől és/vagy a káros átalakulástól hatékonyan védő utak azonosítása új terápiás megközelítésekhez vezethet az LV átalakulása és a HF enyhítésére akut MI után.

A rapamicin emlős célpontja (mTOR) az inzulin-PI3K-Akt tengely fontos közvetítője számos szervben, beleértve a szívet is [7]. Az mTOR két funkcionális komplexet alkot: a rapamicinre érzékeny mTOR 1 komplexet (mTORC1) és a rapamicinre érzéketlen mTOR 2 komplexet (mTORC2) [8]. Az mTORC1 aktiválja a p70S6 kinázt, amely foszforilálja az S6 riboszomális fehérjét, és gátolja a 4E-kötő fehérje 1 (4EBP) kötését az eukarióta transzlációs iniciátor 4E-hez, ami a transzláció elősegítését eredményezi [9]. Az mTORC2 aktiválja az Akt-ot, amely a kardiomiocita túlélésének kulcsszabályozója, foszforilezéssel a Ser473-on [10,11]. Korábbi vizsgálatok farmakológiai mTOR-gátlók, köztük rapamicin alkalmazásával mindkét esetben in vivo és ex vivo az MI modelljei eltérõ hatásokat találtak. Néhány jelentés bebizonyította az mTOR aktiváció jótékony hatásait az I/R modellekben [12,13,14,15,16]; fordítva, egy másik jelentés az mTOR gátlás kardio-protektív hatásait írta le [10]. Így az mTOR szerepe a szívműködésben és az LV átalakulásában az I/R sérülés után még nem meghatározott.

A Qiliqiangxin kapszula (QL) egy kínai szabadalmi gyógyszer, amely nemrégiben végzett krónikus szívelégtelenségben szenvedő betegek kezelésében végzett klinikai vizsgálatunk során hatékonynak és biztonságosnak bizonyult [17]. A QL 11 kínai gyógynövényt tartalmaz, a Radix Astragali és az Aconite Root tartalmazzák a fő hatóanyagokat [18]. A Radix Astragali köztudottan csillapítja a szív károsodásának átalakulását az MI és a hipertrófia után [19]. Az azonban továbbra sem ismert, hogy a QL-nek van-e szerepe a szívműködésben és az LV átalakításában az I/R sérülés után. Ezért a jelen tanulmány célja a QL jótékony hatásainak felmérése volt az egerek I/R sérülésére és a lehetséges mechanizmusok feltárására.

Anyagok és metódusok

Állatok

Nyolc-tíz hetes C57BL/6 hím egereket (20-25 g) a Nanjing Orvostudományi Egyetem Laboratóriumi Állatközpontjából szereztünk be, és 12 órás sötét/világos ciklusban és szabad hozzáférést kaptunk az élelemhez az egérjólétre vonatkozó előírásoknak megfelelően. Ez a tanulmány megfelelt a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó előírásoknak (Nanjingi Orvostudományi Laboratóriumi Állatközpont), és az összes eljárást a Nanjing Orvostudományi Egyetem laboratóriumi állathasználati alkalmazásának etikai felülvizsgálata hagyta jóvá.

In vivo I/R modell

Az I/R modellt a korábban közölt tanulmányok alapján hozták létre [20,21,22,23]. Röviden, az állatokat altattuk i.p. ketaminnal és szevoflulollal intubálva és szellőztetve. Bal oldali thoracotomiát hajtottunk végre, és a bal elülső ereszkedő koszorúert (LAD) 7-0 selyemvarratokkal ligáltuk, a LAD fölé helyezett PE-10 csőszakasszal, 1 mm-re a normálisan elhelyezkedő bal pitvar csúcsától. 45 perces ischaemia után a LAD ligatúra felszabadult, és a reperfúzió vizuálisan megerősítést nyert. Az eljárás során a testhőmérsékletet 37 ° C-os melegítő lemezzel tartottuk. Az operált egereket az infúzió nagysága, a fibrotikus terület és a jelátviteli út értékelése céljából az I/R után 1 és 7 nappal eutanizáltuk. A színlelt műveleteket hasonló módon hajtották végre, de a LAD varrása nélkül.

In vivo QL és Rapamicin kezelés

A QL-t a Shijiazhuang Yiling Pharmaceuticalic (Hebei, Kína) biztosította. A növényi gyógyszereket hitelesítették és marker vegyületekkel standardizálták a Kínai Gyógyszerkönyv 2005 (National Pharmacopoeia Committee, 2005) szerint. A QL port normál sóoldatban (NS) oldottuk. Az egereket randomizáltuk intragasztrikus kezelésre QL-rel (0,5 g/kg/nap, n = 25) vagy NS-vel (n = 25) [17,24,25]. Az áloperált egereknek QL-t (0,5 g/kg/nap, n = 10) vagy NS-t (n = 10) is kaptak. Az összes egeret három napig kezeltük a műtét előtt és utána, egészen az eutanáziáig. Annak megvizsgálása érdekében, hogy szükséges-e mTOR aktiváció a QL védőhatásaihoz I/R sérülés esetén, Rapamycint (specifikus mTOR inhibitor, 5 mg/kg) injektáltunk a farokvénán keresztül 10 perccel az I/R szív I/R előtt. + QL csoport.

