A szigeti makrofágok a szigetek érrendszeri átalakulását és kompenzációs hiperinsulinémiáját hajtják végre a cukorbetegség korai szakaszában

Absztrakt

A β-sejtek reagálnak a perifériás inzulinrezisztenciára a keringő inzulin növelésével a korai 2-es típusú cukorbetegségben (T2D). A szigetecske átalakítása támogatja ezt a kompenzációt, de ennek a folyamatnak a mozgatórugói továbbra sem ismeretesek. A behatoló makrofágok a késői T2D stádiumban érintettek, de a szigeti rezidens makrofágokon viszonylag keveset tudunk, különösen a korai T2D-ben. Feltételezzük, hogy a szigeti rezidens makrofágok hozzájárulnak a szigetek érrendszerének átalakulásához és hiperinsulinémiához, amelyek sikertelensége gyors T2D-s progressziót eredményez. A kompenzációs hiperinsulinémia genetikai és étrend által kiváltott modelljeinek felhasználásával megmutatjuk, hogy kimerülése jelentősen veszélyezteti a szigetecske átalakulását a méret, az érrendszeri sűrűség és az inzulinszekréciós képesség szempontjából. A szigeti makrofágok kimerülése csökkenti a VEGF-A szekrécióját mind az emberi, mind az egér szigeteken ex vivo, és a redukált VEGF-A hatása funkcionálisan késleltetett újraszerkezetűvé válik az in vivo transzplantáció után. Ezért a szigetek rezidens makrofágjainak új szerepét mutatjuk be a korai T2D összefüggésében, és azt sugalljuk, hogy jelentős hasznosság van a szigeti makrofágok kiaknázásában a szigetek átalakulásának és a szigeti inzulin szekréciós képességének elősegítése érdekében.

Fénypontok

A 2-es típusú cukorbetegség kompenzációs hiperinsulinémiás fázisa jelentős hasnyálmirigy-szigetek átalakításával jár.

A jóhiszemű szigeteken élő makrofágok a diabétesz kompenzációs fázisában nagyrészt in situ proliferációval nőnek.

A makrofágok ablációja súlyosan veszélyezteti a szigetecske átalakulási folyamatát és súlyosbítja a glikémiás kontrollt in vivo.

Az egér és az emberi szigetecske makrofágjai hozzájárulnak a VEGF-A-hoz a szigeti környezethez.

A szigeti makrofágok specifikus eltávolítása késlelteti a szigeti vaszkularizációt kompenzációs hiperinsulinémiás egerekben.

Bevezetés

Annak ellenére, hogy az inzulinrezisztenciát tartják a 2-es típusú diabetes mellitus (T2D), a hasnyálmirigy β-sejt aktivitásának és az inzulinelégtelenségnek a legfőbb alapjellemzői, továbbra is központi szerepet játszik e betegség patogenezisében (1). A β-sejtek kezdetben az inzulinrezisztenciára reagálnak egy olyan kompenzációs homeosztatikus mechanizmus kiváltásával, amely hiperinsulinémiát eredményez, hogy megakadályozza a keringő glükózszint túl magas emelkedését. Ez az adaptív kompenzációs mechanizmus végül meghiúsul a hasnyálmirigy β-sejtjeinek inaktivitása miatt (akár diszfunkció, dedifferenciálás vagy apoptotikus mechanizmusok révén), ami nyilvánvaló T2D kialakulásához vezet (2). Noha a β-sejtek inzulint termelnek, széles körben elfogadott, hogy más szomszédos szigetecske sejttípusok is fontos szerepet játszanak a megfelelő β-sejtek válaszának támogatásában és közvetítésében. A szigetecskék kompenzációs folyamatának meghosszabbítása azáltal, hogy először jobban megismerjük az ehhez hozzájáruló parakrin tényezőket, az életképes stratégia az inzulinelégtelenség és a T2D patogenezis megelőzésére.

