Az akarbóz csökkenti a vércukorszintet azáltal, hogy aktiválja a miR-10a-5p és miR-664 diabéteszes patkányokban

Hatósági endokrinológiai laboratórium, Egészségügyi Minisztérium, Endokrinológiai Osztály, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Kínai Orvostudományi Akadémia, Peking, Kína

Qian Zhang,
Xinhua Xiao,
Ming Li,
Wenhui Li,
Miao Yu,
Huabing Zhang,
Zhixin Wang,
Hongding Xiang

Javítás

2014. január 21 .: Zhang Q, Xiao X, Li M, Li W, Yu M és mtsai. (2014) Korrekció: Az akarbóz csökkenti a vércukorszintet azáltal, hogy aktiválja a miR-10a-5p és miR-664 diabéteszes patkányokban. PLOS ONE 9 (1): 10.1371/annotation/330eea00-9c09-4982-a458-3add994bab9d. https://doi.org/10.1371/annotation/330eea00-9c09-4982-a458-3add994bab9d Javítás megtekintése

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Zhang Q, Xiao X, Li M, Li W, Yu M, Zhang H és mtsai. (2013) Az akarbóz csökkenti a vércukorszintet azáltal, hogy aktiválja a miR-10a-5p és miR-664 diabéteszes patkányokban. PLoS ONE 8 (11): e79697. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0079697

Szerkesztő: Rasheed Ahmad, Dasman Diabetes Intézet, Kuvait

Fogadott: 2013. július 2 .; Elfogadott: 2013. október 4 .; Közzétett: 2013. november 18

Finanszírozás: Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (No. 81170736), a Kínai Fiatal Tudósok Nemzeti Természettudományi Alapítványa (No. 81300649), valamint a Klinikai Tudomány Nemzeti Kulcsprogramja és a Pekingi Unió Egészségügyi Főiskolai Kórháza finanszírozta. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A cukorbetegség az egyik leggyakoribb krónikus betegség világszerte, és továbbra is növekszik az előfordulása és jelentősége, mivel az életmód megváltoztatása csökkent fizikai aktivitáshoz és fokozott elhízáshoz vezet. A 2-es típusú cukorbetegség világszerte kialakulóban lévő egészségi probléma, és az előrejelzések szerint a 2-es típusú cukorbetegség globális eseteinek száma 2030-ra megduplázódik, 350 millióra [1]. A cukorbetegség a szív- és érrendszeri betegségek független kockázati tényezője [2], [3], és ez a legfőbb oka a morbiditásnak és a halálozásnak a fejlett világban [4] - [6].

Az akarbóz egy α-glükozidáz inhibitor, amely késlelteti a komplex szénhidrátok és diszacharidok emésztését felszívódó monoszacharidokká azáltal, hogy reverzibilisen gátolja az α-glükozidázokat a bél kefe határán, ezáltal enyhítve az étkezés utáni vércukorszint-csúcsokat [7]. Klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy az akarbóz általában javítja a glikémiás kontrollt a diabetes mellitusban szenvedő betegeknél, amelyet egyedül diétával vagy más antidiabetikus terápiákkal kombinálva lehet kezelni, amit az étkezés utáni plazma glükóz és glikozilezett hemoglobin csökkenése bizonyít. Úgy tűnik, hogy nem változtatja meg közvetlenül az inzulinrezisztenciát, de csökkentheti az étkezés utáni plazma inzulinszintet. Az akarbóz biohasznosulása azonban alacsony [8], ami annak gyenge vizes oldhatóságának tudható be.

A mikroRNS-ek (miRNS-ek) rövid (21–23 nukleotid), endogén, nem kódoló RNS-molekulák. A miRNS-ek úgy szabályozzák a génexpressziót, hogy a tökéletlen bázis párosul az mRNS-ek 3'-nem transzlált régióival, ami mRNS-bomlást vagy transzlációs repressziót eredményez [9]. A miRNS-eknek különálló térbeli és időbeli expressziós mintázata van a sejtekben és szövetekben, és számos folyamatot szabályoznak, beleértve a vérképzést, a fejlődést, a sejtek differenciálódását, a proliferációt és az apoptózist [10], [11]. Számos betegségben érintettek, beleértve a cukorbetegséget is.

Ezért feltételeztük, hogy az akarbóz közvetlenül megváltoztatja a miRNS-ek bél expresszióját a glükóz metabolizmusának szabályozása érdekében. Ahhoz, hogy molekuláris bizonyítékot szolgáltassunk erre a mechanizmusra, 2-es típusú cukorbetegség patkánymodelljét alkalmaztuk a miRNS differenciál expressziójának vizsgálatára patkány belekben akarbózzal végzett kezelés után.

