A rapamicin meghosszabbítja a rákra hajlamos egerek maximális élettartamát

Vladimir N. Anisimov

A Karcinogenezis és Onkogerontológia Tanszékről * N.N. Petrov Onkológiai Kutatóintézet, Szentpétervár, Oroszország; és a Molekuláris és Sejtbiológia, † és Sejt Stressz Biológia Tanszék, Roswell Park Rákkutató Intézet, Buffalo, New York

Mark A. Zabezhinski

Irina G. Popovich

Tatiana S. Piskunova

Anna V. Semenchenko

Margarita L. Tyndyk

Maria N. Yurova

Marina P. Antoch

A Karcinogenezis és Onkogerontológia Tanszékről * N.N. Petrov Onkológiai Kutatóintézet, Szentpétervár, Oroszország; és a Molekuláris és Sejtbiológia, † és Sejt Stressz Biológiai Tanszék, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, New York

Mihail V. Blagosklonny

Absztrakt

Az öregedés az elhízással és a rákkal társul. A kalória-korlátozás lassítja az öregedést és késlelteti a rákot. Bizonyítottak, hogy a rapamicin (mTOR) útjának tápanyag-érzékelő emlős célpontja részt vesz a sejtek és a organizmusok öregedésében. Itt megmutatjuk, hogy az mTOR inhibitor rapamicin megakadályozza az életkorral összefüggő súlygyarapodást, csökkenti az öregedés sebességét, növeli az élettartamot és elnyomja a karcinogenezist transzgénikus HER-2/neu rákra hajlamos egerekben. A rapamicin drámai módon késleltette a daganat megjelenését, valamint csökkentette az állatonkénti daganatok számát és a daganat méretét. Javasoljuk, hogy a rapamicin a szervezet öregedésének lelassításával késlelteti a rákot.

Anyagok és metódusok

Állatok és kísérleti tervezés

Az eredetileg Charles River-től (Hollister, Kalifornia) az Olasz Nemzeti Öregedési Kutatóközpont (INRCA) által nyert homozigóta FVB/N HER-2/neu transzgénikus egereket az N.N. Petrov Onkológiai Kutatóintézet. Az egerek normál laboratóriumi chow-t és csapvizet kaptak ad libitum. 23, 24 Az összes vizsgálatot az etikai normáknak, valamint a nemzeti és nemzetközi irányelveknek megfelelően végezték, és a szerzők intézményi felülvizsgálati testülete jóváhagyta.

Hosszú élettartam tanulmány

Ötvennyolc, 2 hónapos nőstény FVB/N HER-2/neu egeret véletlenszerűen két csoportra osztottak. Az állatok első csoportja 1,5 mg/kg rapamicint (LC Laboratories, Woburn, MA) kapott szubkután (szk.) Hetente 3 alkalommal, 2 héten keresztül, majd 2 hét intervallumokkal, rapamicin nélkül. A második csoportba tartozó egerek s.c. 0,1 ml oldószer rapamicin nélkül és kontrollként szolgált. A rapamicint 95% etanolban oldottuk, majd apirogén steril vízzel hígítottuk 38 μg végkoncentrációig 0,1 ml 2% -os etanolban.

Hetente egyszer az összes egeret tapintották az emlődaganatok megjelenésének kimutatására. A daganatok lokalizációját és méretét regisztráltuk. A neoplasztikus tömegeket féknyereggel mértük, és a fokozatosan növekvő,> 3 mm átmérőjű tömegeket tekintettük daganatoknak. Az egérenként tapintható emlő karcinómák átlagos számát a daganatok kumulatív számaként, a daganatos egerek teljes számára számítva. Az állatokat havonta egyszer lemértük, és egész életük során megfigyeltük őket. 23, 24

Patomorfológiai vizsgálat

Minden állatot boncoltak. Az összes daganatot, valamint a szövetek és szerveket, amelyeknél feltételezhető a tumor kialakulása, kivágtuk, 10% -os pufferelt formalinban rögzítettük és paraffinba ágyaztuk. Öt μm-es szövettani metszeteket festettünk hematoxilinnal és eozinnal, és mikroszkóppal megvizsgáltuk őket. A daganatokat a Nemzetközi Rákkutató Ügynökség ajánlásai szerint osztályozták, a leírtak szerint. 23, 24

Statisztika

A kísérleti eredményeket statisztikailag dolgoztuk fel a variációs statisztika módszereivel, a korábban leírt STATGRAPH statisztikai programkészlet alkalmazásával. 23, 24 Az eltérések jelentőségét a Student t kritérium, Fischer-pontos módszer, χ 2, nem paraméteres Wilcoxon – Mann – Whitney és Friedman RM ANOVA alapján határoztuk meg. A Student – Newman – Keuls módszert alkalmaztuk az összes páronkénti többszörös összehasonlításhoz. A korrelációs együtthatót Spearman módszerrel becsültük meg. 23, 24 A tumor előfordulásának különbségeit Mantel – Haenszel log-rank teszttel értékeltük.

