Aberrant máj inzulinreceptor izoform A expresszió normalizálódik a 2-es típusú cukorbetegség remissziójával a gyomor bypass műtétje után

Hovatartozás Wakefield Biomedical Research Unit, Patológiai és Molekuláris Orvostani Tanszék, Otago Egyetem, Wellington, Új-Zéland

aberrant

Hovatartozás Wakefield Biomedical Research Unit, Patológiai és Molekuláris Orvostudományi Tanszék, Otago Egyetem, Wellington, Új-Zéland

Kapcsolatok Wakefield Biomedical Research Unit, Patológiai és Molekuláris Orvostudományi Tanszék, Otago Egyetem, Wellington, Új-Zéland, The Wakefield Clinic, Wakefield Hospital, Wellington, Új-Zéland

Kapcsolat Wakefield Biomedical Research Unit, Patológiai és Molekuláris Orvostudományi Tanszék, Otago Egyetem, Wellington, Új-Zéland, John Curtin Orvostudományi Egyetem, Ausztrál Nemzeti Egyetem, Canberra, Ausztrália

  • Vinko Besic,
  • Hongjun Shi,
  • Richard S. Stubbs,
  • Mark T. Hayes

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Besic V, Shi H, Stubbs RS, Hayes MT (2015) Aberrant máj inzulinreceptor izoform A expresszió normalizálódik a 2-es típusú cukorbetegség remissziójával a gyomor bypass műtétje után. PLoS ONE 10 (3): e0119270. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119270

Akadémiai szerkesztő: Victor Sanchez-Margalet, a Virgen Macarena Egyetemi Kórház, Orvostudományi Kar, Sevillai Egyetem, SPANYOLORSZÁG

Fogadott: 2014. október 9 .; Elfogadott: 2015. január 12 .; Közzétett: 2015. március 5

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a munkát a Wellington Medical Research Foundation, a Wakefield Gastroenterology Research Trust és a Wakefield Clinic támogatta, akik hozzájárultak a fizetésekhez és a fogyóeszközökhöz. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A 2-es típusú cukorbetegség (T2DM) az inzulinrezisztencia progresszív növekedéséből ered - az inzulinra gátolt biológiai válasz -, a béta-sejtek működésének és/vagy tömegének progresszív csökkenésével párosulva. Az inzulin jelátvitel az inzulinreceptoron (INSR) keresztül történik [1,2], és az 1980-as években az INSR izoformák felfedezése az inzulin működésében betöltött szerepük átfogó kutatásához vezetett [3]. Azóta rengeteg bizonyíték gyűlt össze az inzulinszignalizációs út receptor utáni eseményeiről, de az INSR izoformák közvetítésének módja még mindig nem világos.

Az exon 11 alternatív splicingje két különböző fehérje-izoformát hoz létre: INSRA (11. exon nélkül) és INSRB (11. exonnal) [3]. A két izoforma funkcionális tulajdonságairól szóló jelenlegi bizonyítékok arra utalnak, hogy az INSRA-n keresztül az inzulin szignálozás túlnyomórészt mitogén, míg az inzulin szignalizáció, bár az INSRB metabolikus (áttekintésre lásd Belfiore et al. [4]). Az INSRA-n keresztüli mitogén jelátvitel részben annak a ligandumokhoz való nagy affinitásának köszönhető, mint például az inzulinszerű II. Növekedési faktor (IGF-II) és a proinzulin, amelyek mind stimulálják a növekedési reakciókat [5–8]. Másrészt a dexametazonnal kezelt HepG2 sejtekkel végzett in vitro kísérletek azt mutatták, hogy az INSRB expresszió növekedése javította az inzulinérzékenységet az inzulin által közvetített glükóz metabolizmus és gén expresszió szempontjából [9,10]. Ezek az adatok összhangban vannak a két izoform szöveti eloszlásával. Mitogén tulajdonságai miatt az INSRA túlsúlyban van a fejlődő szövetekben, például a magzati sejtekben [8], és szükséges lehet az újszülött hepatociták glükózfelvételéhez [11,12]. Ezzel szemben az INSRB differenciált felnőtt sejtekben expresszálódik, és túlnyomórészt az inzulinérzékeny szövetekben, amelyek szabályozzák a glükóz homeosztázist, például a májat [13,14].

