A Yersinia enterocolitica befolyásolja a vastagbél bélgát funkcióját

Nina A. Hering, Anja Fromm, Judith Kikhney, In-Fah M. Lee, Annette Moter, Jörg D. Schulzke, Roland Bücker, Yersinia enterocolitica Affects Bélgát funkcióját a vastagbélben, The Journal of Infectious Diseases, 213. évfolyam, 7. szám, 2016. április 1., 1157–1162. Oldal, https://doi.org/10.1093/infdis/jiv571

Absztrakt

A Yersinia enterocolitica fertőzés korai gyermekkorban akut hasmenést okoz. Az egérfertőzési modell új eredményeket mutat be a vastagbél kóros mechanizmusairól. A tünetek közé tartozik a vizes ürülékkel járó hasmenés és a fogyás, amelyek funkcionális összefüggésben vannak a csökkent transzepitheliális elektromos ellenállással és a megnövekedett fluoreszcein permeabilitással. Y. enterocolitica mind az ileum, mind a vastagbél egér nyálkahártyájában volt jelen. Itt a bakteriális sértés fokális jellegű volt, és változásokhoz vezetett a szoros junction fehérje expressziójában és architektúrájában. Ezek az eredmények összhangban vannak a korábbi sejttenyésztési vizsgálatok megfigyeléseivel, és a hasmenés szivárgásfluxus-mechanizmusára utalnak.

A Yersinia enterocolitica elsősorban akut enteritist és enterocolitist, mesenterialis lymphadenitist vagy ileitist okoz emberben (yersiniosis). Bár a legtöbb esetben az Y. enterocolitica által kiváltott hasmenés önkorlátozó és néhány napon belül megszűnik, számos különféle extraintesztinális következmény vagy szeptikémia alakulhat ki. A súlyos szisztémás fertőzések antibiotikum terápiát igényelnek.

A yersiniosis egy gyakori, zoonózisos, élelmiszer által terjesztett betegség. A baktériumok megszerzésének kockázati tényezőit csecsemőknél és kisgyermekeknél, akiket gyakrabban érintenek, mint a felnőttek, homokozóban való játékként [1] vagy háziállatokkal való érintkezésként azonosították. Németországban ez a bejelentendő fertőzés 2010-ben 4 eset/100 000 lakos és 48 eset/100 000 gyermek előfordulásával fordult elő [1]. Az Y. enterocolitica fertőzés azonban világszerte elterjedt, különböző törzs-specifikus prevalenciával.

Eddig az Y. enterocolitica kóros mechanizmusait elsősorban a szivárgó ileumból származó exudatív hasmenéshez rendelték, ahol a baktériumok tályogokat indukálhatnak a subepitheliumból. A vastagbélre gyakorolt hatásokat azonban alábecsülik, és a TJ feltételezett változását nem vették figyelembe. Jelen tanulmányban arra törekedtünk, hogy megerősítsük a Yersinia-fertőzött vastagbélsejt monorétegeken megfigyelt fokális TJ perturbációval kapcsolatos eredményeinket.

ANYAG ÉS MÓDSZEREK

Fertőzési eljárás

6–8 hetes C57BL/6 nőstény egereket (átlagos súly [± SEM], 17,7 ± 0,2 g; Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) specifikus csíramentes körülmények között (azaz specifikus kórokozóktól mentes házban) tartottunk., és a kísérleteket az állatkísérleti irányelvek szerint hajtották végre. Az egereket orálisan 6x10 7 Y. enterocolitica fertőzéssel fertőztük meg (WA-314 pYVO8 +) [9]. Etikai jóváhagyást az állatkísérletekkel foglalkozó helyi etikai bizottság kapott (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Németország; jóváhagyási szám: G0732/08). A testtömeget naponta mértük, és a székletmintákat összegyűjtöttük, foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) homogenizáltuk, és különböző hígításokban Yersinia szelektív agarra (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Németország) szélesztettük. Az állatokat 2 vagy 5 nappal a fertőzés után eutanizáltuk. Az ileumot és a vastagbelet eltávolítottuk, és megmértük a hosszukat. A mintákat közvetlenül elektrofiziológiai mérésekhez gyűjtöttük, fagyasztottuk a fehérje extrakciójához, vagy 2% paraformaldehidben vagy formalinban rögzítettük mikroszkópos analízishez.

