Az anti-CD3 antitest csökkenti a gyulladást és javítja az eredményt a Pneumocystis Pneumonia egérmodelljében

Absztrakt

A Pneumocystis carinii tüdőgyulladás (PcP) továbbra is életveszélyes betegségfolyamat, amely elterjedt az immunszuppresszált populációk körében. A kritikus betegek kezelésében való képességünk számos javulása ellenére a PcP-nek tulajdonítható halálozás alig változott és továbbra is elfogadhatatlanul magas (1). Ezért új kezelési módokra van szükség, amelyek kifejezetten a PcP patofiziológiájával foglalkoznak. Különösen magas a halálozás, akár 80–90% azok között a betegeknél, akiknek intenzív osztályra kell kerülniük. Az AIDS-ben és a PcP-ben szenvedő betegek két nagy csoportjának legújabb elemzése kimutatta, hogy az intenzív ellátás vagy a mortalitás szükségessége a belépéskor vagy azt követően felismerhető (2, 3). Ezért van egy azonosítható PcP-s betegek csoportja, akik számára előnyös lenne a PcP javított kezelési rendje,.

Ma már egyre inkább felismerik, hogy a mikroorganizmus által kiváltott gazda gyulladásos válasz szövetkárosodást is okozhat. Saját és mások által az elmúlt években publikált tanulmányok bebizonyították, hogy ez a PcP kiemelkedő jellemzője (4–10). Az embereken végzett klinikai megfigyelések szintén alátámasztják a gyulladás és a rossz eredmény kimenetelét a PcP-ben szenvedő betegeknél (11, 12), és feltételezték, hogy a kiegészítő kortikoszteroid terápia előnyei gyulladáscsökkentő hatásokkal függenek össze (12, 13).

Noha az emberekben alkalmazható anti-CD8 és anti-CD4 Abs nem állnak rendelkezésre, az AB OKT3 pan-T-sejt (muromonab-CD3; Muromomab; Ortho Biotech, Bridgewater, NJ) jelenleg engedélyezett a betegek számára. Fontos, hogy az OKT3 hatásait a CD4 + és a CD8 + T sejtekre egyaránt gyakorolja. Mivel egyes PcP-betegeknél maradék CD4 + T-sejtek működése lehet, az OKT3-szerű Ab beadásának együttes előnye, hogy mind a CD8 +, mind a CD4 + T sejtek működését zavarja, amelyek hozzájárulhatnak a patológiás gyulladásos válaszhoz. Ez az eredmény különösen alkalmassá tenné egy ilyen megközelítést a PcP kezelésére az IRIS hátterében, amelyben a CD4 + T sejtekről ismert, hogy szerepet játszanak az immunopatogenezisben. Az OKT3 vagy OKT3-szerű Ab alkalmazásának végső előnye, hogy széleskörű klinikai tapasztalat áll rendelkezésre ezeknek a molekuláknak az alkalmazásában, amely megkönnyítené a PcP kiegészítő terápiaként történő alkalmazását, ha egy ilyen megközelítést érvényesítenének. Ezért egy sor kísérletet végeztünk, hogy kísérleti állatokat szolgáltassunk az anti-CD3 Ab hatásáról a PcP kimenetelére. Immunrekonstitúciós modellt használtunk, amely utánozza a PcP által kiváltott IRIS-t. Eredményeink azt sugallják, hogy ez a megközelítés klinikailag alkalmazható a mérsékelt vagy súlyos PcP kezelésében.

Anyagok és metódusok

F (ab ') 2 fragmensek előállítása

A hörcsög anti-egér CD3 Ab-t termelő 145 2C11 hibridóma sejtvonalat az American Type Culture Collection-ből kaptuk (18). Az Ab-t telített ammónium-szulfát-kicsapással és A-fehérje A-ascites folyadék tisztításával SCID egerekből nyertük. F (ab ') 2 fragmenseket ép Ab-ből készítettünk egy korábban közzétett (19) eljárással a következő módosításokkal: az Ab-t pepszinnel emésztettük 37 ° C-on négy órán keresztül. Az Fc-fragmenseket úgy távolítottuk el, hogy az Ab-t egy A-protein oszlopon vezettük át, amely lehetővé tette az F (ab') 2 áthaladását. Egész hörcsög IgG-t használtunk az F (ab ') 2 kontroll előállítására ugyanezzel a módszerrel. F (ab ′) 2 fragmenseket használtunk ezekhez a kísérletekhez, hogy elkerüljük a generalizált citokin felszabadulás potenciálisan zavaró hatásait, amelyek néha akkor tapasztalhatók, amikor a CD3-t intakt Ig keresztkötötte (19).

