Az andrographolid hatása a monocita kemoattraktáns protein-1 expressziójára a kezdeti szakaszban

Az andrographolid hatása a monocita kemoattraktáns protein-1 expressziójára az ateroszklerózis kezdeti szakaszában az aterogén táplálékkal táplált patkányokban

Muhammad Yulis Hamidy 1,2 *, Fadil Oenzil 3, Yanwirasti 4 és Yufri Aldi 5

1 Orvosbiológiai program, Orvostudományi Kar, Andalas Egyetem, Padang, Indonézia.

2 Farmakológiai Tanszék, Orvostudományi Kar, Universitas Riau, Pekanbaru, Indonézia.

3 Biokémiai Tanszék, Orvostudományi Kar, Andalas Egyetem, Padang, Indonézia.

4 Anatómiai Tanszék, Orvostudományi Kar, Andalas Egyetem, Padang, Indonézia.

5 Farmakológiai és Klinikai Gyógyszerészeti Tanszék, Gyógyszerésztudományi Kar, Andalasi Egyetem, Padang, Indonézia.

Absztrakt

Az andrographolid hatásának értékelése a monocita kemoattraktáns protein-1 (MCP-1) expressziójára atherosclerosis kezdeti szakaszában patkányokban, amelyeket atherogén étrend indukál. A kutatást 27 patkányon végezték 3 csoportra osztva (n = 9). Az 1. csoport szokásos étrendet kapott. A 2. csoport az első napon 700 000 NE/kg D3-vitamin atherogén étrendet kapott, amelyet 5% kecskezsír, 2% koleszterin, 0,2% kololsav és standard diéta követett 100% -ig 2 napig az ateroszklerózis kezdeti szakaszának kiváltására. A 3. csoport atherogén étrendet kapott, és 40 mg/kg andrographoliddal kezelték. Immunhisztokémiai vizsgálatot végeztek az MCP-1 expressziójának meghatározására. Adatok elemzése egyirányú Anova alkalmazásával, majd post hoc teszt alkalmazásával. Az eredmények azt mutatták, hogy az MCP-1 expressziója az 1. csoportban 6,61 volt + 1,90, a 2. csoportban 32,99 volt + 3,74 és a 3. csoportban 9,61 volt + 2.47. Jelentős különbség volt a 40 mg/kg andrographoliddal kezelt 3. csoport és a 2. csoport között (p 0,05). Összegzésképpen elmondhatjuk, hogy az andrographolid gátolhatja az MCP-1 expressziót az ateroszklerózis kezdeti szakaszában az andrographoliddal kezelt patkányokban. Így az andrographolid potenciális antiateroszklerózis elleni gyógyszer lehet.

Kulcsszavak

Andrographolid; Érelmeszesedés; MCP-1; Atherosclerosis

Hamidy M. Y, Oenzil F, Yanwirasti Y, Aldi Y. Andrographolid hatása monocita kemoattraktáns protein-1 expresszióra az ateroszklerózis kezdeti szakaszában az aterogén táplálékkal táplált patkányokban. Biomed Pharmacol J 2019; 12 (3).

Bevezetés

Az ateroszklerózis krónikus gyulladásos betegség, amely az erek falában fordul elő. Az ateroszklerózis patogenezisében különféle folyamatok vesznek részt, beleértve a gyulladásos sejtek beszivárgását, a simaizomsejtek szaporodását, az extracelluláris mátrix növekedését és az 1-es trombus képződését. A gyulladásnak fontos szerepe van, és ez az ateroszklerózis 2 patogenezisének fő mechanizmusa. Ez a gyulladás monociták és az artériák falában található sejtek, például az endothel sejtek és a vaszkuláris simaizom sejtek közötti kölcsönhatás révén következik be 3 .

A monociták alapvető szerepet játszanak az érelmeszesedés iniciációs szakaszában 4. A korai érelmeszesedéses elváltozásoknál a monociták/makrofágok felhalmozódása megtalálható az erek intimájában. A makrofágok felhalmozzák a koleszteril-észtereket, ami habsejtképződést eredményez 1. Különböző meglévő vizsgálatok mutatják be a monocita kemoattraktáns protein-1 (MCP-1) fontos szerepét a monociták/makrofágok toborzásának folyamatában 5. A monocita kemoattraktáns fehérje-1, egy C-C kemokin családtag, erős kemoattraktáns aktivitással rendelkezik a monociták/makrofágok ellen6. Ez a kemokin nagyon expresszálódik az érelmeszesedéses elváltozások makrofágokban gazdag területén humán, valamint kísérleti állatmodellekben 5. Ezek a megállapítások arra utalnak, hogy a monocita kemoattraktáns protein-1 fontos szerepet játszik az érelmeszesedés iniciációs szakaszában.