Anyagok és metódusok

1. Állatmodellek, csoportosítás és kezelés

2. A testtömeg és az éhomi vércukorszint mérése

A testtömeget kéthetente mértük. A 6 órás éhomi vércukorszintet (FBG) kéthetente mértük egy Contour TS glükométerrel (Bayer) farokvérzésből származó vérrel.

3. Orális glükóz tolerancia teszt (OGTT)

Miután a patkányok 6 órán át éheztek, orálisan 2,2 g/kg glükózt adtak be. Ezután vérmintákat gyűjtöttünk a farokvénákból 0-nál (a glükózterhelés előtt), 30, 60 és 120 perccel (a glükózterhelés után) egy glükózvizsgálathoz. A görbe alatti területet (AUC) kiszámítottuk a vércukorszintre (BG) az OGTT során: AUC = 0,5 × (BG0 + BG30)/2 + (BG30 + BG60)/2 + 1 × (BG60 + BG120)/2.

4. Szérum IL6 és TNF-α szintelemzés

A 8. héten eutanázia után vérmintákat vettünk, és 1000 g-vel 10 percig centrifugáltuk. A szérumot aliquotokban tároltuk -80 ° C-on, hogy meghatározzuk a szérum interleukin 6 (IL6) és a tumor nekrózis faktor α (TNF-α) értékét. A szérum IL6 és TNF-α szinteket enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA, Abcam, UK) mértük.

5. miRCURY LNA ™ mikroRNS tömb kísérlet

A miRCURY LNA ™ miRNS tömb rendszer 3100 befogó szondát tartalmaz, amely lefedi az összes patkány mikroRNS-t (388 miRNS), amelyet a miRBase 18.0-ban feljegyeztünk, valamint a patkányokkal társított összes vírusos mikroRNS-t. Az AcarH csoport és a DM csoport ilieméből származó teljes RNS-t TRIzol (Invitrogen) és miRNeasy Mini Kit (QIAGEN) segítségével gyűjtöttük be a gyártók utasításainak megfelelően. Miután az RNS-t NanoDrop 1000 alkalmazásával számszerűsítettük, a mintákat miRCURY ™ Hy3 ™/Hy5 ™ Power jelölő készlet segítségével jelöltük és miRCURY ™ LNA Array v.18.0 (Exiqon) hibridizáltuk. Mosás után a tárgylemezeket Axon GenePix 4000B microarray szkennerrel szkenneltük.

6. Géntömb-adatok elemzése

A normalizálást chipenkénti 50. percentilis módszerrel hajtottuk végre, amely normalizálja az egyes chipeket a mediánjában, lehetővé téve az összehasonlítást a chipek között.

7. miRNS célgén előrejelzés

A miRNS célgéneket a miRWalk online adatbázis (http://www.umm.umi-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/) segítségével azonosítottuk. A miRWalk a kiotói gének és genomok enciklopédiájából (KEGG, http://www.genome.jp/kegg/) közzétett útvonal-célokról nyújt információt. A génfunkciókat az NCBI-Gene-től szereztük be (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

8. miRNS mennyiségi valós idejű PCR (qRT-PCR)

A teljes RNS-t (5 ng) reverz átírással írtuk át Taqman ™ MicroRNS reverz transzkripciós készlet (Applied Biosystems) és a TaqMan ™ MicroRNA Assay-kkal (Applied Biosystems) ellátott miRNS-specifikus reverz transzkripciós primerek segítségével. A reverz transzkripcióhoz PTC-225 Peltier Thermal Cyclert (MJ Research Inc., Waltham, Massachusetts) használtunk. A reakció körülményei 30 percig 16 ° C, 30 perc 42 ° C és 5 perc 85 ° C. A keletkezett miRNS-specifikus cDNS-t egy TaqMan ™ Universal PCR master mix II (Applied Biosystems) és a TaqMan ™ Small RNS Assays (Applied Biosystems) által biztosított specifikus próba segítségével amplifikáltuk. A PCR-t CFX-96TOUCH (Bio-Rad) detektáló rendszerrel végeztük. Az amplifikációt 95 ° C-on 10 percig végeztük, majd 40 ciklusban 95 ° C-on 15 másodpercig és 60 ° C-on 60 másodpercig. U6 kis mag RNS-t használtunk endogén kontrollként. A miRNS-szint szeres változását az alábbi egyenlettel számoltuk: szeres változás = 2 - △△ Ct, ahol △ Ct = CtmiRNS-CtU6 és △△ Ct = △ Ctacarbose kezelt minták - △ Ctunt-kezelt diabéteszes minták [14].