Az INSR izoformákon keresztüli jelzés tovább modulálható az INSRA/INSRB heterodimerek képződésével. Az INSR heterodimerek kialakulását egy véletlenszerű összeállítási mintázat szabályozza, amely a két izoform relatív bőségétől függ, így az izoform expressziós szintjének változásai hatással lesznek a sejtszignalizációra. Bár az INSRA/INSRB receptorok megtartják az inzulin iránti affinitásukat, az IGF-II iránti affinitásuk növekedése megegyezik az INSRA homodimerjeivel [15]. A daganatos megbetegedésekben és a T2DM-ben absztratizált INSR expressziós arányokat figyeltek meg. Az INSRA túlzottan expresszálódik különféle rákos megbetegedésekben [16,17], és feltételezik, hogy az elhízás és a cukorbetegség hiperinsulinémiájának rákot elősegítő hatásának lehetséges mechanizmusa [4,16]. A két INSR izoform megváltozott relatív expressziójának szerepe lehet a T2DM-ben, bár az irodalomban ellentmondásos bizonyítékok vannak [18–24]. A legtöbb tanulmány, amely ezeket az izoformákat vizsgálta az inzulinrezisztencia és a T2DM szempontjából, vázizom- és zsírszövetet használt, kevés információ áll rendelkezésre az INSR izoformák relatív expressziójáról a májban.

Több bizonyíték mutat rá a májra, mint a T2DM ontológiájának jelentős szervére. A szabályozott máj-glükoneogenezis a T2DM-ben észlelt éhomi hiperglikémia fő tényezője [25,26]. Néhány állatmodellt használó tanulmány szerint a máj inzulinrezisztenciája az egész test inzulinrezisztenciájához és glükóz intoleranciához vezet [27–29]. Sem a zsír-, sem az izom inzulinreceptor kiütéses egereknél nincsenek patológiás változások a glükóz és az inzulin szintjén [30,31], de a máj inzulin receptor knockout egereken mind hyperglykaemia, mind hyperinsulinaemia alakul ki [28,32]. Végül a máj inzulinrezisztenciájának javulása összefügg a Roux-en-Y gyomor bypass (RYGB) glikémiás kontrollra gyakorolt ​​korai hatásával [33]. Számos tanulmány kimutatta, hogy a máj inzulinrezisztenciája a RYGB műtét után gyorsan javul, de az egész test inzulinrezisztenciája a műtét után akár hat hónapig is fennmaradhat, a súlycsökkenés arányában csökkenve [33–36].

Ebben a tanulmányban a RYGB műtéttel vizsgáltuk a máj INSR izoformáinak szerepét az inzulinrezisztencia patológiájában. Megmértük az INSR izoform mRNS relatív expresszióját a májszövetben olyan személyektől, akiknek T2DM-je volt és nincsenek RYGB-műtéten és egy második műtéten. Túlzottan expresszáltuk az INSR izoformákat a HepG2 humán hepatoma sejtekben annak feltárására, hogy az AKT foszforilációja és a foszfenol-piruvát-karboxikináz (PCK1) transzkripció gátlása különbözik-e az inzulin terhelésre adott válaszként a két izoformában.

Anyagok és metódusok

Megvizsgáltuk az INSR-t és annak izoformáit, olyan májszövet felhasználásával, amelyet morbid elhízott egyének vettek át, akik nyílt RYGB-műtéten estek át, csoportunk másutt részletesen leírva [37]. A mintagyűjtést és az azt követő elemzéseket az Új-Zélandi Egészségügyi Minisztérium Központi Egészségügyi és Fogyatékosságügyi Etikai Bizottsága kifejezetten jóváhagyta (jóváhagyási szám: WGT/00/04/030). A vizsgálatba bevont valamennyi személy írásos beleegyező beleegyezést adott, és minden klinikai vizsgálatot a Helsinki Nyilatkozatban megfogalmazott elvek szerint hajtottak végre. Az összes műtétet ugyanaz a sebész (Prof Stubbs) végezte. A RYGB műtét során májbiopsziát vettünk egy Tru-Cut lágy szöveti biopszia tűvel (Cardinal Health). Második májbiopsziát vettünk olyan személyektől, akik egy későbbi időpontban visszatértek további, nem összefüggő műtétre.