Egér Pneumocystis szervezetek előállítása

A nehéz P. carinii fertőzéssel rendelkező CB.17 scid/scid egereket eutanizálták, és tüdejüket aszeptikusan eltávolították. P. carinii organizmusokat izoláltunk a tüdőszövetből a korábban leírtak szerint (10, 20). A végső készítményt ammónia-ezüsttel festettük a ciszták felsorolása céljából, és a Diff-Quick-t (Dade AG, Dudingen, Svájc) a bakteriális szennyeződés szűrésére. Ezenkívül a készítményeket rendszeresen forgalomba hozták a kereskedelemben kapható csokoládé véragar lemezeken, hogy teszteljék a szennyező mikroorganizmusok jelenlétét.

Egerek kezelése F (ab ') 2 fragmensekkel a PcP-vel kapcsolatos IRIS egérmodelljében

Az egereket intranazális oltással fertőztük 1 × 105 P. P. carinii cisztákkal. Négy héttel később a fertőzött SCID egereket immun szingenikus donor törzsekből származó 5 × 107 splenocitákkal helyettesítettük az IRIS utánzására, ahogy azt korábban leírtuk (4, 8). Az anti-CD3 F (ab ′) 2 kezelést akkor kezdték meg, amikor az egerek egyértelműen tünetekkel jártak, amit vagy az átlagos testtömeg-veszteségként> 10% -ként, vagy az átlagos légzési gyakoriságként> 400-as légzés/perc alatt értünk. Így a kísérleti egereket testtömeg és légzési gyakoriság meghatározásával követtük, és az F (ab ′) 2 kezelést kb. 1 héttel megkezdtük az immunrekonstitúció után (7–9. Nap). A kísérleti egereknek vagy 150 μg 145 2C11 F (ab ′) 2 vagy kontroll F (ab ′) 2 ip minden másnap. Egy kísérletben egerek egy csoportja csak az 1. és a 3. napon kapott anti-CD3 F (ab ′) 2-t a trimetoprim-szulfametoxazol (TMP) mellett. A TMP-SMX (Sicor Pharmaceuticals, Irvine, CA) kezelést az anti-CD3 kezelés után 1 nappal kezdtük el egyszeri napi dózisban a kísérlet végéig. A TMP-SMX-et sóoldattal hígítottuk és 20 mg-ban adtuk be. TMP testtömeg-kilogrammonként, a leírtak szerint (21).

A tüdő dinamikus megfelelésének és rezisztenciájának fiziológiai értékelése egerekben

Bronchoalveoláris mosás és tüdőszövet előkészítése

Dinamikus megfelelőségi méréseket követően bronchoalveoláris mosást (BAL) és tüdőszövetmintákat nyertünk. A mellüreget műtéti úton kinyitották a tüdő és a légcső kiszabadítása érdekében, a bal tüdőlebenyt pedig sebészeti selyemmel biztonságosan lekötötték a hörgőnél, és steril ollóval eltávolították. A megmaradt tüdőlebenyeket óvatosan átmostuk négy, 1 ml-es 1 × HBSS-alikvot részekkel a légcső kanülén keresztül. A visszanyert öblítőfolyadékot (~ 3,5 ml/egér) 250 x g-vel 5 percig centrifugáltuk, hogy megkapjuk a sejtfrakciót. A sejteket új HBSS-ben szuszpendáltuk, felsoroltuk, üveglemezekre centrifugáltuk és Diff-Quick-rel festettük a differenciálszámláláshoz. Ezenkívül többparaméteres áramlási citometriás elemzést végeztünk BAL sejteken fluorokróm-konjugált Ab-val történő festést követően. Anti-CD4-fluoreszceint (RM4-4 klón) és anti-CD8a-peridinin-klorofill-a fehérjét (53-6,7 klón) a BD Biosciences-től (San Diego, Kalifornia) vásároltunk. BAL mintánként legalább 5000 eseményt elemeztek rutinszerűen egy FACSCalibur sejtválogatón (BD Biosciences).

A Pneumocystis terhelésének mérése valós idejű kvantitatív PCR-rel

statisztikai elemzések

Az egyes kísérleti csoportok esetében jelentett összes érték a mérés átlagának ± 1 SE-je. Az elemzést a Sigma-Stat 3.5 verziójával (Systat Software, Point Richmond, CA) végeztük. A különböző csoportokat egyirányú ANOVA elvégzésével hasonlítottuk össze. Azokban az esetekben, amikor az ANOVA szignifikáns volt, az egyes csoportokat páros t teszttel teszteltük. A túlélési elemzést Kaplan-Maier Log-rank teszttel végeztük. Ezenkívül az egyes csoportokat párokban hasonlítottuk össze Fisher pontos khi-négyzet tesztjével. Egy tesztet szignifikánsnak tekintettek a p-n. A táblázat megtekintése:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Az anti-CD3 kezelés hatása a tüdő működésére egerekben a PcP-hez kapcsolódó IRIS során. A tüdőfunkciót az egereken a 6. napon (a második kísérletben) vagy a 8. napon (az első kísérletben) hajtották végre az anti-CD3 kezelés megkezdése után. Az eredmények két független kísérlet adatait összesítik, és mindegyik adatpont a számtani átlag ± 1 SEM (n = 7–11 egér az összes csoport esetében). A, Dinamikus tüdő-megfelelőségi mérések (* p = 0,004). B, légúti ellenállásmérések (** p = 0,002).