A hasnyálmirigy-szigeteken a makrofágok a fő immunsejt-típusok stabil állapotban, de szigetekenként jelenlétük továbbra is alacsony (3). A szigeti makrofágokról már régóta beszámoltak a tartós elhízás és a T2D során, de a szigeti makrofágok megnövekedett funkcionális következményei mindig negatívak voltak. Ezeket a makrofágokat gyakran a szigeti gyulladás és a β-sejtek diszfunkciójának fő mozgatórugójának tekintik, és ezáltal közvetlenül hozzájárulnak a T2D fejlődéséhez (4-7). Másrészt a szigeti makrofágokról is beszámoltak, hogy nélkülözhetetlenek a β-sejtek kialakulásához az embrionális fejlődés során, és a hasnyálmirigy β-sejtjeinek regenerációjának kísérleti modelljeiben kimutatták, hogy a makrofágok támogatják a β-sejtek proliferációját (8). Mivel a makrofágok nagyon plasztikusak, a fenotípusos adaptáció a helyi környezethez gyors, valószínű, hogy a szigeti makrofágok különböző szerepet játszanak a T2D patogenezisspektrum mindkét végén (9–11).

Eddig a szigeti makrofágok vizsgálata a diabétesz patogenezisének későbbi szakaszaira összpontosított, amikor az inzulin szekréció veszélybe került. Például a megnövekedett makrofág-felhalmozódást kóros vizsgálatok igazolták T2D-s betegek hasnyálmirigy-szigeteivel (12, 13), valamint elhízás és 2-es típusú cukorbetegség rágcsáló-modelljeivel (14, 15). Ennek alátámasztására olyan tényezők, mint a glükolipotoxicitás, az endotoxicitás és a szigeti amiloid lerakódás, szerepet játszottak a szigetek gyulladásgátló makrofág-toborzási szakaszában, amelyek a T2D patogenezisét hajtják (16-18).

Viszonylag kevéssé ismertek a szigeti makrofágok a szerény hiperglikémia és hiperinsulinémia korai T2D fázisában. Ez utóbbit megkönnyíti a szigetek átalakítása és a hipertrófia, valamint a β-sejtek hiperpláziája. Az embrionális hasnyálmirigy-fejlődés során bekövetkezett makrofág-részvétel bizonyítékaival és azok jelentőségével a β-sejtek replikációjának támogatásában a hasnyálmirigy-regeneráció kísérleti rágcsáló-modelljeiben elképzelhető, hogy a szigeti makrofágok pozitív hatással lehetnek a szigetek és a β-sejtek működésére (8, 19, 20 ). Ezenkívül a VEGFA által közvetített β-sejtek terjeszkedése kimutatta, hogy fokozott makrofág jelenlétre van szükség a szigeti mikrokörnyezetben (21). Ezek a tanulmányok együttesen utalnak a szigeti makrofágok lehetséges előnyös szerepére. Bár bizonyos a hasnyálmirigy-fejlődés és a sérülést követő β-sejt-regeneráció összefüggésében, a T2D és a β-sejtek kompenzációjának korai szakaszában a makrofágok részvétele továbbra is ködös (22).

Eredmények

Nagyobb számú makrofág a db/db egerek szigetein belül

A hasnyálmirigy-szigeteken makrofágok állnak fenn állandósult állapotban (23), azonban a korai 2-es típusú cukorbetegségben betöltött szerepük még mindig viszonylag ismeretlen. Itt konkrétan a szigetek kompenzációját vizsgáltuk fiatal db/db egerekben (16 hetes és annál fiatalabbak) azzal a hipotézissel, hogy a szigeti makrofágok hozzájárulnak az egerekben ebben a korban észlelt szigetek hipertrófiájához és β-sejtek hiperpláziájához (összefoglalóan szigetnek átalakítás). A leptin-receptor-hiányos B6.BKS (D) -Lepr db/J egér (db/db) szerény, de szignifikánsan megnöveli az éhomi glükózszintet, szignifikánsan magasabb a glükóz-kirándulás az intraperitoneális glükózinjekciót követően, és magasabb a keringő inzulin mindkettő alatt éhomi és glükózstimulált állapotok, összehasonlítva a nem diabéteszes sovány alomtársakkal (sovány) (1A-C kiegészítő ábra). A szigetecske mérete db/db egerekben következetesen körülbelül 3,5-szer nagyobb volt, mint a sovány egereké (1D-E kiegészítő ábra), megerősítve egy korábbi megfigyelést (24). Ezek az eredmények hasonlóak a pre-diabéteszes embereknél tapasztalt metabolikus adaptációkhoz (1, 25, 26), így a db/db egér ideális modell a szigetek kompenzációjának mechanizmusainak tanulmányozásához a korai T2D-ben.