A Gompertz-modell paramétereit a maximális valószínűség módszerével, a nemlineáris optimalizálási eljárással és a „Matlab” sajátírási kóddal becsültük meg; a paraméterek konfidencia intervallumait a bootstrap módszerrel kaptuk meg (lásd Anisimov és mtsai 23, 24).

Kísérleti csoport esetében a Cox regressziós modellt alkalmazták a halál és a daganat fejlődésének relatív kockázatának becslésére a kezelés alatt a kontroll csoporthoz képest: h (t, z) = h0 (t) exp (zβ), ahol h (t, z) és h0 (t) a feltételes veszélyt és az alapveszélyességi arányokat jelöli, β a kezelési csoport ismeretlen paramétere, és z 0 és 1 értéket vesz fel, amely két minta - a kontroll és a kezelési csoport - mutatója.

A heterogén mortalitás 23, 24 szemiparametrikus modelljét alkalmaztuk a kezelés hatásának a gyengeség eloszlására és a kiindulási veszélyre.

Az eredmények matematikai modellezése

A rapamicinnel kezelt csoport (rapamicin csoport) esetében a Cox regressziós modellt alkalmazták a halál és a tumor kialakulásának relatív kockázatának becslésére a kezelés alatt a kontroll csoporthoz képest: h (t, z) = h0 (t) exp (zβ), ahol h (t, z) és h0 (t) a feltételes veszélyt és az alapveszélyességi arányokat jelöli, β a kezelési csoport ismeretlen paramétere, és z 0 és 1 értéket vesz fel, két minta indikátorváltozója - a kontroll és kezelési csoport. A rapamicin csoport esetében a halálozás és az első tumor kialakulásának relatív kockázata alacsonyabb (exp (β) 1 a törékeny egyedek felhalmozódását jelzi a populációban a kontroll csoporthoz viszonyítva. (γ 2 ≠ 0). A rapamicinnel kezelt egerek csoportja kissé megemelte az alapveszélyt a kontroll csoporthoz képest (α> 0, β> 0 paraméterek). A kísérleti csoport átlagosan gyengébb (r> 1) és heterogénebb (γ> 1), összehasonlítva a kontroll csoporttal.

Eredmények

A rapamicinnel végzett kezelés jelentősen gátolta az életkorral összefüggő súlygyarapodást (1A. Ábra). Míg a kontroll egerek élettartama alatt folyamatosan híztak, addig a rapamicint kapó egerek súlyosan növekedtek. Ennek eredményeként a 4 és 10 hónap közötti időszakban a kontroll állatok tömege 62% -kal, és csak 17,5% -kal növekedett a rapamicinnel kezelt csoportban (P> 0,05; 1A. Ábra). Ami a legfontosabb, hogy a kontrollcsoportban csak 4 egér élt túl 11 hónapig (14,3%), szemben a rapamicinnel kezelt csoport 13 állatával (43,3%) (P 1B ábra és 1. táblázat). A rapamicin-kezelés növelte az átlagot (+ 4,1%) és a maximális élettartamot (+ 12,4%; 2. táblázat). Nevezetesen az átlagos élettartam növekedése viszonylag szerény volt, mert az öregedéstől független halálozás tompította (1B ábra, 150–250. Nap). A hosszú életű állatok átlagos élettartama (a túlélők utolsó 10% -a) szignifikánsan nagyobb volt a rapamicint kapó csoportban (+ 11%) a kontrollhoz képest. A Gompertz-modell α-paramétere, amelyet az öregedés mértékének értelmezünk, 1,8-szor alacsonyabb volt a rapamicinnel kezelt csoportban, mint a kontrollban. Minden különbség a kontroll és a kísérleti csoport között statisztikailag szignifikáns volt (2. táblázat) .