A szívinfarktus méretének mérése

Az I/R után 24 órával az egereket altattuk i.p. 0,4-0,75 mg/g tribromoetanollal. Ezután 1 ml Evans kéket (0,01 g/ml; BioSharp, Kína) lassan befecskendeztek az alsó vénába, és a szívet azonnal eltávolították [26,27]. 10 percig -20 ° C-on történő tárolás után a szívet 5 vagy 6 keresztirányú (1 mm vastag) szeletre vágtuk a hosszú tengely mentén. Ezután a szeleteket 1% trifeniltetrazolium-kloriddal (TTC, Amresco, USA) festettük citrátpuffer oldatban (ph = 7,4) 10 percig 37 ° C-on, hogy meghatározzuk a veszélyeztetett területet (AAR) [20,21,22, 23]. Ezután az összes szeletet 4% paraformaldehiddel rögzítettük, lefényképeztük és elemeztük. Amint arról korábban beszámoltunk [28,29], az infarktus területe (IA) fehérnek tűnt, míg a nem infarktusos, de veszélyeztetett terület vörös volt. A végső infarktus méretét az IA és az AAR arányában fejeztük ki, amelyet számítógépes planimetriával számítottunk (J kép, 1.44 verzió, NIH, Bethesda, MD).

Echokardiográfia mérése

A szívműködést egy Vevo2100 (VisualSonics Inc., Toronto, ON, Kanada) nagyfrekvenciás ultrahangos rendszeren értékeltük, 30 MHz-es központi frekvencia-leolvasó fejjel az I/R műtét után 1 és 7 nappal. Az egereket 1-2% izoflurángőzzel 1: 1 arányú oxigénelegyben érzéstelenítettük egy orr-kúpon keresztül egy fűtőpárnán a normotermia fenntartása érdekében. A bal kamrai ejekciós frakciót (LVEF;%) és a bal kamrai frakcionális rövidülést (LVFS;%) a Vevo2100 rendszert kísérő irányelvek szerint értékeltük.

Szövettani elemzés

A morfológiai változások és a szívfibrózis mértékének kiértékeléséhez a szíveket az I/R után 7 nappal gyűjtöttük össze, PBS-ben mostuk, egy éjszakán át 4% paraformaldehidben rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. Mindegyik szívet 4 µm vastag részekre vágtuk, és hematoxilinnal, eozinnal (H&E) és Masson trichrommal festettük. A mikrofonokat Nikon fénymikroszkópon (Nikon, Japán) szereztük be.

Western Blotting elemzés

A reperfúzió után 24 órával a RIPA lízispufferrel (P0013B, Beyotime, Kína) végzett extrakció után össz fehérjét kaptunk a bal kamrai szívizomszövetekből. A fehérjekoncentrációt a Pierce ™ BCA Protein Assay Kit-rel (Thermo Scientific, USA) mértük. Összesen 60 µg összfehérjét elektroforézissel elválasztottunk 4-12% SDS-PAGE-n, majd nitrocellulóz membránokra (Millipore, USA) vittük át. A membránokat 5% sovány tejjel blokkoltuk szobahőmérsékleten egy órán át, és egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk nyulakban mTOR (1: 1000), foszfo-mTOR (Ser2448, 1: 1000), 4EBP ( 1: 1000), foszfo-4EBP (Ser65, 1: 1000), Akt (1: 1000), foszfo-Akt (Ser473, 1: 1000), amelyeket a Cell Signaling Technology-tól (USA) vásároltunk. Ezután a membránokat HRP-konjugált szekunder antitestekkel (1: 2000; Cell Signaling Technology, USA) inkubáltuk szobahőmérsékleten két órán át. A jeleket SuperSignal ECL készlettel (Thermo, USA) detektáltuk Western-blot detektáló rendszerben (Bio-Rad, CA, USA). HRP-konjugált monoklonális egér anti-GAPDH-t (1: 5000; KANGCHEN, Kína) alkalmaztunk a GAPDH-szintek számszerűsítésére. Az eredményeket a GAPDH-ra normalizált sűrűségértékekben fejeztük ki.

Statisztikai elemzések

Az adatokat átlag ± standard átlaghiba (SEM) formájában adtuk meg. A csoportok közötti különbségeket kétfarkú diákok elemezték t-teszt. Többszörös összehasonlításhoz egyirányú ANOVA-t és Bonferroni post hoc tesztet alkalmaztunk. Az egér teljes túlélését az I/R után Kaplan-Meier görbékkel értékeltük és log-rank teszttel hasonlítottuk össze. Az összes statisztikai elemzést az SPSS 15.0 vagy a GraphPad Prism 5. P segítségével végeztük