Kísérletek használata

A szövetmintákat Ussing kamrákba helyeztük. 0,1 mM fluoreszcein (332 Da) vagy 0,3 mM fluoreszcein izotiocianát (FITC) -dextran-4000 (4 kDa; Sigma-Aldrich) egyutas impedancia spektroszkópiáját és egyirányú fluxusmérését a korábban leírtak szerint végeztük [10].

Fluoreszcencia in situ hibridizáció (FISH)

A szövetmintákat 3,7% (v/v) formaldehidben fixáltuk PBS-ben (pH 7,4), amely 50% (v/v) etanolt tartalmaz 4 ° C-on. A minták beágyazását hideg polimerizáló gyanta felhasználásával és a FISH-t az előzőekben leírtak szerint hajtottuk végre [11]. A FISH-kísérleteket az EUB338 (biomers.net; Ulm, Németország) pan-bakteriális próbával hajtottuk végre, amely a 16S riboszomális RNS (rRNS) komponens egy részéhez és a NON338 nonszensz próbához kötődik, hogy kizárja a nem specifikus próba kötődést. Az Y. enterocolitica specifikus megjelenítéséhez a 16S rRNS-irányított FISH Y.16S-69 (5′-TAAACTACTTCCCGCTGC-3 ′) próbát használtuk [12]. A tárgylemezeket konfokális lézerszkenneléses mikroszkóppal tettük láthatóvá.

Hematoxilin-eozin (HE) festés

A mintákat 4% pufferelt formalinban rögzítettük és paraffin viaszba ágyazottuk. A HE festést soros szakaszokon (vastagság, 3 µm) végeztük.

Immunfluoreszcencia festés

Az immunfluoreszcens festést és az azt követő lézerszkennelési mikroszkópiát a korábban leírtak szerint hajtottuk végre [10]. A következő antitesteket használtuk: anti-ZO-1, anti-occludin, anti-claudin-5, anti-claudin-8 (1: 100), Alexa Fluor 488 kecske anti-egér vagy nyúl IgG és Alexa Fluor 594 kecske anti egér vagy nyúl IgG (1: 500; Invitrogen, Karlsruhe, Németország). Az atommagokat DAPI-val festettük (1: 1000).

Western Blotting

A szövetmintákat lízispufferben (1 mM Tris-Cl [pH 7,4], 1 M MgCl2, 0,5 mM etilén-diamin-tetraecetsav, 0,5 M etilén-glikol-tetraecetsav és proteáz-inhibitor koktél (Roche, Mannheim, Németország)) összerázva homogenizáltuk. Western-blotot a korábban leírtak szerint hajtottunk végre [6].

Apoptózis festés

A szöveteket 4% -os formalinnal rögzítettük, paraffinba ágyazottuk, és 1 um keresztmetszetekre vágtuk. Deparaffinizálás és leválasztás után a szöveti metszeteket terminális dezoxinukleotidil-transzferáz-közvetített deoxiuridin-trifoszfát nick-end jelöléssel (In-situ Cell Death Detection Kit-Fluorescein, Roche) festettük, az előzőekben leírtak szerint [6].

Statisztika

Az adatokat átlagértékekként és az átlag standard hibájaként fejezzük ki. A statisztikai elemzést kétfarkú Student t teszttel végeztük. A P ≤ 0,05-et statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

EREDMÉNYEK

Változások a nyálkahártya felépítésében és a Yersinia enterocolitica kimutatása distalis egér vastagbélben 2 nappal a fertőzés után. Az A, Hematoxilin-eozin festéssel kiderült, hogy a fertőzött egyrétegekben (nyilak) fokozatosan megnövekszik a kriptahossz. B, A kriptahossz számszerűsítése (P2 vs 87 ± 10 Ω cm2 a kontrollokban; P 2A). Ez a fluoreszcein permeabilitásának 2,5-szeres növekedésével járt (átlag [± SEM], 0,52 × 10–6 ± 0,13 × 10–6 vs 0,18 × 10–6 ± 0,06 × 10–6 cm/másodperc a kontrollokban; P −6 ± 0,05 × 10 −6 vs 0,11 × 10 −6 ± 0,04 × 10 −6 cm/másodperc a kontrollokban; P = 0,07; n = 12). Az ileum mintákon végzett mérések a jelenlegi fertőzési kísérletsorozat során megerősítették a TER csökkenését, amelyet Gogarten és mtsai [4] korábban beszámoltak (az adatokat nem közöljük).