A rapamicin hatása az életkorral összefüggő súlygyarapodásra és a nőstény transzgenikus HER-2/neu egerek élettartamára. V: A rapamicin hatása a testsúlyra nőstény transzgenikus HER-2/neu egerekben. Az állatok rapamicin csoportja 1,5 mg/kg rapamicint kapott hetente háromszor, 2 héten keresztül, majd 2 hét intervallumokban, rapamicin nélkül. A kontroll csoportba tartozó egerek oldószert kaptak rapamicin nélkül. Az egereket havonta egyszer lemértük. B: A rapamicin hatása az egerek túlélésére. Az egereket egész életük során megfigyelték, és minden állatot boncoltak. Az élettartam megoszlása a kontroll és a kísérleti csoportokban szignifikánsan különbözött (log-rank teszt, P = 0,00588). A túlélési dinamika jelentős különbségeket mutatott.

Asztal 1

A rapamicin hatása a nőstény HER-2.neu egerek túlélési eloszlására

Csoport A túlélők száma az éves korban 5 mo6 mo7 mo8 mo9 mo10 mo11 mo12 mo13 mo14 mo

Ellenőrzés	28.	28.	28.	28.	21	9.	4	0	0	0
Rapamicin	30	29.	24.	23	22.	19 *	13 *	6 *	2	0

A kontrollcsoport megfelelő életkorával való különbség szignifikáns:

A különbség a kontrollokkal jelentős,

A rapamicinnel kezelt egerekben a tumor előfordulásának kinetikája szignifikánsan lassabb volt, mint a kontroll állatok kinetikája (2. ábra, A és B ábra). Így a kontroll egerek 50% -ánál emlő adenokarcinoma alakult ki a 206. napig, míg a rapamicinnel kezelt csoportban ez az időszak 240 napra meghosszabbodott. Figyelemre méltó, hogy a rapamicin 33,7% -kal, az emlő adenokarcinóma átlagos nagysága 23,5% -kal csökkentette a daganatok számát egy tumoros egérenként (3. táblázat) .

A karcinogenezis elnyomása rapamicinnel. V: A rapamicin hatása a tumor hozamgörbéire nőstény transzgenikus HER-2/neu egerekben. B: A rapamicin hatása a daganatok kumulatív számára nőstény transzgenikus HER-2/neu egerekben. C: A rapamicin hatása a többszörös emlődaganattal rendelkező egerek eloszlására nőstény transzgenikus HER-2/neu egerekben. Csillagok azt jelenti, hogy a Fisher pontos tesztje alapján a számlálási adatokhoz az 1–4, 5–7 és 8–10 daganatot hordozó egerek számának eloszlása szignifikáns, P = 0,0006959.

3. táblázat

A rapamicin hatása az emlős adenokarcinómák (MAC) kialakulására transzgénikus HER-2/neu egerekben

ParaméterekControlRapamicin

Egerek száma	28.	30
Daganatos egerek száma,%	28 (100%)	23 * (76,7%)
Az első emlő adenokarcinóma átlagos látenciája, napokban	206 ± 3,3	240 ± 8,9 † (+ 16,5%)
Az emlő adenokarcinómák teljes száma	233	126.
A daganatok száma daganatot hordozó egérenként	8,3 ± 0,3	5,5 ± 0,6 † (−33,7%)
A MAC átlagos mérete, cm 3	1,7 ± 0,04	1,3 ± 0,08 † (−23,5%)
MAC metasztázisú tüdőbe jutó egerek száma,%	10 (37,0%)	12 (+ 52,2%)
Áttétet hordozó egerek átlagos halálozási ideje	301 ± 10,9	357 ± 7,9 † (−18,6%)
A MAC átlagos mérete, cm	0,5 ± 0,05	0,5 ± 0,06

A különbség a kontrollokkal jelentős,

Vita

Fontos, hogy amint itt bemutatjuk, a rapamicin meghosszabbítja a maximális élettartamot, még akkor is, ha szakaszosan adjuk be (két egymást követő hét, majd kéthetes szünet). Ez az élet meghosszabbításának és a rákmegelőzésnek az emlékeztetése, amelyet az időszakos CR okoz. Például a böjt késlelteti a rákot a p53 -/- egerekben, még akkor is, ha hetente egyszer alkalmazzák őket, és későn kezdődtek. 36 Javasoljuk, hogy a rapamicin időszakos adagolása által okozott öregedési folyamat lelassítása előnyös lenne a magas rákkockázatú emberek számára. Ez különösen fontos, tekintettel arra, hogy a meglévő kemoprevenciós módok nem bizonyították az élet meghosszabbodását.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük három névtelen bírálónak a hasznos megjegyzéseket és javaslatokat.