Adatgyűjtés és T2DM diagnózis

Az összes beteg klinikai adatait a RYGB műtét előtt gyűjtötték össze, és a következőket tartalmazta: súly, magasság, testtömeg-index, glikált hemoglobin (HbA1c), éhomi plazma glükóz és éhomi plazma inzulin. A T2DM diagnózisát 1) a diagnózis előzetes dokumentálásával és/vagy a T2DM kezelésének befogadásával vagy 2) orális glükóztolerancia teszten (OGTT) alapuló diagnózis alapján, amelyet rutinszerűen végeznek minden olyan betegnél, akiknek az anamnézisében nem ismert cukorbetegség szerepel. A T2DM-ben szenvedő személyeket tovább osztályozták: korábban fel nem ismert, diétával kontrollált, orális hipoglikémiás gyógyszerekre vagy inzulinfogyasztásra szoruló személyek. Azoknál az egyéneknél, akiknél második májbiopszia volt, a második műtét után 2 hónapon belül megmértük a súlyt, a testtömeg-indexet, a HbA1c-t, az éhomi plazma glükózt és az éhomi plazma inzulint. A T2DM remisszióját Buse és munkatársai ajánlásai szerint határoztuk meg. (HbA1c% -AΔCt). Eukarióta 18S rRNS-t (4319413E, Applied Biosystems) használtunk referencia génként. Az INSRB: A arányát úgy számítottuk ki, hogy az INSRB 2 -ΔCt értékeket elosztottuk az INSRA 2 -ΔCt értékkel.

Az INSR izoform túlzott expressziója

Az INSRB cDNS-t tartalmazó PcDNA3.1 + vektort (egy kedves ajándék C Ronald Kahn laboratóriumától, Joslin Diabetes Center, Boston, USA) az INSRB izoforma túltermelésére használták HepG2 sejtekben (American Type Culture Collection, ATCC szám: HB-8065, Manassas, VA, USA). INSRA cDNS klónt tartalmazó PCMV6-XL4 vektort (OriGene Technologies) alkalmaztunk az INSRA túlzott expressziójára. Kontrollként üres pcDNA3.1 + vektort (Life Sciences) használtunk.

A HepG2 sejteket Dulbecco módosított sas tápközegében (DMEM) tartottuk, 10% magzati borjúszérummal (Life technologies, NZ) és antibiotikummal/antimikotikummal (penicillin 100 egység/ml, streptomicin 100 μg/ml és fungizon 0,25 μg/ml) kiegészítve (Life Technologies). ) 37 ° C-on és 5% CO2-nál. A sejteket 1x105/lyuk sebességgel transzfektáltuk 24 lyukú lemezen (Corning) elágazó láncú polietilén-imin [41,42] (Sigma Aldrich) és Opti-MEM (Life Technologies) alkalmazásával. A sejteket 24 órával a kísérleti manipuláció előtt éheztettük.

AKT foszforiláció

PCK1 RT-qPCR

A sejteket 1 μM inzulinnal stimuláltuk 12 órán át (módosítva [43] alapján). PCK1 TaqMan Assay on Demand (Hs00159918_m1) (Applied Biosystems) segítségével meghatároztuk a PCK1 mRNS szintjét. Az RNS extrakciót, a cDNS szintézist és az RT-qPCR-t a fent leírtak szerint hajtottuk végre. Az inzulinnal (alapvonal) nem kezelt sejteket párhuzamosan futtattuk. Eukarióta 18S rRNS-t (4319413E, Applied Biosystems) használtunk referencia génként.

Statisztikai analízis

Statisztikai elemzést 2 -ΔCt RT-qPCR adatokon végeztünk. A génexpressziós adatokat log2-szeres változásként fejeztük ki grafikus formában, míg a szignifikáns különbségek százalékos változását szövegben jelentettük. Az összes összehasonlítandó csoport normális eloszlását D’Agostino-Pearson teszttel teszteltük. A nem normálisan elosztott adatokat naplózással transzformáltuk, hogy megfeleljenek a paraméteres teszt feltételezéseinek. A post utáni összehasonlításokat párosított t-teszt alkalmazásával végeztük. A Student t-tesztjét alkalmazták két csoport közötti szignifikancia tesztelésére. A változók közötti asszociáció erősségének és jelentőségének tesztelésére a Pearson szorzat-pillanat korrelációs együtthatót használtuk. Tukey post hoc tesztjével az ANOVA-t használták egyik módszerrel a szignifikancia tesztelésére több csoport között. A szignifikancia küszöbértéke 0,05 alfa volt. Az összes elemzést a Minitab15 alkalmazásával hajtottuk végre. A grafikus megjelenítést a GraphPad Prism 5 alkalmazásával hajtottuk végre.

Eredmények

Máj INSRB: mRNS arány NGT és T2DM csoportokban RYGB-nél

Megvizsgáltuk a máj INSRA és INSRB mRNS expresszióját T2DM (T2DM csoport) és anélkül (NGT csoport) szenvedő egyénekben. Az 1. táblázat az NGT és a T2DM csoport antropometriai adatait és metabolikus jellemzőit mutatja be a RYGB műtét körül. A műtét előtt minden egyén kórosan elhízott (BMI> 40 kg/m 2), és egyik csoportban sem volt statisztikailag szignifikáns különbség a BMI-ben. Definíció szerint a T2DM csoport szignifikánsan magasabb HbA1c% -kal rendelkezett (p 1. ábra. Az inzulin receptor A és B izoform mRNS expressziós aránya kórosan elhízott egyének májszövetében RYGB műtét után és után.