Az érelmeszesedés elleni gyógyszerek kifejlesztését olyan gyulladáscsökkentő gyógyszerek tanulmányozásával lehet elvégezni, amelyek konkrétabban az érelmeszesedés patogenezisének befolyásolásával hatnak. Az egyik olyan összetevő, amely gyulladáscsökkentő hatással bír, és valószínűleg atherosclerosisként is kezelhető, az andrographolide, az Andrographis paniculata fő hatóanyaga. Az elvégzett vizsgálatok igazolják, hogy az andrographolid 7, 8, 9 gyulladáscsökkentő hatással bír, és potenciálisan kifejleszthető ateroszklerózisként 10 .

Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy értékelje az andrographolid hatását az MCP-1 expresszióra az atherosclerosis kezdetén/korai stádiumában atherogén étrend által kiváltott patkányokban.

Anyagok és metódusok

Kísérleti állatok

Huszonhét 10 hetes Wistar patkányt (150-200 g) nyertünk a Riau Egyetem Gyógyszerészeti Iskolájából. A patkányokat jól szellőző helyiségekben ketrecekben helyezték el, és ad libitum engedték nekik az élelmet és a vizet. A helyiség hőmérséklete 20–26 ̊C volt, a helyiség megvilágítását váltakozva 12 órán át világos és sötét színben szabályozták. A patkányok egészségét jól ellenőrizték, és a patkányketreceket minden nap tisztították. A patkányok akklimatizálását egy hétig végeztük, mielőtt felhasználnánk ebben a vizsgálatban. Az állatok kezelését Helsinki nyilatkozatának tették ki. Az etikai jóváhagyást a Riau-i Egyetem Orvostudományi Karának Orvostudományi és Egészségügyi Kutatási Etikai Felülvizsgálati Testülete kapta (No: 457/UN.19.5.1.1.8/UEPKK/2017).

Kísérleti terv

A patkányokat véletlenszerűen 3 csoportra osztották (n = 9), az 1. csoportba (normál kontroll) standard étrendet adtak. A 2. csoport (atherogén kontroll) az első napon 700 000 NE/kg D3-vitamin (kolekalciferol) atherogén étrendet kapott (Sigma, St. Louis, MO, USA), majd 5% kecskezsír, 2% koleszterin, 0,2% koli sav (Sigma, St. Louis, MO, USA) és 92,8% -os standard étrend 2 napig az ateroszklerózis kezdeti szakaszának kiváltására 11,12. A 3. csoport (kezelt csoport) aterogén étrendet kapott, és 40 mg/kg andrographoliddal kezelték (Andalas Sitawa Fitolab, Padang, Indonézia). Az andrographolidot orálisan adták naponta egyszer, gyomorcső segítségével.

Az érelmeszesedés kezdeti szakaszának értékelése

Az érelmeszesedés kezdeti szakaszát a habsejtek képződése alapján értékeltük. A kezelés befejezése után éteres érzéstelenítést alkalmaztunk a patkányok feláldozására. A hasi aorta szöveteket gyorsan kivágtuk és 10% semlegesített formaldehidben rögzítettük 0,1 M foszfátpufferben. Az aorta mintát paraffinba ágyazottuk. Hematoxilin és eozin (H&E) festést végeztünk a patkány hasi aortában található habsejtek számának mérésére. A habsejteket × 400 nagyítással számítottuk 9 látómezőben. A képeket fényképezőgéppel felszerelt fénymikroszkóppal (Leica, Wetzlar, Németország) és számítógép-monitorhoz csatlakoztatva kaptuk.

Immunhisztokémiai festés

Patkány hasi aortában az MCP-1-et MCP-1 poliklonális antitest (Bioss Antibodies Inc., Massachusetts, USA) alkalmazásával azonosítottuk. Paraffinba ágyazott egér vesét pozitív IHC-vel MCP-1-re használtunk pozitív kontrollként. A tárgylemezeket fénymikroszkóppal figyeltük meg 400-szoros nagyítással. A képeket mikroszkóp kamerával (Leica, Wetzlar, Németország) készítettük, és minden egyes dián 10 kép készült. A hasi aorta MCP-1 expresszióját Photoshop képelemző szoftverrel értékelték a 12. terület százalékos arányának kiszámításához. Az MCP-1-et tartalmazó összehasonlító terület százalékos aránya az aorta teljes keresztmetszetével, amely feltételezhetően az expresszió szélessége. Két független patológust hívtak meg a tárgylemezek vizsgálatára.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. Az eredmények elemzéséhez egyirányú varianciaanalízist (ANOVA), majd Bonferroni post hoc tesztjét alkalmaztunk. P a), b)

1. csoport: normál kontrollcsoport; 2. csoport: atherogén kontrollcsoport; 3. csoport: kezelt csoport.