Az emberi és egérsziget makrofágok hozzájárulnak a VEGF-A és a gyulladásos citokinek jelenlétéhez a helyi közegben

A makrofág-kimerülés csökkenti a szigetek átalakulását és az inzulinszekréciót a CSF-1R-vel kezelt HFD-vel táplált egerekben

Megállapítottuk a makrofágok jelenlétét a nem diabéteszes humán szigeteken, és az ex vivo tenyésztés elemzése azt sugallja, hogy az egérszigetekhez hasonlóan számos proinflammatorikus citokin szekretálódik a szigetekről. Sikeresen kimerítettük a makrofágokat humán szigetekről ex vivo klodronát felhasználásával, és megfigyeltük, hogy a VEGF-A és a TNFα együttesen jelentősen csökken. Az egér szigeteivel ellentétben az IL-6 növekedett a makrofág-szegény emberi humán szigeteken, és ez a megfigyelés különösen érdekes, mert számos tanulmány utal az IL-6 β-sejtjeinek védőhatásaira (42-44). Mindazonáltal, hasonlóan az egérszigetekhez, nem volt szignifikáns változás a β-sejt génexpressziós profiljában az emberi szigeteken, amikor a makrofágok kimerültek, ami tovább alátámasztja azt az elképzelést, hogy a szigeti makrofágok nagyobb hatással vannak a szigeti érrendszerre, jobban összehasonlítva a β-ra gyakorolt közvetlen hatással -sejtek. További vizsgálatok szükségesek annak megállapítására, hogy az emberi szigetek makrofág-kimerülésének funkcionális következményei csökkent revaszkularizációt eredményeznek-e, ahogy az egér szigeteinél megfigyelhető.

Anyagok és metódusok

Állatok

Homozigóta diabéteszes (db/db) egereket és a B6.BKS (D) -Leprdb/J egér törzs nem cukorbeteg kontroll alomtársait a Jackson Laboratóriumtól (Bar Harbor, ME) vásároltuk és 12 órás világos/sötét ciklusban tartottuk. az élelmiszerhez és a vízhez való szabad hozzáférés. A CD169-DTR transzgénikus vonalat a korábban leírtak szerint állítottuk elő (51). Az egereket szigorúan életkor és nem szerint egyeztettük a kísérletek során, és az intézményi és nemzeti irányelveknek megfelelően kezeltük őket. A megvásárolt C57BL/6J egerek kivételével (InVivos Pte Ltd, Szingapúr) az összes többi vonalat tenyésztelepként tartottuk a helyi metabolikus kiértékelő létesítményekben, nem SPF körülmények között. Minden állatkísérletet az intézményi és egyetemi etikai bizottságok jóváhagyásával hajtottak végre (# 140905, # A0373, # 2013/SHS/816 és # 2018/SHS/1399). Az előzetes cukorbetegség kiváltása érdekében az egereket vagy magas zsírtartalmú étrenddel etették (# D12492, Research Diets Inc, NJ, USA), vagy a kalóriatartalmú kontroll alacsony zsírtartalmú étrendet (# D12450J, Research Diets Inc, NJ, USA), Eszerint. Az étrendeket –80 ° C-on tároltuk és 4 ° C-ra felolvasztottuk legalább 24 órán át, mielőtt ad libitum adagoltuk az állatoknak.