(A) INSRB: RYGB műtét aránya (NGT: Normál glükóz tolerancia, n = 19; T2DM: 2-es típusú cukorbetegség, n = 27). (B) A máj INSRB Pearson-termék-pillanat korrelációja: A (log) és BMI (log) arány (n = 46). (C) INSRB: arány RYGB műtéten és után (rsNGT ●: ismételt műtét normál glükóz tolerancia, n = 8; rsT2DM ○: ismételt műtét 2-es típusú cukorbetegség, n = 8). (D) Az INSRA és az INSRB expresszió redője megváltozik RYGB után, RYGB expressziós szinteket használva alapként. Az adatok jelentése átlag + SE.

Máj INSRB: mRNS arány a RYGB műtéten és után cukorbetegeknél és cukorbetegeknél

Megvizsgáltuk az INSRA és az INSRB mRNS expresszióját olyan egyéneknél is, akik normális glükóztoleranciával (rsNGT) vagy T2DM (rsT2DM) rendelkeztek RYGB műtétnél és egy második, nem kapcsolódó műtétnél. A 2. táblázat felsorolja az első és második májbiopszia körüli metabolikus jellemzőket. A második májbiopsziát végző 16 személy közül kettőnek hiányos utókövetési adatai voltak. Sem a műtétnél, sem a lefogyott súlynál nem volt statisztikailag szignifikáns különbség a BMI között a két csoport között, így a súlycsökkenés mint potenciális zavaró tényező megszűnt. Az rsT2DM csoport szignifikáns volt (p 2. ábra. AKT foszforiláció az INSR A vagy B izoformát túlzott mértékben expresszáló sejtekben.

(A) 9 biológiai replikátum AKT-foszforilezése három nap alatt. * Statisztikailag szignifikáns különbség volt az AKT foszforilációban az INSRB-t túlzott mértékben expresszáló sejtek között az üres vektor transzfektált sejtek (Tukey, p = 0,025) és az INSRA túlzott mértékben expresszáló sejtek (Tukey, p = 0,03) között. (B) Az AKT foszforilációjának reprezentatív western blotja az INSRA-t (HepG2-INSRA) vagy az INSRB-t (HepG2-INSRB) túlzott mértékben expresszáló HepG2 sejtekben inzulinkezelés után. Valamennyi Western blot esetében lásd az S1 ábrát. Az adatok jelentése: átlag + SE.

Megvizsgáltuk az INSR izoformák túlexpresszálásának az inzulin által kiváltott PCK1 expresszió szuppressziójára gyakorolt ​​hatását is, mint a májsejtekben a glükoneogenezis szabályozásának markereit (3. ábra). Az üres vektorral transzfektált sejtek inzulinkezelését követően a PCK1 mRNS expressziója 50% -kal csökkent. Az INSRB izoformát túlzott mértékben expresszáló HepG2 sejtek PCK1 mRNS expressziója 90% -kal csökkent a kezelés után, míg az inzulin nem volt hatással az INSRA túlexpresszáló HepG2 sejtekre. Továbbá úgy tűnt, hogy az INSRA túlzott expressziója csökkenti a PCK1 expresszió alapszintjét, bár ez nem érte el a statisztikai szignifikanciát. Ezek az adatok együttvéve azt sugallják, hogy az INSRB helyett az INSRA fontosabb az inzulin-közvetített glükóz homeosztázis szabályozásában.

Az EV csoportokat üres vektorral transzfektáltuk. Az adatok jelentése átlag + SE.

Vita

Az inzulinreceptor izoform arányát a teljes hosszúságú INSR mRNS alternatív splicelésével határozzuk meg. Az INSRA izoform a 11. exon kivágásával jön létre, míg az INSRB izoform az összes exont magában foglalja. A két izoformának különböző jelátviteli jellemzői vannak, és úgy gondolják, hogy az INSRB fontosabb az inzulin által közvetített metabolikus jelátvitelben. Következésképpen az INSRB túlsúlyban van a metabolikusan aktív szövetekben, például a májban. Az alternatív splicing változásai megváltoztatják az INSRB: arányt anélkül, hogy szükségszerűen befolyásolnák a globális receptor transzkripciót. Megállapítottuk, hogy a máj INSRB: A T2DM-ben szenvedő elhízott egyének aránya alacsonyabb volt, és 5,4-ről 8,6-ra emelkedett azoknál a betegeknél, akiknél a cukorbetegség remissziója volt.