Akadálykárosodás és szűk kereszteződések (TJ) 2 nappal a fertőzés után. A, A hámrezisztencia (R epi) és a szubepitheliális rezisztencia (R sub) hozzájárulását a teljes transzepitheliális rezisztenciához (Rt) egyutas impedancia spektroszkópiával mértük egér disztális vastagbélében. A fertőzés R epi és R sub csökkenését eredményezte a kontrollokkal összehasonlítva (n = 12). B és C, a Yersinia enterocolitica-val fertőzött vastagbél és ileum reprezentatív Western-blotjai (B) és densitometriai kvantifikációja (C) (n = 10–12; * P epi) és szubepitheliális rezisztencia (R sub) a teljes transzepithelialis rezisztenciával szemben (R t ) egér disztális vastagbélben 1 utú impedancia spektroszkópiával mértünk. A fertőzés R epi és R sub csökkenését eredményezte a kontrollokkal összehasonlítva (n = 12). B és C, a Yersinia enterocolitica fertőzött vastagbél és ileum reprezentatív Western-blotjai (B) és densitometriai kvantifikációja (C) (n = 10–12; * P 2B. És 2C. Ábra). A TJ fehérjék immunfluoreszcens festése és az azt követő konfokális lézerszkenneléses mikroszkóppal végzett elemzések a claudin-5 és az occludin regionális redukcióját vagy újraeloszlását mutatták ki. Nagyobb nagyításban a fertőzött vastagbél nyálkahártya-helyein lévő kripták diffúz TJ fehérje jeleket mutattak, amelyek a TJ-ből diszlokálódtak intracelluláris rekeszekbe (2D. Ábra). A claudin-8 architektúráját vagy elosztását nem változtatták meg.

VITA

A Campylobacter vagy Salmonella fajokkal való fertőzés mellett az Y. enterocolitica az étel által okozott bakteriális hasmenés és a gastroenteritis gyakori oka, különösen fiatalabb gyermekeknél. Az Y. enterocolitica által kiváltott hasmenés mechanizmusait azonban még mindig nem ismerjük jól.

Az egér ileumban kizárták az Y. enterocolitica fertőzés miatti aktív anionszekréciót vagy nátrium-függő glükóz transzporter malabszorpciót [4]. Autenrieth és Firsching tályogképződést figyelt meg a mesenterialis nyirokcsomókban [3], ami hozzájárulhat a szivárgáshoz. Nemrégiben azt találtuk, hogy az Y. enterocolitica megzavarja az epitheliális gát működését azáltal, hogy befolyásolja a TJ szerkezetét és a fehérje expresszióját a vastagbél hámsejtjeinek fertőző modelljében. Jelen tanulmányunkban ezért kitértünk arra, hogy az egérmodell Y-enterocolitica által kiváltott hasmenése társul-e TJ-változásokkal. Ezenkívül sokkal kevésbé ismert a vastagbélben lévő Y. enterocolitica-ra adott válasz az ileumhoz képest. A vastagbél azonban fontos szegmens a víz felszívódásában a gyomor-bél traktus mentén.

Jelen tanulmányunkban kimutattuk, hogy az Y. enterocolitica egyedülálló organizmusként és a vastagbél nyálkahártyájának mikrokolóniáiban detektálható egy specifikus FISH próba alkalmazásával. A Yersinia bakteriális inváziója és transzlokációja megfigyelhető volt a fertőzött egerek ileumában, valamint a proximális és disztális vastagbélben. A fertőzés ugyanazon szakaszában a Yersinia által kiváltott gátdiszfunkciót az epitheliális rezisztencia csökkenése és a fluoreszcein permeabilitás növekedése jellemezte. A hám apoptózisának hiányában fellépő hámrezisztenciát elsősorban a TJ integritása határozza meg. A jelen tanulmányban Yersinia által érintett TJ fehérjék, a claudin-5 és a claudin-8, ismert módon erős gátképzőként hatnak [5]. E 2 TJ fehérje csökkent expressziója valóban felelős lehet a hámgát zavaráért. Érdekes módon a claudin-8 expressziójának csökkenése összhangban van az epitheliális egyrétegű eredményeinkkel, ahol az Y. enterocolitica csökkentette a claudin-8 expresszióját a c-Jun jelátvitel interferenciája révén [6].