Makrofág-kimerülés klodronátos kezeléssel

A makrofágok szerepének elemzéséhez a hasnyálmirigy-szigetek működésében és az inzulinszekrécióban a kompenzáció során in vivo kísérleteket végeztünk a makrofágok szigetekből történő kimerítésére. Röviden, klodronátot vagy PBS-t tartalmazó liposzómákat adtunk intraperitoneálisan 10 hetes db/db vagy kontroll egereknek (200 ul; 50 mg/testtömeg kg; clodronateliposomes.com), és 3 naponta folytattuk 2 hétig. A liposzómák PBS-t vagy klodronátot, egy nem toxikus biszfoszfonátot tartalmaztak. Injekció után a liposzómákat a makrofágok emésztik fel és emésztik meg. A klorinát felszabadul és felhalmozódik intracellulárisan, ahol nagy intracelluláris koncentráció esetén apoptózist vált ki (52). Az állatokat 12. héten feláldoztuk, és az utolsó dózist klodronát adtuk egy nappal az áldozat előtt. Az állatokat egy éjszakán át éheztettük, és intraperitoneális glükóz tolerancia tesztet hajtottunk végre. Vért gyűjtöttünk a farokvénából a plazma inzulinszintjének meghatározásához. A kivágott hasnyálmirigyeket és a szigeteket kollagenáz emésztéssel izoláltuk, és a funkcionális elemzéshez használtuk.

Makrofág-kimerülés CD169-DTR egerekben

Összesen 23 8-9 hetes C57BL/6 nőstény egeret használtunk ebben a vizsgálatban, amelyek közül 12 egér CD169-DTR pozitív (DTR +) és 11 DTR negatív (DTR-) kontroll egér volt. Minden egeret etettek 60% HFD-vel 21 napig. 3 naponként intraperitoneálisan összesen 20 ug/kg DT-t injektáltunk, majd az egereket leöltük a hasnyálmirigy és a máj betakarítása céljából. A begyűjtött szöveteket 4% PFA-ban rögzítettük, majd immunfluoreszcencia vizsgálatokhoz mélyhűtött állapotban tároltuk.

Makrofág-kimerülés anti-egér CSF1R injekcióval

A 10 hetes C57BL/6 egereket 60% HFD-vel etettük 21 napig. 2 mg anti-egér CSF1R (CD115, AFS98) (Bio X Cell, USA) antitestet vagy PBS kontrollt háromszor injektáltunk 21 nap alatt (0., 10. és 20. nap). Az immunfluoreszcencia vizsgálatokhoz a szöveteket 4% paraformaldehidben rögzítettük. Az IPGTT, az ITT és a plazma inzulinszinteket a 0., 10. és 20. napon mértük.

Glükóz tolerancia teszt, inzulin tolerancia teszt, inzulin szekréció teszt és inzulin felszabadulás

A glükóz tolerancia tesztek (GTT) elvégzéséhez az egereket 6-12 órán át éheztettük. Ezután az egereknek intravénásán 2,0 g/testtömeg-glükózt és 1 U/testtömeg-kg inzulint injektáltak 4 óra éhezés után az inzulin-tolerancia teszt (ITT) céljából. Az injekció beadása előtt és legfeljebb 120 perccel a vércukor-koncentrációt automatizált glükométerrel mértük a vénás vérben (Vena Saphena). Az inzulinszekréciós teszthez (IST) vérmintákat gyűjtöttünk 0, 15 és 30 perccel glükózinjekció után (2 g glükóz/testtömeg-kg) az inzulin meghatározása céljából ELISA-val. A szigeteket egyenként sztereomikroszkóp alatt boncoltuk. 10 hasonló méretű szigetet gyűjtöttünk össze, és inkubáltuk RPMI 1640-10% borjúmagzati szérumban 37 ° C-on, 5% CO2-ban 2 órán át. Ezeket a szigeteket mostuk és 0,5% (tömeg/térfogat) szarvasmarha szérumalbumin-Krebs-Ringer HEPES-pufferolt sóoldatban inkubáltuk 2,8 mM glükózban, 37 ° C-on, 5% CO2-ban 30 percig, majd 0,5% (wt/vol vol) szarvasmarha szérum albumin-Krebs-Ringer HEPES-pufferolt sóoldat 2,8 mM glükózban, stimuláló 11 mM glükóz önmagában vagy 25 mM KCl 2,8 mM glükóz mellett. Miután 30 percig inkubáltuk 37 ° C-on 5% CO2-ban, a felülúszók inzulin felszabadulását mértük a fent leírtak szerint.