9. A célgén validálása qRT-PCR segítségével

A miRNS célgének validálásához az RNS-ek qRT-PCR elemzését SYBR Green alkalmazásával végeztük. Minden qRT-PCR vizsgálatot három biológiai replikátum felhasználásával megismételtünk, és mindegyik elemzés három technikai ismétlésből állt. A PCR-elemzés előtt az összes RNS minden mintáját RNáz-mentes DNázzal kezeltük (Qiagen, Valencia, Kalifornia, USA). Az RNS-t reverz átírással a Superscript II (Invitrogen, CA, USA) írta le. Az alapozókat az Applied Biosystems (Foster City, Kalifornia, USA) Primer Express ™ tervező szoftver segítségével tervezték. A primereket az Applied Biosystems-től vásároltuk (1. táblázat). Az ABI Prism 7700 szekvencia detektáló rendszer alkalmazásával a következő reakciókörülményeket alkalmaztuk: egy kezdeti denaturálást 48 ° C-on 30 percig, majd 95 ° C-on 15 percig, majd 40 ciklust 95 ° C-on 15 másodpercig, majd 55 ° C-on 1 percig, és véglegesen korlátlanul 4 ° C-on tartjuk. A láncindítók szekvenciáit az 1. táblázat tartalmazza. A normalizáláshoz a háztartási gén Gapdh (glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz) szignálját használtuk. Az mRNS relatív mennyiségi meghatározását az akarbózzal kezelt csoportok és a DM patkányok között összehasonlító Ct módszerrel számoltuk.

10. Immunhisztokémiai festés

Az adatok az átlag ± SD értéket képviselik (n = 10 csoportonként). ** P # P 2. ábra: Az akarbóz hatása az orális glükóz tolerancia tesztre a vércukor (A) és AUC (B) patkányokban.

Az adatok az átlag ± SD értéket képviselik (n = 10 csoportonként). ** P # P 3. ábra: Az akarbóz hatása az IL6 (A) és a TNF-α (B) szérumra patkányokban (n = 10 csoportonként).

Az adatok az átlag ± SD értéket képviselik (n = 10). ** P ## P 2, P 2, P 4. ábra. A miRNS tömb vulkán-diagram diagramja.

Ez a grafikon azt mutatja, hogy az egyes miRNS-ek expressziójának az AcarH-csoport és a DM-csoport közötti változásának log 2-je a t-teszttől kapott P-érték log-10-jéhez viszonyítva. A függőleges zöld vonal azt jelzi, hogy a miRNS expressziós küszöbértékének változása 2. A vízszintes zöld vonal azt jelzi, hogy a t-teszt küszöbértékének P értéke 0,05. 8 miRNS volt, amelyek szignifikánsan eltérő expressziót mutattak az AcarH csoport és a DM csoport között.

7. A differenciálisan expresszált miRNS-ek célgénjeinek azonosítása bioinformatikai elemzés segítségével

Ezután bioinformatikai elemzést végeztünk a differenciálisan expresszált miRNS-ek célgénjeinek azonosítására. A nyolc miRNS-nek együttesen 189 validált célgénje volt a miRWalk adatbázisban (3. táblázat). A miRWalk és a KEGG adatbázisok felhasználásával ezeket a 189 validált gént bevonták a TGF-β jelátviteli útba, a MAPK jelátviteli útvonalba, a Wnt jelátviteli útba és részt vettek a citokin-citokin receptor kölcsönhatásban (4. táblázat).

8. mRNS qRT-PCR

Annak meghatározására, hogy az ileumban a gyulladásos markerek lokális génexpressziója megváltozott-e az akarbóz kezeléssel, az IL6, Mapk1 és TNF mRNS expresszióját qRT-PCR-rel határoztuk meg. Az Il6, Mapk1 és Tnf expressziója szignifikánsan csökkent az AcarH csoportban (P 5. táblázat. Az AcarH és a DM változása a génexpresszióban Q-RT-PCR-rel mérve.

9. Immunhisztokémiai festés

Annak megerősítésére, hogy a gyulladásos markerek fehérje-expressziója megváltozott az akarbózzal kezelt DM-patkányok ileumában, a TNF-α, IL6 és MAPK1 immunhisztokémiai elemzését végeztük ileum szöveteken. Az AcarH csoportban statisztikailag szignifikáns csökkenés volt tapasztalható a TNF-α, IL-6 és MAPK1 immunreaktivitásában (6. ábra).