A tricellulin egy speciális TJ molekula, amely korlátozza a makromolekuláris és az ion áthaladását a tricelluláris TJ központi csövén keresztül, azon a helyen, ahol 3 sejt találkozik egy hámban [13]. A tricellulin expressziójának csökkenése fertőzött állatokban megmagyarázhatja a 4 kDa-os FITC-dextran permeabilitás növekedésének tendenciáját. Ezenkívül az okkludin döntő szerepet játszik a TJ szignalizációban, és feltételezik, hogy kiváltja a tricellulin pozícióját a tricelluár TJ-nél [5]. Ennélfogva az occludin expresszió csökkenése szintén fokozhatja a makromolekulák permeabilitását.

A HE festés nem mutatta ki az immunsejtek beszivárgását a nyálkahártyába. Ezért valószínűtlennek tűnik, hogy ezek a TJ-változások másodlagosan a gyulladásos válasz következményei, mivel gyulladásos bélbetegségekben vannak jelen [14].

Vastagbélsejtek egyrétegű sejttenyésztési vizsgálataink során kimutattuk, hogy az Y. enterocolitica regionális, szakadatlanul elosztott TJ-változások révén megzavarja az epitheliális gát működését [6]. Jelen tanulmányban FISH mikrográfiákat használtak ennek részletesebb tanulmányozására, és az adatok arra engedtek következtetni, hogy a kórokozó sértés valóban nem befolyásolta egyenletesen a nyálkahártyát. Emellett a kripta hossza fokozatosan nőtt. Immunfluoreszcens mikrográfiák alapján nem tudtuk kimutatni a szubcelluláris TJ eloszlási minták globális változásait, de a TJ fehérje szignálok fokális redukciója azonosítható volt, amint ez a Western blot densitometriákból már kiderült. A claudin-5 és az occludin részleges újraelosztása az enterocita TJ doménjéből funkcionálisan hozzáadódik a gátvesztéshez. Ez megint összhangban van a hám monorétegekkel kapcsolatos eredményeinkkel, ahol az Y. enterocolitica szintén regionális TJ változásokat indukált [6].

Ebből és korábbi tanulmányokból arra a következtetésre jutunk, hogy az Y. enterocolitica patomechanizmusa különböző, és hogy a fertőzés nemcsak a vékonybelet, hanem a vastagbelet is magában foglalja. Számos tanulmány kimutatta, hogy az Y. enterocolitica az M sejteken keresztül behatolhat az ileum epitheliális gátjába, Peyer-foltokba transzlokálódhat, és a Yop effektor molekulák transzlokációjával elkerülheti az immunsejteket [15]. Ez a patomechanizmus releváns lehet a baktériumok más szervekbe történő elterjedése szempontjából, ami előfeltétele a posztinfekciós megnyilvánulásoknak. Jelen tanulmány azt bizonyítja, hogy az Y. enterocolitica behatolhat a vastagbél nyálkahártyájába is, ahol jelentős gátdiszfunkciókat okoz, beleértve a TJ fehérje expressziójának és architektúrájának egyértelmű változását. Ennek eredményeként az oldószerek és a víz visszaszivároghat a bél lumenébe, ami korlátozott reszorpciós kapacitást és kevésbé koncentrált ürüléket eredményez. Javasoljuk, hogy az Y. enterocolitica által kiváltott hasmenés szivárgási fluxus mechanizmuson keresztül történjen.

Megjegyzések

Köszönetnyilvánítás. Köszönjük Detlef Sorgenfreinek († 2015. január) kiváló technikai segítségét.

Pénzügyi támogatás. Ezt a munkát a Deutsche Forschungsgesellschaft (Schu 559/11) támogatta.

Potenciális összeférhetetlenség. Minden szerző: Nincsenek jelentett konfliktusok. Minden szerző benyújtotta az esetleges összeférhetetlenségről szóló ICMJE űrlapot. Tárultak azok a konfliktusok, amelyeket a szerkesztők relevánsnak tartanak a kézirat tartalma szempontjából.