Az adatok statisztikai elemzését egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) és Bonferroni post hoc tesztjével végeztük el az SPSS 17.0 átlagos összehasonlításához.

Az értékek átlagként vannak feltüntetve + SEM (N = 9).

1. csoport: normál kontrollcsoport; 2. csoport: atherogén kontrollcsoport; 3. csoport: kezelt csoport.

Az adatok statisztikai elemzését egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) és Bonferroni post hoc tesztjével végeztük el az SPSS 17.0 átlagos összehasonlításához.

Az értékek átlagként vannak feltüntetve + SEM (N = 9).

a) P b) P 13,14. Kimutatták, hogy az andrographolid gyulladáscsökkentő hatásokat alkalmaz a légúti gyulladásos betegségek kísérleti modelljeiben, beleértve az asztmát 15, az akut tüdőkárosodást (ALI) 16 és az idiopátiás tüdőfibrózist (IPF) 17. Kimutatták, hogy az andrographolid a NADPH oxidáz 2 (NOX2) és az indukálható nitrogén-oxid szintáz (iNOS) termelésének gátlásával védi a stroke-ot az NF-kB 18 gátlásán keresztül. .

Az andrographolid hatékony gyulladáscsökkentő gyógyszerként való kifejlesztése érdekében különféle klinikai vizsgálatokat végeztek, többek között az arcüreggyulladás kezelésére, ahol a jelentések szerint a gyógyszer hatékonyan enyhíti a gyulladásos tüneteket, és a betegek jól tolerálják 19. Az A. paniculata jótékony hatásait kimutatták a reumás ízületi gyulladás 2. fázisú vizsgálatában 20, és jelentősen csökkentették a fáradtságot sclerosis multiplexben szenvedő betegeknél 21 .

Toxikológiai vizsgálatokat végeztek andrographolidon mind preklinikai, mind klinikai vizsgálatokban. Egy akut toxicitási vizsgálat során azt találták, hogy patkányokon legfeljebb napi 5 g/kg-os andrographolid szájon át legfeljebb 14 napig nem észlelhető káros hatást. Ugyanezeket az eredményeket találták egy szubakut toxicitási vizsgálatban is, amely azt mutatta, hogy az andrographolide 500 mg/kg-os orális adagjának napi adagolása legfeljebb 21 napig patkányokban nem volt megfigyelhető káros hatással 22. Egy klinikai vizsgálat során 170 mg A. paniculata tisztított kivonat (kb. 85 mg andrographolid) 12 óránként 12 havonta orálisan adott beadása kiderült, hogy jól tolerálható a relapszáló-remitáló sclerosis multiplexben szenvedő betegeknél. Csak egy beteg kapott enyhe bőrkiütést mutató A. paniculata-t, amelyet anti-hisztamin kezeléssel csillapítottak 21 .

Az ateroszklerózis iniciációs stádiumát atherogén étrend indukálta patkányokon hajtották végre. Ebben a vizsgálatban patkányokat használtunk kísérleti állatként, mivel ezeknek az állatoknak számos előnye van, többek között praktikusak, könnyen beszerezhetők és mindenevő táplálkozási állatok, jobban hasonlítanak az emberekhez. Az ateroszklerózis patkányokban D3-vitamin (kolekalciferol) hozzáadásával a magas koleszterinszintű étrendbe 23 indukálható. Az ateroszklerózis patkánymodellje, amelyet a D3-vitamin hoz létre, és atherogén étrenddel táplálkozik, hasonló az emberhez. Az aterogén étrend ebben a vizsgálatban megadott összetétele 5% kecskezsírból, 2% koleszterinszintből, 0,2% kólsavból és 100% -ig terjedő szokásos étrendből állt 12. Aterogén étrendet adtak hiperkoleszterinémia előállítására kísérleti állatokban. A hiperkoleszterinémia miatt az LDL behatol az artériákba, különösen a hemodinamikai zavarok helyén. Az oxidatív és enzimatikus módosítások átalakítják az LDL-t oxLDL 24-vé. Az oxLDL endothel diszfunkciót okoz, így monociták toborzását idézi elő az artériás falba 25 .