Az anti-CD3 kezelés csökkenti a PcP-vel kapcsolatos pulmonális T-sejt-válaszokat

Az anti-CD3 F (ab ′) 2 -et kapó egereknél a pulmonális működés javulása a tüdő gyulladásos sejtjeinek csökkenésével járt (II. Táblázat). Ahogy az várható volt, az anti-CD3 F (ab ') 2 jelentős csökkenést produkált mind a CD8 +, mind a CD4 + T limfocitákban. Ezen túlmenően mind a makrofágok, mind a neutrofilek száma csökkent, ami a patológiás gyulladásos válasz általános downregulációjára utal.

Az anti-CD3 kezelés megzavarja a P. carinii gazdaszervezet által közvetített clearance-ét az immunrekonstruált SCID egerekben

Korlátozott postonset anti-CD3 kezelés javítja az egerek túlélését PcP-vel kapcsolatos IRIS-ben

A kísérleti egerek testtömegének változásai. A testtömeg százalékos csökkenését (a csúcstömeghez viszonyítva) a kísérleti egerek különböző csoportjainál a feloldást követő napokhoz viszonyítva ábrázoljuk. Minden adatpont aritmetikai átlagot ± SEM képvisel. A függőleges nyilak a csoport halálát jelzik aznap. A zárójelben szereplő számok a túlélő egerek számát jelentik a kísérleti csoport összes egérszámára vonatkoztatva. ● kontroll IgG F (ab ') 2; ○, kontroll IgG F (ab ') 2 + TMP-SMX; ▼, anti-CD3F (ab ') 2 (a kísérlet egész ideje alatt kezeljük) + TMP-SMX; △, anti-CD3F (ab ′) 2 (csak kétszer kezelve) + TMP-SMX.

Vita

A PcP egy fertőző betegség, amelynek jelentős morbiditása és mortalitása a gazda gyulladásos válaszának tulajdonítható, amint azt mind a betegek (11, 12), mind az állatmodellek (4, 5, 8) kimutatták. Kimutatták, hogy a T-sejtek jelenléte szükséges a P. carinii elleni gyulladásos immunválasz megindításához, ami viszont úgynevezett szembetűnő sérülést okoz a tüdőben. A legtöbb klinikai szcenárióban a betegekben hiányoznak a CD4 + T-sejtek, ezáltal túlnyomórészt CD8 + T-sejtek által vezérelt válasz marad, amely hatástalan a P. carinii elpusztításában, de kritikus tüdősérülést okoz (4, 5, 8). Más klinikai helyzetekben, például az IRIS-ben, a CD4 + T-sejtek is részt vesznek a gyulladásos válaszban. A CD8 + T sejtekkel ellentétben a CD4 + T sejtek által vezérelt immunválasz hozzájárul a P. carinii felszámolásához, bár ezek a válaszok még nagyobb tüdőkárosodást eredményezhetnek (4).

Korábban kimutattuk, hogy a PcP-vel kapcsolatos IRIS-hez kapcsolódó gyulladásos sérülés jelentősen megelőzhető a CD4 + és CD8 + T-sejtek kimerítésével az immunrekonstitúció előtt (4, 8). Bár egérmodellekben ez könnyen megvalósítható, az embereknél ennek elérésére szolgáló terápiás szerek jelenleg nem állnak rendelkezésre. Pan-T sejt Ab, OKT3 (Muromonab), klinikai alkalmazásra elérhető immunszuppresszív szerként, különösen a transzplantátum kilökődésének szabályozásában. Az OKT3 és hasonló Abs-ek a T-sejtek részleges kimerülését okozzák, és ami még fontosabb, a CD3 és a T-sejt-receptor kölcsönhatásának megszakításával, amely szükséges a T-sejt Ag felismeréséhez és aktiválásához (25). Mivel mind a CD4 +, mind a CD8 + T sejtek expresszálják a CD3-ot, úgy gondoltuk, hogy a CD3 ellen irányított Ab használata T-sejtek inaktiválását eredményezné, hasonlóan az egerek specifikus monoklonális Abs-jével megfigyeltekhez.