Bár in vitro eredményeink rávilágítanak az INSRB: Az inzulinrezisztencia arányának fontosságára, a klinikai jelentőség és az, hogy a törölt INSRB: A arány hozzájárul-e az inzulinrezisztenciához, vagy ennek eredménye nem ismeretes. Továbbá, bár az elhízás és a cukorbetegség hatással van az INSRB: arányra, az INSR alternatív splicingjét szabályozó pontos ingerek még mindig nem ismertek. Bár kívánatos lett volna adatok bemutatása az izoform fehérje szintjének relatív bőségéről, az INSRB 11. exonjának megfelelő peptid ellen termelt nyúl poliklonális antitest nem volt specifikus, valószínűleg a 11. exon viszonylag kis mérete miatt. (12 aminosav). Mindazonáltal az INSR izoform mRNS szintjeiről korábban kimutatták, hogy tükrözik a két fehérje relatív szintjét az izomszövet sejtfelületén [54].

segítő információ

S1. Ábra Az AKT foszforiláció mennyiségi meghatározásához használt összes blot az INSR A vagy B izoformát túlzott mértékben expresszáló sejtekben.

Három különböző kísérletet hajtottunk végre biológiai triplikátumban, összesen 9 ismétlést kísérleti körülmények között. A HepG2 sejteket üres vektorral (kontroll), INSRA vagy INSRB vektorral transzfektáltuk, és inzulinnal kezeltük. Az inzulinnal kezelt sejtek mellett nem inzulin kontrollokat töltöttünk be. A számozás külön napokon végzett kísérleteket és biológiai ismétléseket jelöl. Például a HepG2 INSRA 1.1 az 1. kísérlet és az 1. biológiai ismétlés. A függőleges vonalak külön blotokat jelölnek. A megfelelő levágatlan western blotokat lásd az S2 – S4 ábrán.

S2. Ábra Vágatlan Western blotok, amelyeket az AKT foszforilációjának kvantifikálására használtunk az 1. kísérletből.

Az átadás után a membránt molekulatömeg szerint vágtuk, hogy lehetővé váljon az inzulin receptor β-alegység, az aktin és a foszforilezett AKT egyidejű vizsgálata. A membrán p-AKT-re vizsgált részét lecsupaszítottuk, és a következő napon újra szondáztuk a teljes AKT-re. Különböző expozíciókat alkalmaztunk különböző antitestekhez a jelerősség miatt.

S3. Ábra Vágatlan Western blotok, amelyeket az AKT foszforilációjának kvantifikálására használtunk a 2. és 3. kísérletből.

Az átadás után a membránt molekulatömeg szerint vágtuk, hogy lehetővé váljon az inzulin receptor β-alegység, az aktin és a foszforilezett AKT egyidejű vizsgálata. A membrán p-AKT-re vizsgált részét lecsupaszítottuk, és a következő napon újra szondáztuk a teljes AKT-re. Különböző expozíciókat alkalmaztunk különböző antitestekhez a jelerősség miatt.

S4. Ábra Vágatlan Western blotok, amelyeket az AKT foszforilációjának kvantifikálására használunk a 3. kísérletből.

Az átadás után a membránt molekulatömeg szerint vágtuk, hogy lehetővé váljon az inzulin receptor β-alegység, az aktin és a foszforilezett AKT egyidejű vizsgálata. A membrán p-AKT-re vizsgált részét lecsupaszítottuk, és a következő napon újra szondáztuk a teljes AKT-re. Különböző expozíciókat alkalmaztunk különböző antitestekhez a jelerősség miatt.

S5. Ábra: A MagicMark XP Western Protein Standard mellett felhasznált antitestek blotja.

A foszforilezett AKT blotja (molekulatömeg: 62 kda) nem mutat látható sávot inzulinkezelés nélkül és látható sávot inzulinkezeléssel 5 és 10 perc múlva. (B). A teljes AKT blotja (molekulatömeg: 62 kda). (C) Az inzulin receptor β-alegység (molekulatömeg: 95 kda) és az aktin (molekulatömeg: 42 kda) blotjai a HepG2 sejtlizátumból.

Szerző közreműködései

A kísérletek megtervezése és megtervezése: VB HS MH. Végezte a kísérleteket: VB. Elemezte az adatokat: VB MH. Hozzájáruló reagensek/anyagok/elemző eszközök: VB MH RS. Írta a dolgozatot: VB MH. Klónozással segített: HS.