Az artéria falába történő monocita infiltráció fontos szerepet játszik az ateroszklerotikus elváltozás kezdeti szakaszában és kialakulásában. Az egyik tényező, amely fontos szerepet játszik a monociták toborzásában, az MCP-1 26. Az erek falain megjelenő különféle sejtek szintetizálják és kiválasztják az MCP-1-t. Ennek a kemokinnek erős kemotaktikus hatása van a monocitákra/makrofágokra 27. Az MCP-1 kemotaktikus hatását a keringő vér monocitáira egy specifikus, nagy affinitású CCR2 4,5,26 receptor közvetíti. Aiello és mtsai bebizonyították, hogy az MCP-1 képes aposzteroprotein-E hiányú egerekben ateroszklerózist indítani 28. Eközben az egereken végzett vizsgálatok, az MCP-1 vagy a CCR2 deléciójával, a monocita felhalmozódás csökkenését mutatták ki az artériás falban, és megakadályozták az ateroszklerotikus elváltozások kialakulását 29,30 .

Ezek a bizonyítékok azt bizonyítják, hogy az MCP-1 fontos szerepet játszik az érelmeszesedés kezdeti szakaszában, és potenciális célpontja lehet az érelmeszesedéses terápiának.

Az érelmeszesedés iniciációs stádiumát a habsejtek 31 képződése jellemzi. A korai ateroszklerotikus elváltozásnál talált habsejtek a keringésben lévő monocitákból származnak 32. A vaszkuláris endoteliális sejtekhez tapadt monociták az MCP-1 által közvetített artériás intima rétegbe vándorolnak. Ezek a monociták a makrofág-kolónia stimuláló faktorra (M-CSF) és más ingerekre válaszul makrofágokká differenciálódnak. A makrofágok expresszálják a CD36, SR-A és lektinszerű oxLDL-1 (LOX-1) receptorokból álló scavenger receptort (SR), amelyek megkönnyítik az oxLDL részecskék makrofágok általi felvételét, ami lipiddel terhelt habsejteket eredményez 34 .

Javasoljuk, hogy az MCP-1 andrographolid általi gátlásának mechanizmusa az NF-kB aktiváció gátlásán keresztül valósuljon meg. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az andrographolidnak gyulladáscsökkentő hatása van az NF-κB 13 inaktiválásán keresztül. Az NF-kB egy transzkripciós faktor, amelynek fontos szerepe van a gyulladásos folyamatban részt vevő különböző citokinek és kemokinek génjeinek szabályozásában 35. Az NF-kB a következőkből áll: p105/p50 (NF-kB1), p100/p52 (NF-kB2), p65 (RelA), RelB dan c-Rel. Az NF-kB útvonalat az IKK (IkB kináz) komplex aktiválja, amely a szabályozó alegységből áll, az IKKg-ból, amely NF-kB esszenciális módosító (NEMO) néven is ismert, valamint a katalitikus alegységből, az IKKα-ból és az IKKb-ből. Mivel a downstream szubsztrátum Ikbα. Normál körülmények között az NF-kB p50/NF-kB p65 dimer kötődik az Ikbα-hoz. Az ingerekre reagálva az IKKα és az IKKb foszforilálódik, és Ikbα foszforilációt okoz. A foszforilezett Ikbα az ubiquitin proteaszóma útvonalon keresztül lebomlik. Az Ikbα-degradáció hatására az NF-kB p50/NF-kB p65 foszforileződik és transzlokálódik, ami végül géntranszkripciót eredményez 36 .

Az NF-kB aktivitás gátlása andrographoliddal a p65 defoszforilezésén keresztül megy végbe a PP2A 9,37 aktiválásával. A p65 androgroliddal történő defoszforilezése az NF-kB csökkent transzlokációját eredményezi a sejtmagba, és csökkenti az NF-kB DNS 37-hez való kötődését. Ezen mechanizmus révén az andrographolid gátolja az MCP-1 expressziót, így gátolja a monociták toborzását az artéria falába.

Következtetés

A jelen tanulmány eredményei arra utalnak, hogy az andrographolidnak ateroprotektív hatása van az MCP-1 expresszió gátlásával és végül a makrofág habsejtek képződésének elnyomásával. Klinikailag az itt bemutatott eredmények betekintést nyújtanak az andrographolid anti-ateroszklerotikus gyógyszerként történő lehetséges alkalmazásába.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők hálásan tudomásul veszik, hogy a jelen kutatást az Indonéz Kutatási és Technológiai Minisztérium és a Felsőoktatási Köztársaság támogatja.

Összeférhetetlenség

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségek.

Finanszírozási forrás

A jelen kutatást az Indonéz Köztársaság Kutatási és Technológiai Minisztériuma és Felsőoktatási Minisztériuma finanszírozza (277. sz. Támogatás/UN.19.5.1.3/PP/2018).