A PcP-vel rendelkező SCID egerek, amelyek immun-helyreállítása megtörtént, és anti-CD3 F (ab') 2 fragmensekkel kezelték, markáns fiziológiai előnyöket mutattak. Ezek a javulások statisztikailag szignifikánsak és klinikailag relevánsak. A kezelt egereknél csökkent a tüdőgyulladás, javult a dinamikus megfelelés, javult a tüdőrezisztencia és javult a túlélés. A pulmonalis öblítőfolyadékban megnövekedett neutrofil számok korrelálnak a PcP fokozott súlyosságával a betegek és az egerek modelljeiben (12, 26). Az anti-CD3 F (ab ′) 2 alkalmazása modellünkben a neutrofil szám szignifikáns csökkenését eredményezte a mosófolyadékban, ami kevésbé súlyos betegséggel társult. Érdekes módon a makrofágok száma is csökkent, bár ennek a megfigyelésnek a jelentősége a P. carinii által vezérelt gyulladásos válasz okozta sérülés szempontjából nem ismert.

Az e kísérletekben felvázolt megközelítés az immunszuppresszált beteg további immunszuppresszálására kontraproduktívnak tekinthető. Fontos azonban megjegyezni, hogy a pulmonalis gyulladásos reakció elnyomása az antibiotikumok beadásával együtt történne. Fontos, hogy a TMP-SMX csökkentette a P. carinii terhet, ha anti-CD3 F (ab ′) 2 fragmensekkel adták. Ezekhez a kísérletekhez anti-CD3 F (ab ′) 2-t adtak minden második nap a kísérletek befejezéséig. Ezt az ütemtervet azért választották, mert az OKT3-at tipikusan napi 5-10 napig adják be, amikor a transzplantátum kilökődésének kezelésére használják. Az OKT3 biológiai hatása azonban az infúzió után néhány percen belül kimutatható (25). Ez a gyors hatásindulás lehet az oka annak, hogy az anti-CD3 kezelés hatékony volt a már tüneti egerekben. Továbbá, amint azt a 4. ábrán leírt kísérlet bemutatta, lehetséges lehet kevesebb anti-CD3 dózis felhasználása a gyulladás elnyomására, miközben a TMP-SMX életbe lép. Az OKT3 rövid távú alkalmazása csökkentené mellékhatásait és lerövidítené a gyógyszer által kiváltott immunszuppresszió időtartamát.

Bár az OKT3-szerű Ab alkalmazását választottuk, eredményeink azt sugallják, hogy a T-sejtek működését megzavaró egyéb terápiák hatékony kiegészítő terápiak lehetnek a PcP számára. Például az IL-2a receptor monoklonális Ab-je (CD25; Basiliximab; Novartis Pharmaceuticals, Basel, Svájc) szintén hatékony lehet ebben a környezetben. A T-sejtek globális szuppressziója mellett lehetséges lehet olyan specifikus molekuláris utak azonosítása és gátlása, amelyek tüdőkárosodáshoz vezetnek a PcP során.

Összefoglalva, a PcP patogenezise magában foglal egy immun által közvetített gyulladásos választ, amely kompromittált tüdőfunkciót okoz. A T-sejtek, különösen a CD8 + T-sejtek, kritikus elemei ennek a gyulladásos válasznak. Megmutattuk, hogy a T-sejtek inaktiválása Ab-val a CD3-molekula ellen irányítva jelentős fiziológiai hasznot eredményez a tüneti PcP-vel rendelkező egerek számára. Rövid távon ez a javulás azokban az egerekben is megfigyelhető, amelyeket nem antibiotikumokkal kezeltek a P. carinii elpusztításához, ami alátámasztja azt a következtetést, hogy a PcP alatti tüdőkárosodás immun-közvetített jelenség. Az anti-CD3 alkalmazásának klinikai haszna kiegészítő kezelésként PcP-ben szenvedő betegeknél klinikai vizsgálatokat igényel. Eredményeink támogatják ezt a megközelítést.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Margaret Chovaniecnek, Nabilah Khannak és Jane Malone-nak a technikai támogatást. Köszönjük Dr. Jing Wang-nak, hogy kritikusan olvasta a kéziratot.

Közzétételek A szerzőknek nincsenek pénzügyi összeférhetetlenségeik.

Lábjegyzetek

Ezt a munkát az 1R01HL092797 Nemzeti Egészségügyi Intézet támogatta.

A cikkben használt rövidítések: BAL bronchoalveoláris mosás IRIS immun restitúciós gyulladásos szindróma PcP Pneumocystis carinii tüdőgyulladás TMP-SMX trimetoprim-szulfametoxazol.