Immunjelzés

A pancreata-kat boncoltuk és egy éjszakán át 4% paraformaldehidben rögzítettük 4 ° C-on, és egy éjszakán át 30% -os szacharóz-oldatba helyeztük 4 ° C-on. A Pancreata beágyazódott az O.C.T. (Tissue-Tek) és 10 mM-os kriosztáton sorozatosan metszjük. Közvetett fehérje lokalizációt úgy kaptunk, hogy primer antitestekkel inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on. A metszeteket tengerimalac antiinzulin (1: 200; Dako, CA, USA), patkány anti-egér F4/80, patkány anti-egér CD68 (1: 200; Bio-Rad, CA, USA), nyúl anti -IBA-1 (1: 200; Wako, VA, USA), kecske anti-egér CD31 (R&D Systems, MN, USA), nyúl anti-egér Ki67 (abcam, MA, USA) és Alexafluorhoz konjugált másodlagos testellenes test 488, 568 és 647 (1: 400). A CD68 + és F4/80 + sejtek százalékos arányát úgy határoztuk meg, hogy az egyes szigeteken a pozitív sejteket/az összes sejtet megszámoltuk. A képalkotást és a mennyiségi meghatározást Zeiss LSM 800 alkalmazásával, airyscan konfokális lézeres pásztázó mikroszkóppal (Zeiss, Thornwood, NY 10594, Egyesült Államok) végeztük, ZEN Blue képelemző szoftverrel és J képpel.

Áramlási citometria

16 hetes sovány és db/db lsleteket feláldoztunk, és a hasnyálmirigy-szigeteket elkülönítettük. Röviden, a donor egerek hasnyálmirigyéből szigeteket izoláltunk kollagenáz emésztéssel (0,8 mg/ml) (Sigma-Aldrich), majd kézi szedéssel. A szigetecskéket szigeti közeggel mostuk: RPMI-1640 táptalaj 1% (térfogat/térfogat) l-glutaminnal, 1% (térfogat/térfogat) penicillin-sztreptomicinnel, 11 mmol/l glükózzal és 10% ( kötet/köt.) FCS. Ezután a szigeteket Accutase® (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) emésztéssel disszociáltuk az egyes sejtekbe. Ezután az immunfestést és az áramlási citometriát elemezzük standard eljárások szerint. A következő antitesteket használtuk: PE-Cy7-jelölt CD45, APC-Cy7-jelölt CD11b, PE-jelzett F4/80, BV421-jelölt MHC II és BV605-jelölt Ly6C (Biolegend, San Diego, CA). A sejteket előkezeltük Fc blokkkal (2.4G2 klón). Az enzim-disszociált hasnyálmirigy-szigetek egysejtű szuszpenzióit 30 percig jégen festettük, majd Fortessa X-20 áramlási citométerrel elemeztük (BD Biosciences, CA, USA).

Citokin/kemokin analízis ex vivo

Az egérszigeteket a fent leírtak szerint izoláltuk. Az izolált szigeteket (~ 100) egy éjszakán át tenyésztettük 10% FCS-t, 2 mmol/l L-glutamint, 100 egység/ml penicillint és 0,1 mg/ml sztreptomicint (komplett CMRL) tartalmazó CMRL-1066 táptalajban. Az egérsziget tenyészet felülúszójában lévő citokint/kemokint a Milliplex® MAP egér citokin/kemokin mágneses gyöngypanel (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA) felhasználásával detektáltuk a gyártó utasításainak megfelelően. Röviden: a felülúszót 96 lyukú lemezekre szélesztettük. Egy éjszakán át mágneses gyöngyökkel végzett inkubálás után a mintákat mostuk és szobahőmérsékleten inkubáltuk detektáló antitestekkel. A mintákat sztreptavidin-fikoeritrin Bio-Plex 200-on történő hozzáadását követően detektáltuk, és a Bio-Plex manager ™ szoftvert (Bio-Rad, CA) elemeztük. A vizsgálatunkban alkalmazott emberi szigetecske-készítmények összhangban voltak az etikai jóváhagyással (NTU Singapore, # IRB-2018-05-052) és a korábban leírt jelentéstételi előírásokkal (53). A HP-006, HP-007 és HP-18330-01 a 46, 58 és 53 éves nőkből izolált és anamnézisben nem szenvedő cukorbetegségű humán szigetek egyedi azonosítója (HbA1c * vezető szerző

A szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenség.